Đoa ̣n gen mã hóa protease HIV -1 đƣợc nhân lên bằng kỹ thuật PCR lồng. Hai cặp mồi khác nhau cho hai vòng phản ứng PCR đƣợc sử dụng để nhân bản gen mã hóa protease bằng PCR, trong đó cặp mồi ngoài (Lech và tâ ̣p thể, 1996) khuyếch đại đoạn gen có kích thƣớc khoảng 800 bp và bao trùm trình tự quan tâm. Cặp mồi trong đƣợc thiết kế dựa trên trình tự khá bảo thủ ở hai đầu tận cùng đoạn gen mã hóa protease (vùng đầu cùng N và vùng tận cùng C), để nhân lên chính xác đoạn gen có kích thƣớc khoảng 297 bp (Leuthardt và Roesel, 1993). Ngoài ra để thuận lợi cho việc biểu hiện protease, trình tự chứa vị trí cắt giới hạn của 2 enzyme NdeI và
EcoRI đã đƣợc thiết kế ở hai đầu tƣơng ứng của mồi xuôi thứ hai Fw2 và mồi ngƣợc thứ hai Rv2. Theo tính toán, với trình tự cặp mồi thiết kế nhƣ trên, đoạn gen có kích thƣớc 320 bp sẽ đƣợc nhân lên bằng PCR lồng. Trình tự của các cặp mồi nhƣ sau:
Cặp mồi ngoài (cặp mồi 1):
- HIV-F1: 5’-ATGCTGCAGAGAGGCAATTT-3’ - HIV-R1: 5’-GGCAAATACTCGAGTATTGT-3
Cặp mồi trong (cặp mồi 2): (Vị trí cắt giới hạn thể hiện bằng chữ thƣờng, gạch chân) - HIV-F2: 5’-GGGCcatatgCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’(NdeI)
- HIV-R2: 5’-GAGCTgaattcTTAAAAATTTAAAGTGCAGCCAATC-3’ (EcoRI) Thành phần của phản ứng PCR lồng bao gồm: 2,5 l đệm Taq DNA polymerase 10X; 0,5 l Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ l); 2,5 l dNTPs 2mM; 1 l HIV-F1(HIV-F2) 10 pmol; 1 l HIV-R1(HIV-R2) 10 pmol; 11 l dd H2O và 1,5 l cDNA khuôn. Chu trình nhiệt cho PCR lồng đối với vòng 1 là:
1,5 l sản phẩm PCR vòng 1 sau đó đƣợc làm khuôn cho PCR vòng 2 với thành phần và chu trình nhiệt tƣơng tự nhƣ vòng 1 chỉ thay cặp mồi ngoài bằng cặp mồi trong và gắn mồi ở 53o
C trong 30 giây. 35 chu kỳ
94oC-40 giây 45oC-60 giây 72oC-30 giây
Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.