Phản ứng gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector
Các sản phẩm của phản ứng PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pCR2.1 theo kit của Invitrogen hoặc pGEM-T theo kit của Promega. Điều này có thể thực hiện đƣợc là do khả năng gắn thêm một gốc adenosine monophosphate (A) ở đầu 3’ của sản phẩm nhờ hoạt tính terminal transferase không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn của enzyme Taq DNA polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng đầu T (pCR2.1 hoặc pGEM-T) đƣợc thiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’. Nhƣ vậy, sản phẩm của phản ứng PCR có thể đƣợc gắn chính xác vào vector nhân dòng. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau: 2 l sản phẩm PCR, 1 l đệm T4 DNA ligase 10X, 1 l T4 DNA ligase, 1 l vector đầu T, 5 l ddH2O. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 2-3 giờ hoặc 4 oC qua đêm và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 hoặc BL21 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút. 300-500 l môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37o
C trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong 50 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.3.7. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Nguyên tắc: xác định trình tự dựa theo phƣơng pháp kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide (ddNTP) theo nguyên tắc của Sanger và tập thể (1977). Khi các ddNTP đƣợc gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại (do các nucleotide này chỉ chứa 3’–H thay cho 3’–OH). Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều đoạn sợi đơn mới đƣợc
đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các đoạn này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc.
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol) đƣợc dùng làm khuôn cho PCR trong xác định trình tự. Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi, H2O vô trùng vừa đủ 20 l. Về cơ bản, phản ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là thêm sự có mặt của các ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). PCR đƣợc thực hiện nhƣ sau: 96oC trong 1 phút để khởi động nóng tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 3 bƣớc: 96oC trong 30 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 30 giây để gắn mồi, 60o
C trong 4 phút để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó đƣợc ủ tiếp ở 60oC trong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khi phân tích.
Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục xử lý trƣớc khi đƣa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bƣớc sau:
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution) đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi dùng bao gồm: 20 l K-acetate 3 M pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM pH 8; 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng đƣợc bổ sung vào mỗi ống sản phẩm phản ứng PCR 20 l. Sau đó hỗn hợp đƣợc trộn đều.
- 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn kỹ. Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4o
C. Dịch nổi đƣợc hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa đƣợc rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở -20oC và đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc hút bỏ cẩn thận bằng pipet, thu kết tủa và đƣợc để khô ở nhiệt độ phòng. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại bằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter .
2.3.8. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trong E. coli
Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
Vector nhân dòng (pCR2.1 hoặc pGEM T) tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 đƣợc xử lý với cặp enzyme giới hạn có trình tự cắt đã thiết kế thêm trên các cặp mồi để thu đƣợc đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và cũng để tạo đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời, vector biểu hiện cũng đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzyme giới hạn với vector nhân dòng để tạo đầu dính tƣơng thích. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bao gồm: 6 l đệm II 10X, 30 l vector, 2 l enzyme giới hạn, bổ sung dd H2O cho đủ 60 l.
Hỗn hợp phản ứng sau khi đƣợc hòa tan theo đúng tỉ lệ sẽ đƣợc ủ ở 37oC qua đêm, tạo sản phẩm cắt hoàn toàn.
Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn bằng kit thôi gel của Bioneer
Sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và đoạn vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc tinh sạch (bằng kit thôi gel của Bioneer) nhằm loại bỏ các thành phần enzyme thừa và tăng nồng độ, chuẩn bị cho phản ứng gắn. Theo quy trình này trƣớc tiên, sản phẩm cắt enzyme giới hạn cần đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó, bản gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng UV và vị trí băng DNA khoảng 300 bp của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện dạng mạch hở với kích thƣớc phù hợp đƣợc cắt ra và cho vào trong ống eppendorf 1,5 ml. 5 lần thể tích đệm GB (Gel Binding Buffer) đƣợc bổ sung vào 1 thể tích đoạn gel đã cắt. Hỗn hợp đệm và gel sau đó đƣợc đun ở 60oC trong khoảng 10-15 phút để gel tan hết. Sau khi gel tan hoàn toàn, hỗn hợp phản ứng đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, 40C. Phần dịch dƣới cột đƣợc đổ bỏ. Cột đƣợc rửa 2 lần bằng 500 l đệm rửa WB (Wash Buffer). Sau đó, DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30- 60 l đệm EL (Elute Buffer). Cột đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. DNA trong dịch ly tâm đƣợc thu nhận và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
Sau khi tinh sạch, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện đƣợc gắn với nhau nhờ enzyme nối T4 DNA ligase theo tỷ lệ đoạn gen và vector là 3:1, tổng thể tích phản ứng gắn 10-20 l. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch đƣợc sàng lọc bằng PCR trực tiếp, sau đó khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc lựa chọn để tách plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (tƣơng tự nhƣ đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.6).
Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli BL21 và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào
Tế bào E. coli BL21 có chứa vector biểu hiện tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc nuôi cấy khởi động trong 4 ml môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicilin 50 µg/ml và chloramphenicol 34 g/ml trong 14-16 giờ. Môi trƣờng nuôi cấy sau đó đƣợc trẻ hóa trong 100 ml LB lỏng bằng cách bổ sung thêm 30-50 lần thể tích LB và tiếp tục đƣợc nuôi cấy tới khi A600 đạt 0,7-0,8, IPTG đƣợc bổ sung đạt nồng độ cuối cùng 0,1-0,25 mM để cảm ứng sinh tổng hợp protein đích. Sau 3 giờ nuôi cấy, tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch ở 6.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC và sinh khối tế bào đƣợc hòa lại trong 3 ml đệm A (Tris HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM, imidazol 5 mM). Tế bào đƣợc phá vỡ bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 30 giây. Dịch siêu âm đƣợc ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 4oC để thu protein tổng số trong dịch chiết tế bào. Phần tủa tế bào sau đó đƣợc hòa tan bằng 3 ml đệm A có urea 8 M, không có PMSF và đƣợc lắc trong 30 – 60 phút để hòa tan hoàn toàn các protein trong phân đoạn tủa.
Đối với các thí nghiệm chỉ thu protein trong phân đoạn tủa mà không thu protein trong dịch chiết tế bào, các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Sau khi dừng nuôi cấy và ly tâm thu tế bào, tế bào đƣợc hòa lại trong 3 ml đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,9; phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 10 giây; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi, thu tủa tế bào. 3 ml đệm B (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, Triton X-100 1%) đƣợc bổ sung vào để hòa tan tế bào, tiếp tục phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 10 giây; sau siêu âm lắc rửa tế bào 30 – 60 phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc này nhằm loại
bỏ bớt các protein không mong muốn của tế bào và đƣợc lặp lại 2 lần, lần thứ 3 rửa bằng H2O cất hai lần để loại bỏ hết Triton X-100. Cuối cùng tủa tế bào đƣợc hòa tan trong 3 ml đệm C (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, urea 8M, imidazol 5 mM); lắc trong vòng 30 – 60 phút để hòa tan hoàn toàn protein.
2.3.9. Sắc ký protein qua cột ái lực Ni-agarose hoặc His-bind
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký này dựa trên liên kết đƣợc tạo ra giữa những protein có chứa trình tự 6-8 gốc histidine (His-tag) với ion Ni2+ trong thành phần gel Nickel-agarose hoặc gel His-bind. Khi cho qua cột, các protein mang đuôi His-tag này sẽ đƣợc gel giữ lại do có khả năng tạo phức với Ni2+. Sau đó, các protein gắn với gel đƣợc rửa chiết ra bằng các dung dịch Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 hoặc bằng dung dịch Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có urea 8M trong điều kiện biến tính với nồng độ imidazol khác nhau (nhờ khả năng cạnh tranh liên kết với gốc Ni2+ của các phân tử imidazol).
Protease HIV-1 tái tổ hợp đƣợc biểu hiện bằng hệ thống vector pET có gắn đuôi His-tag ở đầu N hoặc C nên có thể tinh sạch đƣợc bằng cột sắc ký ái lực Nickel-agarose hoặc His-bind.
Gel Nickel-agarose hoặc gel His-bind đƣợc nhồi vào cột (kích thƣớc 3x1 cm) để có thể tích cột gel 2,5 - 3 ml. Đối với gel His-bind phải có thêm bƣớc tích ion Ni2+ (dƣới dạng muối NiCl2) bằng cách cho 5 lần thể cộtgel NiCl2 50 mM chảy qua với tốc độ 15-20 ml/giờ. Cột gel đƣợc cân bằng với đệm A bằng cách cho 5 lần thể tích cột gel của đệm gắn cột chảy qua với tốc độ 20-30 ml/giờ.
Protease HIV-1 đƣợc tinh sạch trong hai điều kiện không biến tính nhằm tinh sạch protease HIV-1 trong dịch chiết tế bào và điều kiện biến tính nhằm tinh sạch protease HIV-1 trong phân đoạn tủa tế bào. Sự khác nhau là trong điều kiện biến tính tất cả các đệm cân bằng, rửa cột và chiết protein đều phải có urea 8M.
Phân đoạn protease HIV-1 sau tinh sạch trong điều kiện biến tính đƣợc pha loãng về nồng độ khoảng 0,01 - 0,1 mg/ml và cho thẩm tích đổi đệm D (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 50 mM, DTT 1 mM, -mecaptoethanol (-ME) 1 mM, glycerol 5% với nồng độ urea giảm dần từ 8 M đến 0 M. Sau khi thẩm tích, mẫu đƣợc cô bằng centricon 3 kDa, tốc độ ly tâm 6.000 vòng/phút, ở 4oC đến khi hàm
lƣợng protein đạt từ 0,1 đến 1 mg/ml; chế phẩm đƣợc bảo quản ở -80oC cho đến khi dùng.
2.3.10. Kiểm tra độ tinh sạch của protein bằng điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
Độ tinh sạch cũng nhƣ KLPT của protease HIV-1 qua các bƣớc tinh sạch đƣợc xác định bằng điện di protein trên gel polyacryamide có chứa SDS (SDS- PAGE) theo phƣơng pháp của Laemmli (1970).
Gel polyacryamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 15% và lớp gel cô 4%, với tỉ lệ thành phần đƣợc nêu ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE
Thành phần Gel tách 15% Gel cô 4% Dung dịch acrylamide 30% 1,95 ml 0,16 ml 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 0,94 ml 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 0,31 ml Nƣớc cất 0,94 ml 0,76 ml APS 10% 30 µl 20 µl TEMED 7 µl 5 µl
Mẫu protein sau khi trộn với đệm mẫu (nồng độ 4x) theo tỷ lệ thể tích 3:1 đƣợc xử lý nhiệt ở 95oC trong 5 phút và làm lạnh ngay trên đá. Mẫu đƣợc tra vào giếng. Điện di trong đệm Tris-glycine pH 8,8 chứa SDS 1% với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Bản gel điện di đƣợc nhuộm với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: axetic: nƣớc với tỉ lệ thể tích là 3:6:1 khoảng 20 phút. Tiến hành tẩy gel bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
2.3.11. Kiểm tra sự có mặt của protease HIV -1 bằng thẩm tá ch miễn di ̣ch (Western blotting) (Western blotting)
Nguyên tắc: dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa protease (kháng nguyên) và kháng thể đơn dòng kháng protease HIV (thƣơng mại) làm kháng thể sơ cấp, phức hợp protease HIV-1 và kháng thể tƣơng ứng này sau đó lại đƣợc nhận ra bởi kháng
thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm (AP), và cuối cùng phức hợp protease HIV-1 và kháng thể sơ cấp - kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ với dung dịch cơ chất, enzyme gắn trên kháng thể thứ cấp biến đổi cơ chất NBT và BCIP không màu thành sản phẩm có màu dễ dàng nhận ra bằng mắt thƣờng.
Các bước tiến hành: Protein (chứa protease HIV-1) sau khi đƣợc tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, đƣợc chuyển lên màng PVDF (Polyvinylidene fluoride) bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có 10% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein đƣợc giữ nguyên. Màng đƣợc cố định bằng dung dịch BSA 3% trong đệm PBS pH 7,4 qua đêm ở 4oC hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng, BSA thừa đƣợc rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Màng sau đó đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp trong nghiên cứu này là kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC. Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp trên chuột có gắn phosphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Các băng protein đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloride và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM và NaCl 0,1 M. Phản ứng đƣợc