Những nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, cấu hình và chức năng của các protease HIV-1 là cơ sở tạo ra các PI đầu tiên vào những năm đầu thập kỷ 90. Thiết kế chất ức chế dựa trên nghiên cứu cấu trúc là ứng dụng lớn nhất của protease giúp kéo dài cuộc sống của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những chất ức chế này đã đƣợc cải biến bằng nhiều cách để chúng ăn khớp chính xác vào vị trí hoạt động của protease HIV-1 (King và tập thể, 2000).
Saquinavir là chất ức chế protease HIV-1 đầu tiên đƣợc thiết kế bởi Cục Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ (FDA). Cơ sở của thiết kế dựa trên kiến thức về chức năng của protease HIV-1 không giống nhƣ các protease khác là có thể cắt các trình tự liên kết giữa Tyr-Pro hoặc Phe-Pro trên chuỗi polypeptide tiền thân của virus. Bởi vì liên kết amide của gốc Pro không dễ bị cắt bởi các endopeptidase của động vật có vú, thiết kế chất ức chế protease dựa trên tiêu chuẩn này sẽ tạo ra các chất có ái lực và đặc hiệu cao. Cùng với saquinavir, indinavir, nelfinavir và ritonavir đều đƣợc thiết kế dựa trên chức năng nhận biết trình tự axit amin này. Phần lớn các chất đều có liên kết tƣơng tự của trình tự Phe-Pro tại vị trí 167 và 168 trên gag-pol (Wlodawer và Vondrasek, 1998; King và tâ ̣p thể, 2000).
Các chất ức chế protease có thể phân chia thành hai nhóm lớn: i) các chất ức chế dựa trên peptide và ii) các chất ức chế không phải peptide (Wlodawer và Vondrasek, 1998). Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang liên kết cắt đặc hiệu của protease HIV-1 (saquinavir, indinavir…). Chúng đƣợc thiết kế giống với dạng
trạng thái trung gian chuyển tiếp tứ diện đƣợc hình thành trong quá trình protease xúc tác. Cấu hình này giúp cho chất ức chế gắn chặt vào trung tâm hoạt động của protease (hình 1.10).
Hình 1.10. Cơ chế thủy phân của protease HIV-1 (Wlodawer và Vondrasek, 1998)
Một dạng chất ức chế khác thuộc nhóm này dựa trên peptide là các chất không giống với cơ chất tự nhiên của protease mà tận dụng cấu trúc đối xứng đặc hiệu trong trung tâm hoạt động của protease (nhƣ ritonavir) làm tăng cƣờng mức độ ổn định của phức hợp protease và chất ức chế. Phần lớn các chất ức chế dựa trên peptide đều mô phỏng liên kết cơ chất để tạo liên kết hydro với protease. Một loạt các liên kết hydro đƣợc hình thành giữa Ile50 và Ile50’ tại phần đầu của vùng mũ và chất ức chế. Ngoài ra, chất ức chế còn tạo liên kết hydro với Asp25. Trong khi đó, nhóm chất ức chế không dựa trên peptide lại gắn với phân tử H2O trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1 làm cho protease không gắn đƣợc với polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình. Tuy nhiên, chƣa có chất ức chế nào trong nhóm này đƣợc sử dụng trong thực tế.
Dựa trên cấu trúc và các nghiên cứu kháng thuốc của protease HIV-1 thuộc phân nhóm B, hiện nay các nhà khoa học đang tìm hiểu và so sánh sự khác biệt về kiểu gen và con đƣờng kháng thuốc với các phân nhóm khác không phải nhóm B nhằm tối ƣu hóa điều trị cho các bệnh nhân nhiễm HIV-1 kháng thuốc nhóm này (Ariyoshi và tâ ̣p thể, 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008).
Protease
Cơ chất Trạng thái trung gian chuyển tiếp tứ diện
amin axit
Chất ức chế giống trạng thái chuyển tiếp không thể phá vỡ
Tóm lại, các nghiên cứu về các đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease HIV-1, tạo chế phẩm protease HIV-1 tái tổ là cơ sở để tìm ra những chất ức chế mới, hiệu quả để điều trị HIV/AIDS.
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu máu
Huyết thanh 50 bệnh nhân nhiễm HIV-1 (20 bệnh nhân chƣa điều trị ART và 30 bệnh nhân đang điều trị bằng PI) đƣợc lấy ở dạng đã bất hoạt virus, bảo quản ở - 80oC từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng (Phụ lục 1). Tất cả mẫu máu đã đƣợc bệnh viện khẳng định có HIV-1 bằng kit thƣơng mại dựa trên nguyên tắc tƣơng tác kháng nguyên - kháng thể.
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3); E. coli BL21 (DE3) RIL đƣợc mua từ hãng Novagen.
Các vector: pET28a, pET32a và pET43a của Novagen (Mỹ) (sơ đồ các vector đƣợc ghi ở phụ lục 4), các oligonucleotide, kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pCR2.1 TA cloning của Invitrogen (Mỹ); kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pGEM TA easy, T4 DNA ligase của Promega (Mỹ); thang chuẩn protein nhuộm sẵn, thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP, mồi ngẫu nhiên của hãng Fermentas; Taq DNA polymerase, reverse transcriptase của Enzynomics (Hàn Quốc); kit tinh sạch RNA từ virus và kit tinh sạch plasmid của Qiagen (Mỹ); kit thôi gel của Bioneer (Hàn Quốc); cơ chất peptide L6525 (Lys-Ala-Arg-Val- Leu*Nph-Glu-Ala-Met) của Sigmaaldrich (Mỹ); kit xác định hoạt độ protease dùng cơ chất huỳnh quang (SensoLyteTM
490 HIV-1 Protease Assay Kit) và protease HIV-1 của Anaspec (Mỹ); kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 của Gentex (Mỹ).
Gel Ni-agarose của Invitrogen (Mỹ), His-bind của Novagen (Mỹ), pepstatin A-agarose của Sigmaaldrich (Mỹ), anti-His taq-sepharose của Abcam (Mỹ); mono Q-sepharose, SP-sepharose, DE-52, protein A-sepharose và protein G-sepharose đƣợc mua từ hãng GE (Mỹ)…
Các hóa chất còn lại khác đều đƣợc mua từ các hãng nổi tiếng và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: tủ ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Satorius), máy ly tâm Sigma 30K, máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), máy PCR gradient Mastercycler EP gradient S (Eppendorf), hệ thống giải trình tự CEQ 8000 (Beckman coulter), máy quang phổ khả biến DU 800 (Beckman coulter) và phổ kế huỳnh quang (Spectrofluometer) FL3 – 22 (Jobin Yvon – Mỹ), các thiết bị chạy cột sắc ký (Pharmacia), thiết bị điện di ngang, điện di đứng, thẩm tách miễn dịch (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tách chiết RNA của virus theo kit Qiagen
RNA của HIV-1 đƣợc tách và tinh sạch từ các mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HIV-1 theo kit QIAamp Ultrasen virus của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèm theo: AR, AB, AW1, AW2, AVE. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Huyết thanh (400 µl) đã đƣợc tách sẵn từ máu tổng số đƣợc chuyển sang ống eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC, 0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) đƣợc bổ sung nhằm tăng khả năng gắn RNA virus, hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi. Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã đƣợc làm nóng tới 600C, 16 µl proteinase K đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần 5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc ủ tiếp ở 400C trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5 phút 1 lần. 240 µl đệm AB đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đƣa vào cột QIAamp Spin và đƣợc ly tâm ở 7.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Có thể lặp lại bƣớc này nhiều hơn 1 lần để RNA gắn với cột đƣợc nhiều nhất. Cột sau đó đƣợc chuyển sang ống eppendorf mới và đƣợc rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE đƣợc bổ sung, hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA. Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C đến khi sử dụng.
2.3.2. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid
Trong nghiên cứu này, DNA plasmid đƣợc tinh sạch theo kit Qiaprep- miniprep của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèm theo: N3, PB, PE, EB. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Một khuẩn lạc (E. coli) đƣợc cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 50 g/ml và đƣợc nuôi lắc qua đêm ở 37oC khoảng 200 vòng/phút 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Sau đó, tế bào đƣợc hoà trở lại trong 250 l đệm P1 có chứa RNase A 10 mg/ml, trộn đều bằng vortex. Tiếp đó 250 l đệm P2 đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ 4- 6 lần và đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 350 l đệm N3 đã đƣợc làm lạnh, đảo nhẹ 4-6 lần, đặt trên đá 5 phút. Dịch nổi đƣợc thu lại bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút và đƣợc chuyển lên cột Qiagen đã cung cấp sn trong kit, tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua. Cột Qiagen đƣợc rửa 2 lần, lần thứ nhất bằng 500 l đệm PB, ly tâm 13.000 vòng/phút/1 phút loại bỏ dịch chảy qua; lần thứ 2 bằng 750 l đệm PE và tiếp tục ly tâm để loại bỏ dịch chảy qua. Để loại bỏ hoàn toàn thành phần ethanol có trong đệm PE, cột đƣợc ly tâm thêm 1 lần nữa ở 13.000 vòng/phút/1 phút. DNA trên cột sau đó đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 100 l đệm EB (Tris-HCl 10 mM pH 8,5) hoặc nƣớc cất khử ion khử trùng vào giữa cột và để cột đứng trong 1 phút, tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút/1 phút thu dịch. Để thu đƣợc DNA nhiều nhất có thể chiết cột hai lần, mỗi lần bằng 50 l đệm EB với các bƣớc tiến hành tƣơng tự.
DNA plasmid sau tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các axit nucleic ở bƣớc sóng 260nm (A260). A260 =1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng DNA là 50 μg/ml và tƣơng đƣơng với hàm lƣợng RNA là 40 μg/ml. DNA plasmid đƣợc cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
2.3.3. Định lƣợng protein
Protein trong tế bào cũng nhƣ trong các phân đoạn tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bƣớc sóng 280nm (A280) và bằng phƣơng pháp của Bradford (1976).
2.3.3.1. Định lượng protein bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 280
Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 280 nm (A280) của các protein. Tại bƣớc sóng này các axit amin có nhân thơm của protein có độ hấp thụ cực đại. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 280 nm của các mẫu, sử dụng protein albumin huyết thanh bò (BSA) làm chuẩn với hệ số A280 = 0,66 tƣơng đƣơng với 1 mg/ml để tính ra lƣợng protein có trong mẫu.
Dung dịch protein sau khi đƣợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau trong đệm mẫu tƣơng ứng và đƣợc giá trị A280 bằng quang phố kế.
2.3.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Nguyên tắc: Phƣơng pháp Bradford xác định hàm lƣợng protein dựa vào liên kết giữa coomassie brilliant blue G-250 (CBB) với protein (Bradford, 1976) tạo nên phức chất màu xanh có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở 595 nm. Cƣờng độ màu phản ánh hàm lƣợng protein trong dung dịch.
Cách tiến hành: 800 l dung dịch mẫu có chứa từ 2-10 g protein đƣợc cho vào ống nghiệm, sau đó 200 l dung dịch thuốc thử Bradford đƣợc bổ sung và lắc đều. A595 đƣợc đo sau 3 phút nhƣng trƣớc một giờ, từ kết quả giá trị A595 đo đƣợc, so với đƣờng chuẩn (sử dụng albumin huyết thanh bò có hàm lƣợng đã biết) đƣợc dựng theo cách tƣơng tự để tính ra hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu.
2.3.4. Tổng hợp cDNA tƣ̀ RNA
RNA của HIV-1 đƣợc chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse transcriptase của Hãng Enzynomics.
cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình: 10 l RNA của HIV-1 và 1 l mồi ngẫu nhiên (0,2 g) đƣợc biến tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 l dNTPs 2 mM, 3,5 l H2O, 0,5 µl chất ức chế ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 90 phút, phản ứng
đƣợc kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDNA sau đó đƣợc bảo quản ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.5. Nhân bả n đoa ̣n gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuâ ̣t PCR
Đoa ̣n gen mã hóa protease HIV -1 đƣợc nhân lên bằng kỹ thuật PCR lồng. Hai cặp mồi khác nhau cho hai vòng phản ứng PCR đƣợc sử dụng để nhân bản gen mã hóa protease bằng PCR, trong đó cặp mồi ngoài (Lech và tâ ̣p thể, 1996) khuyếch đại đoạn gen có kích thƣớc khoảng 800 bp và bao trùm trình tự quan tâm. Cặp mồi trong đƣợc thiết kế dựa trên trình tự khá bảo thủ ở hai đầu tận cùng đoạn gen mã hóa protease (vùng đầu cùng N và vùng tận cùng C), để nhân lên chính xác đoạn gen có kích thƣớc khoảng 297 bp (Leuthardt và Roesel, 1993). Ngoài ra để thuận lợi cho việc biểu hiện protease, trình tự chứa vị trí cắt giới hạn của 2 enzyme NdeI và
EcoRI đã đƣợc thiết kế ở hai đầu tƣơng ứng của mồi xuôi thứ hai Fw2 và mồi ngƣợc thứ hai Rv2. Theo tính toán, với trình tự cặp mồi thiết kế nhƣ trên, đoạn gen có kích thƣớc 320 bp sẽ đƣợc nhân lên bằng PCR lồng. Trình tự của các cặp mồi nhƣ sau:
Cặp mồi ngoài (cặp mồi 1):
- HIV-F1: 5’-ATGCTGCAGAGAGGCAATTT-3’ - HIV-R1: 5’-GGCAAATACTCGAGTATTGT-3
Cặp mồi trong (cặp mồi 2): (Vị trí cắt giới hạn thể hiện bằng chữ thƣờng, gạch chân) - HIV-F2: 5’-GGGCcatatgCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’(NdeI)
- HIV-R2: 5’-GAGCTgaattcTTAAAAATTTAAAGTGCAGCCAATC-3’ (EcoRI) Thành phần của phản ứng PCR lồng bao gồm: 2,5 l đệm Taq DNA polymerase 10X; 0,5 l Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ l); 2,5 l dNTPs 2mM; 1 l HIV-F1(HIV-F2) 10 pmol; 1 l HIV-R1(HIV-R2) 10 pmol; 11 l dd H2O và 1,5 l cDNA khuôn. Chu trình nhiệt cho PCR lồng đối với vòng 1 là:
1,5 l sản phẩm PCR vòng 1 sau đó đƣợc làm khuôn cho PCR vòng 2 với thành phần và chu trình nhiệt tƣơng tự nhƣ vòng 1 chỉ thay cặp mồi ngoài bằng cặp mồi trong và gắn mồi ở 53o
C trong 30 giây. 35 chu kỳ
94oC-40 giây 45oC-60 giây 72oC-30 giây
Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.3.6. Nhân dòng trực tiếp đoa ̣n gen mã hóa protease HIV-1 vào vector
Phản ứng gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector
Các sản phẩm của phản ứng PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pCR2.1 theo kit của Invitrogen hoặc pGEM-T theo kit của Promega. Điều này có thể thực hiện đƣợc là do khả năng gắn thêm một gốc adenosine monophosphate (A) ở đầu 3’ của sản phẩm nhờ hoạt tính terminal transferase không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn của enzyme Taq DNA polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng đầu T (pCR2.1 hoặc pGEM-T) đƣợc thiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’. Nhƣ vậy, sản phẩm của phản ứng PCR có thể đƣợc gắn chính xác vào vector nhân dòng. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm vào vector đầu T trên tổng thể tích 10 l nhƣ sau: 2 l sản phẩm PCR, 1 l đệm T4 DNA ligase 10X, 1 l T4 DNA ligase, 1 l vector đầu T, 5 l ddH2O. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 2-3 giờ hoặc 4 oC qua đêm và giữ ở -20oC cho đến khi biến nạp.
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 hoặc BL21 (bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút. 300-500 l môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37o
C trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong 50 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB đặc có 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100