Để tìm pH hoạt động tối thích của protease HIV-1 tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 trong một số đệm với pH khác nhau (đệm Na-acetate pH 4-5,5; đệm MES pH 5,5-6,5 và đệm MOPS pH 6,5- 8), tất cả các đệm đều có EDTA 4 mM; -ME 5 mM; NaCl 0,9 M và CaCl2 1 mM.
Kết quả thu đƣợc ở hình 3.27 cho thấy, protease HIV-1 tái tổ hợp có hoạt độ cắt cơ chất tổng hợp cao trong vùng pH axit (pH 4 – 6) và hoạt độ cao nhất tại pH 4,5. Tại vùng pH trung tính và kiềm, hoạt độ cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 giảm dần; tại pH 8, protease HIV-1 hoàn toàn không thể hiện khả năng phân cắt cơ chất. Tóm lại, pH tối thích của protease HIV-1 tái tổ hợp là tại pH 4,5. Đệm Na-acetate 100 mM, pH 4,5 có EDTA 4 mM, -ME 5 mM, NaCl 0,9 M đƣợc dùng trong các phản ứng cắt cơ chất tiếp theo của protease HIV-1.
Hình 3.27. pH hoạt động tối thích của protease HIV-1 tái tổ hợp
Nghiên cứu của Darke và tập thể (1989) cũng cho thấy hoạt độ cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 tái tổ hợp cao nhất trong vùng pH thấp (pH 4,0-6,5) và
đạt cực đại tại pH 5,5. Nghiên cứu của Leuthardt và Roesel (1993) cho kết quả tƣơng tự, protease HIV-1 có hoạt độ cao nhất trong vùng pH 4,5-6.
Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, rất giống với các protease aspartyl khác nhƣ pepsin và rhizopuspepsin ở nhiều đặc trƣng xúc tác khác nhau (Ido và tập thể , 1991): vai trò của gốc Asp trong trung tâm hoạt động giống nhau trong hầu hết các protease aspartyl; protease HIV-1 cũng bị ức chế bởi pepstatin A- chất ức chế đặc hiệu của các protease aspartyl (Seelmeier và tập thể, 1988; Darke và tâ ̣p thể, 1989); nghiên cứu cấu trúc tinh thể của các protease HIV-1 cho thấy trung tâm hoạt động cùng chứa bộ ba bảo thủ Asp-Thr-Gly; sự cuộn gập ở vùng lõi , cơ chế thủy phân cơ chất tổng hợp và gắn chất ức chế của protease HIV-1 cũng giống với các protease aspartyl khác. Mặc dầu, có nhiều điểm giống nhau quan trọng nhƣ vậy nhƣng protease HIV-1 và các protease aspartyl khác của sinh vật nhân chuẩn lại có đặc tính xúc tác khác nhau; protease HIV-1 hoạt động tối thích trong vùng pH 4- 6 (Darke và tập thể , 1989; Leuthardt và Roesel, 1993); trong khi phần lớn các protease aspartyl khác của sinh vật nhân chuẩn lại hoạt động tối thích trong vùng pH 2-4. Một trong các lý do có thể giải thích cho sự khác biệt này là do sự khác nhau trong hình thành liên kết hydro ở trung tâm hoạt động. Cấu trúc tinh thể cho thấy, ở vị trí axit min 28 sau trình tự trung tâm hoạt động của protease HIV-1 luôn là Ala, trong khi ở pepsin lại là Ser hoặc Thr. Trong trung tâm hoạt động của các protease aspartyl, nhóm cacboxyl của Asp hình thành liên kết hydro với NH2- của Thr26; bên cạnh đó ở pepsin còn có 1 liên kết hydro khác hình thành giữa Asp với NH- của Ser28, liên kết này không có ở proteaes HIV-1. Có thể do sự vắng mặt của liên kết hydro với Ser28 mà hoạt động của protease HIV-1 cần môi trƣờng ít tính axit hơn so với pepsin. Nếu thay thế Ser28 bằng Ala trong pepsin, pH tối thích của enzyme sẽ cao hơn (Ido và tập thể, 1991).