Tách chiết RNA của virus theo kit Qiagen

Một phần của tài liệu Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam (Trang 44)

RNA của HIV-1 đƣợc tách và tinh sạch từ các mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HIV-1 theo kit QIAamp Ultrasen virus của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèm theo: AR, AB, AW1, AW2, AVE. Quy trình thực hiện nhƣ sau:

Huyết thanh (400 µl) đã đƣợc tách sẵn từ máu tổng số đƣợc chuyển sang ống eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC, 0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) đƣợc bổ sung nhằm tăng khả năng gắn RNA virus, hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã đƣợc làm nóng tới 600C, 16 µl proteinase K đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần 5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc ủ tiếp ở 400C trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5 phút 1 lần. 240 µl đệm AB đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đƣa vào cột QIAamp Spin và đƣợc ly tâm ở 7.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Có thể lặp lại bƣớc này nhiều hơn 1 lần để RNA gắn với cột đƣợc nhiều nhất. Cột sau đó đƣợc chuyển sang ống eppendorf mới và đƣợc rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA. Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C đến khi sử dụng.

Một phần của tài liệu Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam (Trang 44)