chúng tôi chƣa hoàn toàn tối ƣu và cần đƣợc cải tiến thêm. Mặt khác, protease HIV-1 trong nghiên cứu của chúng tôi là từ HIV-1 phân nhóm CRF01_AE còn trong nghiên cứu của Richard và tập thể (1990) là của phân nhóm B. Theo Bandaranayake và tập thể (2008) hiệu quả xúc tác của protease phân nhóm CRF01_AE thấp hơn so với phân nhóm B.
3.3.4. Ảnh hƣởng của các hợp chất khác nhau lên hoạt đô ̣ của protease HIV -1 tái tổ hợp tái tổ hợp
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của 10 hợp chất khác nhau bao gồm pepstatin A, indinavir, axit asiatic, curcumin, catechin, epicatechin, -mangostin, -mangostin, 8-hydroxyquinoline, menadione và hai loại muối kim loại là Na-fluorua (NaF) và Zn-sunfate (ZnSO4) lên hoạt độ của protease HIV-1 tái tổ hợp.
Hoạt độ của protease HIV-1 đƣợc đánh giá qua khả năng thủy phân cơ chất tổng hợp và cơ chất huỳnh quang mang trình tự cắt đặc hiệu của enzyme. Các chất ảnh hƣởng cần khảo sát đƣợc ủ trƣớc với protease HIV-1 trong 5 phút, sau đó mới bổ sung cơ chất để bắt đầu phản ứng và đo hoạt độ còn lại để so sánh với trƣờng hợp không có chất ảnh hƣởng.
Kết quả xác định hoạt độ protease còn lại khi có mặt của các chất khác nhau cho thấy NaF và ZnSO4 là không ảnh hƣởng đến hoạt đ ộ của protease thậm chí ở nồng độ lên tới 2 mM. Các chất còn lại đều ức chế hoạt độ của protease HIV-1. Cụ thể, pepstatin A đã ức chế protease HIV-1 với nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzyme (IC50) là 0,4 μM. Indinavir là chất ức chế rất mạnh của protease HIV-1 với nồng độ 50% và 100% hoạt độ enzyme tƣơng ứng là 0,006 μM và 0,1 μM. Axit asiatic, curcumin, catechin, epicatechin, -mangostin, -mangostin, 8-hydroxyquinoline và menadione đều ức chế protease HIV-1 tái tổ hợp với giá trị IC50 lần lƣợt tƣơng ứng là 18,9 µM; 48,32 µM; 510 µM; 960 µM; 16,82 µM; 16,25 µM; 104 µM; 114,26 µM (hình 3.29).
Hình 3.29. Ảnh hƣởng của các hợp chất khác nhau lên hoạt độ thủy phân cơ chất của protease HIV-1 tái tổ hợp. A: Pepstatin A, B: Indinavir, C:
Axit asiatic, D: Curcumin, E: Catechin, F: Epicatechin, G: - D D I H A B G J K L D C E F
Mangostin, H: -Mangostin, I: 8-Hydroxyquinoline, J: Menadione, K: NaF, L: ZnS04
Pepstatin A đƣợc xem là chất ức chế các protease họ aspartyl. Nghiên cứu của các tác giả khác cũng đã cho thấy pepstatin A ức chế hoạt độ của protese HIV-1 (Seelmeier và tập thể , 1988; Darke và tập thể , 1989; Leuthardt và Roesel , 1993). Tuy nhiên, nồng độ ức chế của pepstatin A với protease HIV-1 không giống nhau và phụ thuộc vào loại cơ chất, phƣơng pháp lựa chọn cho nghiên cứu ảnh hƣởng. Seelmeier và tập thể (1988) khi nghiên cứu ảnh hƣởng của pepstatin A sử dụng cơ chất tái tổ hợp gag p55 cho thấy pepstatin A ức chế hoạt độ protease HIV-1 với IC50 khá cao là 250 μM. Leuthard và Roesel (1993) khi sử dụng cơ chất tổng hợp cho thấy pepstatin A ức chế một phần hoạt độ protease HIV-1 tại nồng độ 1 μM và ức chế hoàn toàn protease HIV-1 với nồng độ lớn hơn 10 μM.
Indinavir là một trong các chất ức chế protease HIV-1 đƣợc tổng hợp dựa trên các thành tựu nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Nhóm hydroxyl trong cấu trúc của indinavir tạo liên kết hydro với Asp25 trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1 làm mất hoạt tính của enzyme (Wlodawer và Vondrasek, 1998). Tại các nghiên cứu tiến hành nuôi cấy tế bào nhiễm virus trong môi trƣờng có indinavir, indinavir ức chế hoạt động của protease HIV-1 với IC50 là 0,027 μM và IC99 là 0,169 μM (Merrill và tâ ̣p thể , 1997). Trong nghiên cứu của chúng tôi, indinavir ức chế vớ i IC50 và IC100 ở các nồng độ 0,006 μM và 0,1 μM, thấp hơn đáng kể so với nghiên cứu của Merrill và tâ ̣p thể (1997).
Axit asiatic đƣợc chiết xuất chủ yếu từ cây rau má là loại thực vật chỉ có ở các nƣớc Đông Nam Á nên axit asiatic còn đƣợc gọi là axit Châu Á. Gần đây, các nghiên cứu cho thấy, axit asiatic có tác dụng gây độc đối với một loạt các dòng tế bào ung thƣ khác nhau nhƣ ung thƣ tử cung, u tủy (Hsu và tâ ̣p thể , 2005); hay tác dụng chống viêm trong điều trị loét dạ dày (Guo và tâ ̣p thể , 2004 ). Đặc biệt, Ramanathan và tập thể (2007) cho thấy axit asiatic có thể đi qua hàng rào máu não
và làm giảm viêm và chống phù nề, qua đó họ cho rằng axit asiatic là vô cùng hứa hẹn cho bệnh nhân ung thƣ não. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên axit asiatic đƣợc phát hiện là chất ức chế của protease HIV-1.
Curcumin là hợp chất tự nhiên không độc đƣợc tinh chế từ củ nghệ vàng, đƣợc xem là một trong các hợp chất thực vật thứ sinh có nhiều tiềm năng nhất trong điều trị bệnh ở ngƣời. Các nghiên cứu trên động vật và in vivo cho thấy curcumin có nhiều tiềm năng trong điều trị một loạt các bệnh khác nhau: điều trị ung thƣ, chống viêm khớp, chống thiếu máu cục bộ (Shukla và tập thể, 2008)và chống viêm do ức chế eicosanoid sinh tổng hợp (Srivastava và tâ ̣p thể , 1995). Đặc biệt, trong điều trị ung thƣ, curcumin kích thích việc chết theo chƣơng trình đối với tế bào ung thƣ mà không có tác dụng gây độc các tế bào khỏe mạnh. Curcumin có thể gây trở ngại cho hoạt động của các yếu tố phiên mã NF-κB có vai trò gây ung thƣ (Aggarwal và Shishodia, 2004). Cơ chế tác dụng phân tử của curcumin trong phần lớn các trƣờng hợp đã đƣợc nghiên cứu và làm sáng tỏ. Curcumin còn đƣợc biết đến ức chế hoạt độ của protease HIV-1 với IC50 là 100 μM; dạng phức hợp của curcumin tổng hợp khác cho giá trị IC50 thấp hơn dƣới 6 μM (Sui và tâ ̣p thể , 1993). Khi tác dụng với protease HIV-1, curcumin sẽ gắn với trung tâm hoạt động, tƣơng tác với Asp25, Asp29, Asp30, Gly27’, Asp29’ và Asp 30’dẫn đến làm mất hoa ̣t tính của protease (Vajraguptaa và tâ ̣p thể, 2005).
Catechin và epicatechin là các hợp chất phenol thuộc nhóm flavonoid có nhiều trong trà xanh (chiếm khoảng 30% khối lƣợng khô của trà xanh). Các hợp chất polyphenol của trà xanh trong đó có catechin đƣợc biết đến với các tác dụng bảo vệ DNA tránh khỏi những tác động phá hủy của các gốc oxi hóa tự do, ức chế sự tăng nhanh của các tế bào ung thƣ, bảo vệ cơ thể chống lại sự phá hủy của tia cực tím vùng B (Lambert và tập thể, 2003); có tác dụng oxi hóa chất béo giúp giảm cân với ngƣời béo phì, kết hợp với các chất tự do chống lão hóa (Maki và tập thể, 2009). Yu và tập thể (2007) phát hiện thấy catechin và epicatechin ức chế protease HIV-1 với IC ở nồng độ trên 100 μM, tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi.
Mangostin là dẫn xuất của xanthone, đƣợc tìm thấy trong dịch chiết quả măng cụt. Y học cổ truyền dùng măng cụt để điều trị nhiễm trùng da, vết thƣơng và tiêu chảy. Mangostin đƣợc biết đến với nhiều tác dụng trong chống viêm, kiểm soát sản xuất COX-2 (cyclo-oxygenase-2 enzyme) đƣợc tìm thấy là một yếu tố quan trọng trong việc giảm viêm và đau (Nakatani và tâ ̣p thể , 2004); ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của cyclins, cdc2 và P27, cảm ứng việc chết theo chƣơng trình dẫn đến ức chế, gây độc dòng tế bào DLD-1 gây ung thƣ đại trực tràng; các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra mangostin có tác dụng kháng histamin trong điều trị dị ứng, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus… (Akao và tập thể , 2008). Nghiên cứu của Chen và tập thể (1996) cũng cho thấy ảnh hƣởng ức chế của dịch chiết quả măng cụt lên protease HIV-1; kết quả tinh sạch, phân tích cấu trúc và hoạt tính cho thấy α- mangostin và -mangostin trong dịch chiết đã ức chế hoạt độ protease HIV-1 theo cơ chế không cạnh tranh với IC50 tƣơng ứng là 5,12 0,41 μM và 4,810,32 μM, thấp hơn 3-4 lần nồng độ mà chúng tôi phát hiện đƣợc đối với α-mangostin và - mangostin.
8-hydroxyquinoline hay còn đƣợc gọi là benzene-1,4-diol là hợp chất hữu cơ dẫn xuất của benzen (O'Loughlin và tâ ̣p thể, 2006). Trong nghiên cứu của Nguyễn và tập thể (2003), 8-hydroxyquinoline có tác dụng ức chế sinh axit cũng nhƣ gây chết đối với vi khuẩn Streptococcus mutans UA-159.
Menadione hay còn gọi là vitamin K-3 đƣợc dùng nhƣ một chất bổ sung dinh dƣỡng. Menadione kết hợp với vitamin C đang đƣợc nghiên cứu nhƣ một phƣơng pháp tiềm năng cho điều trị ung thƣ tiền liệt tuyến (Jamison và tâ ̣p thể , 2001). Tuy vậy, cho đến nay, chƣa có nghiên cứu nào đề cập về tác dụng ức chế protease HIV-1 của 8-hydroxyquinoline và menadione.
ZnSO4 đƣợc biết là chất ức chế sinh trƣởng một số vi khuẩn nhƣ S. rattus và
S. salivarus (Phan và tập thể, 2004). Zn2+ cũng đã đƣợc chứng minh là làm giảm khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn do ức chế hoạt tính của một số enzyme đặc biệt
là F-ATPase, phosphotransferase, urease (Phan và tập thể, 2004). Nghiên cứu của Sabbioni và tập thể (1999) đã tìm hiểu ảnh hƣởng của Zn2+ cùng với 43 ion kim loại khác lên hoạt độ của reverse transcriptase của HIV-1 và cho thấy Zn2+ ức chế reverse transriptase HIV-1 với IC50 là 53,7 μM. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, ZnSO4 đến 2 mM không ảnh hƣởng đến hoạt độ thủy phân cơ chất của protease HIV-1.
Fluor có tác dụng ức chế khả năng sinh axit của vi khuẩn nên đƣợc dùng phổ biến trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng và đƣợc biết đến nhƣ chất ức chế một số enzyme nhƣ F-ATPase, enolase, NADH oxidase (Sutton và tập thể , 1987) và catalase (Phan và tập thể, 2001). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi thì NaF ở nồng độ tới 2 mM không có ảnh hƣởng đến hoạt độ của protease HIV-1.
Nhìn chung lại có thể thấy rằng, tác dụng ức chế của một số hợp chất lên protease HIV-1 tái tổ hợp mà chúng tôi thu nhận đƣợc là tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu trƣớc đây. Tuy nhiên, giá trị IC50 của một số chất có khác giá trị IC50 mà chúng tôi phát hiện đƣợc. Điều này có thể cho phép nghĩ đến sự khác nhau giữa protease HIV-1 mà chúng tôi thu đƣợc từ chủng HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE; trong khi đó, protease HIV-1 mà các tác giả sử dụng là thuộc phân nhóm khác. Đây có thể là những dẫn liệu cần quan tâm khi sử dụng các PI trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV với các phân nhóm khác nhau.
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc còn cho thấy rằng đây là công trình đầu tiên phát hiện thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 của axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione.
KẾT LUẬN
1. Đã nhân bản, nhân dòng và xác định trình tự 8 đoạn gen mã hóa protease HIV-1 (297 bp) tách đƣợc từ một số bệnh nhân Việt Nam khác nhau và phát hiện đƣợc 19 đột biến thay thế nucleotide, trong đó có 10 đột biến dẫn đến sự thay thế axit amin (G16E, E35D, M36I, R41K, H69K, V82I, L89M, I13V, I15V, N83T). Các trình tự này đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gen thế giới.
2. Đã thiết kế và biểu hiện thành công protease HIV-1 trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) RIL sử dụng vector pET32a dƣới dạng protein dung hợp gắn với thioredoxin và 7 axit amin của protein gag-pol (GTVSFNF) tại đầu N và epitope của hemagglutinin cùng 6xHis tại đầu C. Đã xây dựng đƣợc quy trình đơn giản để tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp với 2 bƣớc: i) rửa tủa tế bào trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có NaCl 100 mM, urea 1M và Triton X-100 1%; ii) sắc ký qua cột mono Q-sepharose và cột His-bind mắc nối tiếp, rửa chiết enzyme gắn với gel His- bind bằng đệm có chứa imidazol 250 mM.
3. Protease HIV-1 tái tổ hợp có hoạt tính cắt cơ chất peptide tổng hợp đặc hiệu với Km = 61,3 µM, Vmax = 0,0275 µM/giây, Kcat = 2,86 s-1 và hoạt động tối thích tại pH 4,5 ở 37oC; mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác khi bị xử lý nhiệt ở 70oC trong thời gian 10 phút. Lần đầu tiên trong nghiên cứu này đã phát hiện thấy protease HIV-1 tái tổ hợp bị ức chế bởi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione với nồng độ ức chế 50% hoạt độ tƣơng ứng là 18,9 µM, 104 µM và 114,26 µM.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục điều tra các đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa cho protease HIV-1 để có một bức tranh đầy đủ hơn về mức độ kháng loại thuốc này ở Việt Nam.
2. Hoàn thiện việc phục hồi hoạt tính xúc tác của protease HIV-1 tái tổ hợp và sử dụng protease thu đƣợc làm enzyme đích trong sàng lọc, thiết kế các chất ức chế mới, hiệu quả cao, làm cơ sở cho việc ứng dụng chúng trong điều trị HIV/AIDS.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Phan T.N., Khuat T.N., Nguyen T.H.L., Nguyen T.V.A., Khong T.M.H., Trinh Q.M., Vu P.L., Do Q.C., Trieu M.C. (2008), “Multiplex RT-PCR assay for detection of co-infection of HBV, HCV and HIV in blood samples”, VNU J. Sci. 24(2S), pp. 337-383.
2. Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị
Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng và bƣớc đầu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(2), tr. 227-233.
3. Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền,
Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV Type -1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 27(4), tr. 239-244.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu Tiếng Việt
1. Phan Trọng Hoàng, Ngô Văn Trƣờng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2007), “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tiểu đơn vị p66 của enzyme phiên mã ngƣợc của virus HIV-1”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5, tr. 463-470. 2. Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Phan Tuấn Nghĩa, Robert E. Marquis (2003), “Ảnh
hƣởng của 8-hydroxyquinolin lên các quá trình sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Streptococcus mutans UA-159”, Tạp chí Dược học 43, tr. 11-13.
3. Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng và biểu hiện gen p24 từ chủng HIV lƣu hành ở Việt Nam và nghiên cứu phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết hanh bệnh nhân”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6, tr. 27-34.
4. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Lê Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “Biểu hiện protein GP41 của virus HIV phân type CRF01_AE trong E. coli ứng dụng để phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và ELISA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 9, tr. 29-36.
5. Abecasisa A.B., Deforchea K., Snoecka J., Bachelerb L.T., McKennac P., Carvalhod A.P., Gomesd P., Camachod R.J. and Vandammea A.M. (2005), "Protease mutation M89I/V is linked to therapy failure in patients infected with the HIV-1 non-B subtypes C, F or G", AIDS 19, pp. 1799-1806.
6. Aggarwal B.B., Shishodia S. (2004), "Suppression of the nuclear factor-kappaB activation pathway by spice-derived phytochemicals: reasoning for seasoning",
Ann. N. Y. Acad. Sci. 1030, pp. 434–441.
7. Akao Y., Nakagawa Y., Iinuma M., Nozawa Y. (2008), "Anti-cancer effects of xanthones from pericarps of mangosteen", Int. J. Mol. Sci. 9, pp. 355-370.
8. Alastair J.J., Wood M.D., (1998), "HIV-Protease inhibitors", N. Engl. J. Med.
338, pp. 1281-1292.
9. Anson B.D., Weaver J.G., Ackerman M.J., Akinsete O., Henry K., January C.T., Badley A.D. (2005), "Blockade of HERG channels by HIV protease inhibitors",
Lancet 365, pp. 682-686.
10. Ariyoshi K., Matsuda M., Miura H., Tateishi S., Yamada K., Sugiura W. (2003), "Patterns of point mutations associated with antiretroviral drug treatment failure in CRF01_AE (subtype E) infection differ from subtype B infection", JAIDS 33, pp. 336-342.
11. Bandaranayake R.M., Jeyabalan M.P, Kakizawa J., Sugiura W., and Schiffer C.A. (2008), "Structural analysis of HIV-1 CRF01_AE protease in complex with the substrate p1-p6 ", J. Virol. 82, pp. 6762-6766.
12. Baum E.Z., Bebernitz G.A. and Gluzman Y. (1990), "Isolation of mutants of human immunodeficiency virus protease based on the toxicity of the enzyme in
Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, pp. 5573-5577.