Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1

Do kháng nguyên HIV-1 biến đổi liên tục dẫn đến thất bại trong sản xuất vaccine nên bệnh nhân nhiễm HIV-1 muốn duy trì cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là dùng thuốc. Protease có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của

Hình 1.7. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag và gag-pol

HIV-1 nên đƣợc xem là một trong các đích quan trọng nhất trong liệu pháp điều chế thuốc ức chế protease chống HIV-1. Để phát hiện và tổng hợp các thuốc ức chế hiệu quả thì thu nhận một lƣợng lớn protease HIV-1 là rất cần thiết. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không thể tách chiết trực tiếp protease từ HIV-1 vì lƣợng này quá nhỏ, cũng không thể sử dụng các protease tƣơng tự khác làm mô hình vì protease HIV-1 cắt cơ chất rất đặc hiệu. Chính vì vậy, thiết lập hệ thống biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp có vai trò quan trọng trong tìm và phát triển các thuốc ức chế protease chống HIV/AIDS. Ngay từ khi HIV đƣợc phát hiện cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 tái tổ hợp bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli hoặc trên nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin. Tuy nhiên, quá trình sản xuất protease HIV-1 phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn trong việc biểu hiện và tinh sạch.

Năm 1989, Darke và tập thể đã sử dụng promoter trp của vector pPRT để biểu hiện protease HIV-1 trong E. coli. Protease sau khi đƣợc tinh sạch qua hệ thống 3 cột sắc ký là DEAE-sephadex A-25, phosphocellulose và mono S, có KLPT (của monomer) khoảng 11 kDa, bao gồm 99 axit amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng nhƣ phân cắt cơ chất tổng hợp. Kết quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính của protease thu đƣợc bị ức chế bởi pepstatin A và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn, protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu. Tuy nhiên, protease HIV-1 biểu hiện thấp, chỉ chiếm 0,02% protein tổng số của tế bào, với hiệu suất thu hồi 7% ở bƣớc tinh sạch cuối cùng và băng protease chỉ phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch với kháng thể đặc hiệu.

Danley và tập thể (1989) cũng sử dụng promoter trp nhƣng trên vector pHIVexpo15, bổ sung tryptophan vào sau pha log trong nuôi cấy tế bào cùng với sử dụng môi trƣờng M9 đã giúp tăng biểu hiện protease HIV-1 lên mức 0,1% protein tổng số của tế bào với hiệu suất thu hồi protease HIV-1 tái tổ hợp sau bƣớc tinh sạch cuối cùng là 30%. Tuy nhiên, quy trình tinh sạch protease HIV-1 khá phức tạp

bao gồm các bƣớc sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose, S-sepharose Fast Flow, superose 12 và mono S cùng với các bƣớc thẩm tách và đổi đệm giữa các cột.

Năm 1990, Cheng và tập thể đã sử dụng tế bào E. coli JM105 đồng nhiễm với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 dƣới promoter T7 ở hệ thống vector pET3AM. Protease HIV-1 thu đƣợc chủ yếu ở trong phân đoạn tủa tế bào, sau đó đƣợc hòa tan bằng urea 8 M, tinh sạch, hồi tính để thu đƣợc dạng hoạt động và thử hoạt tính với cơ chất tổng hợp. Kết quả, protease HIV-1 đƣợc tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ 1 lít môi trƣờng nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450 nmol/phút/mg protein, một bƣớc tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800 nmol/phút/mg. Khi so sánh với protease HIV-1 thu đƣợc từ các điều kiện không biến tính cho thấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ đƣợc hồi tính hiệu quả. Tuy nhiên, khi biểu hiện trên hệ thống bắt buộc phải nhiễm phage  mang T7 RNA polymerase vào tế bào vi khuẩn. Sự có mặt của phage có thể không thích hợp cho các quá trình lên men để sản xuất lớn (Taylor và tâ ̣p thể, 1992).

Năm 1992, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli. Theo nhóm tác giả này, trình tự gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện proteae HIV-1. Nếu dùng thể nhân dòng cDNA, lƣợng protease HIV-1 biểu hiện thƣờng thấp và chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch. Vấn đề có thể đƣợc giải quyết bằng cách tổng hợp gen mã hóa protease với các codon mà E. coli ƣa thích và giàu A+T. Kết quả sử dụng trình tự gen giàu A+T đã giúp các tác giả tăng mức độ biểu hiện protease lên 50-100 lần. Biểu hiện bằng các promoter lacUV5 sẽ giảm tính độc và tăng mức độ biểu hiện protease HIV-1 hơn so với promoter recA. Biểu hiện protease dung hợp với các protein khác qua trình tự tự cắt dẫn tới tạo ra protease HIV-1 có hoạt tính với Pro mở đầu. Với những cải tiến đó, lƣợng protease sau biểu hiện có thể tăng lên và chiếm từ 8-10% protein tổng số của tế bào. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, protease HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp khác ở vi khuẩn E. coli.

Leuthardt và Roesel (1993) đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E. coli. Với hệ thống biểu hiện này, protease đƣợc gắn thêm 3 gốc histidine (3xHis) ở đầu N và đầu C để

thuận tiện cho quá trình tinh sạch. Nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện thu đƣợc ở phân đoạn tủa của tế bào vi khuẩn (pellet) và đƣợc hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6 M. Sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-agarose, protease tái tổ hợp đƣợc hồi tính và có hoạt tính cắt cơ chất gag p55 của HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống nhƣ protease tự nhiên. Protease tái tổ hợp bị ức chế hoàn toàn bởi pepstatin A ở nồng độ 11 M.

Năm 2000, Rozzelle và tập thể đã biểu hiện các protease HIV-1 kiểu dại (WT protease HIV-1 – không bị đột biến) và ở dạng đột biến trong E. coli bằng cách sử dụng vector pTacTac. Protease HIV-1 đƣợc dung hợp với protein CheY tại đầu N giúp tăng cƣờng tốc độ phiên mã nhờ ái lực cao của gen mã hóa CheY với các ribosome. Để hiệu quả dịch mã cao, một liên kết bicistron đƣợc nối giữa protein CheY và protease HIV-1. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự liên kết giữa monomer protease HIV-1 bình thƣờng với monomer đột biến tạo thành heterodimer protease HIV-1 không có hoạt tính. Tƣơng tác dimer tạo cấu trúc heterodimer bền nhiệt hơn, ít gây độc tế bào hơn nhƣng kém tan hơn so với dạng homodimer. Hiểu rõ cơ chế hoạt động của chất ức chế với sự hình thành heterodimer là cơ sở để phát triển các chất ức chế liên quan đến tƣơng tác hình thành dimer hóa giúp cản trở sự xuất hiện các chủng kháng thuốc hơn so với các PI hiện đang sử dụng.

Năm 2007, Chen và tập thể đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài tế bào (E. coli cell-free system của hãng Roche) để biểu hiện trực tiếp protease HIV-1 trong điều kiện in vitro. Để nhân bản DNA cho biểu hiện protein in vitro, hai phản ứng PCR đã đƣợc tiến hành. Phản ứng PCR thứ nhất nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu. Trong phản ứng PCR thứ hai, His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệ thống tế bào nhân sơ dựa trên T7 polymerase (promoter T7, vị trí liên kết ribosome vi khuẩn - RBS, terminator T7, mã mở đầu, mã kết thúc) đƣợc bổ sung vào. Sản phẩm PCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bƣớc tinh sạch nào. Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện di protein cho thấy thu nhận đƣợc protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là biểu hiện đƣợc những protein khó tan, gây độc với tế bào khi biểu hiện ở vi khuẩn (protein màng, protein ở ngƣời, protein có đặc tính kháng sinh…), không

phải tiêu tốn thời gian cho các bƣớc nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch. Tuy nhiên, thể tích phản ứng nhỏ nên lƣợng protease HIV-1 thu nhận đƣợc sau khi kết thúc quy trình không cao, chƣa đến 100 μg protein. Mặt khác, nghiên cứu chƣa kiểm tra hoạt tính của protease HIV-1 thu nhận đƣợc.

Nhiều nhóm nghiên cứu đã thông báo biểu hiện đƣợc protease HIV-1 ở E. coli

bằng cách thiết kế các vector khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các số liệu đều cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào vi khuẩn (Danley và tâ ̣p thể, 1989; Baum và tâ ̣p thể , 1990; Cheng và tâ ̣p thể , 2006). Một trong các lý do đƣợc dự đoán là protease HIV-1 có thể đã thủy phân các protein chức năng của tế bào (Danley và tập thể, 1989). Phỏng đoán này đặt ra một thách thức cho nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn. Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện khác nhau nhƣ sử dụng các promoter trp, λPL, T7, araBAD và tac

(Darke và tâ ̣p thể , 1989; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Komai và tâ ̣p thể , 1997). Nghiên cứu biểu hiện protease dƣới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tính tan của protease nhƣ -galactosidase, dihydrofolate reductase, -lactamase, maltose hoặc gắn với phân tử IgG (Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Louis và tâ ̣p thể , 1994; Dergousova và tâ ̣p thể, 1996).

Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: i) protease gây độc với tế bào chủ, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi) (Debouck và tâ ̣p thể, 1987; Cheng và tâ ̣p thể 1990; Tomasselli và tâ ̣p thể, 1990; Leuthardt và Roesel, 1993); ii) hàm lƣợng thu đƣợc chƣa cao, một số nghiên cứu chỉ có thể phát hiện bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Rangwala và tập thể , 1992); iii) phần lớn các nghiên cứu cũng cho thấy, protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi ở dạng dimer; đều biểu hiện protease ở dạng tự cắt khỏi trình tự cắt đặc hiệu thƣờng là giữa Phe/Tyr – Pro để giải phóng protease HIV-1 mở đầu bằng axit amin Pro (Debouck và tập thể, 1987; Graves và tập thể, 1988; Darke và tâ ̣p thể, 1989; Taylor và tâ ̣p thể, 1992; Mildner và tập thể , 1994). Chính vì vậy, một số nghiên cứu đã đƣa plasmid pLysS hoặc pLysE vào tế bào E. coli để hạn chế tính độc và dung hợp protease với các protein khác nhằm làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho

tinh sạch nhƣng vẫn đảm bảo hoạt tính (Louis và tâ ̣p thể , 1991; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Dergousova và tâ ̣p thể, 1996).

Từ năm 1995 trở lại đây, các nghiên cứu tập trung biểu hiện protease HIV-1 tái tổ hợp mang những đột biến đặc hiệu nhằm làm sáng tỏ cơ chế đột biến kháng thuốc, ái lực của protease đột biến với cơ chất, phân tích cấu trúc tinh thể của các dạng protease và trong phức hợp với các chất ức chế nhằm làm cơ sở tìm ra các chất PI mới có hiệu lực cao (Rozzelle và tâ ̣p thể , 2000; Ohtaka và tâ ̣p thể , 2003; Yanchunas và tâ ̣p thể , 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể , 2008). Năm 2008, Bandaranayake đã biểu hiện và tinh sạch chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp từ phân nhóm CRF01_AE cho nghiên cứu cấu trúc tinh thể của protease trong phức hợp với cơ chất và so sánh với cấu trúc protease HIV-1 phân nhóm B bằng cách sử dụng quy trình của Rose và tập thể (1993). Theo quy trình này, protease HIV-1 đƣợc biểu hiện từ vector pSOD/PR179, sau 3 bƣớc tinh sạch (qua các hệ thống cột DEAE- sepharose, S-sepharose và pepstatin–agarose) đã thu đƣợc 5 mg protease HIV-1 từ 10 g tế bào E. coli. Tuy vậy, kết quả kiểm tra độ sạch trên SDS-PAGE, ngoài protease HIV-1 vẫn còn lẫn 1 băng protein tạp nhiễm kích thƣớc 14 kDa.

Ở Việt Nam, protease là một trong số những enzyme đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên cứu một số tính chất trên đối tƣợng vi sinh vật. Các nghiên cứu về protease HIV-1 thƣờng tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở ngƣời Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan đến tính kháng thuốc (Nguyen và tâ ̣p thể , 2003; Ishizaki và tâ ̣p thể, 2009; Liao và tâ ̣p thể, 2009; Phan và tập thể, 2010).

Ngoài ra , liên quan đến các nghiên cƣ́u về protein của HIV có thể kể đến công trình của Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện đƣợc gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E. coli để dùng cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm retrovirus. Tuy vâ ̣y, các tác giả chƣa thu nhận đƣợc enzyme tái tổ hợp ở d ạng tinh sa ̣ch. Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Nhƣ Quỳnh và tập thể (2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41, GP120 và P24 của HIV

ở E. coli và bƣớc đầu ứng dụng chúng trong phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật phân tích miễn dịch.

Tóm lại, mặc dầu đã có khá nhiều công trình nghiên cứu khác nhau ở trong nƣớc về gen và protein của HIV, nhƣng cho đến nay chƣa có công trình nào công bố về biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất của protease từ HIV-1 gây nhiễm trên các bệnh nhân ở Việt Nam.

1.2.6. Các đột biến kháng thuốc ức chế protease HIV-1

Sự ra đời của các thuốc ức chế protease và thuốc ức chế reverse transcriptase không phải nucleoside vào năm 1995 đã bắt đầu kỷ nguyên trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao, tạo ra những tiến bộ vƣợt bậc về giảm tỷ lệ nhiễm và tử vong do HIV cũng nhƣ giảm rõ rệt các nhiễm trùng cơ hội và khối u. Tuy nhiên, việc sử dụng ART trong thời gian dài với nồng độ cao dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại trong điều trị. Nếu kháng với nhiều nhóm thuốc thì các phác đồ thay thế là rất hạn chế và tác dụng của thuốc chỉ duy trì đƣợc trong thời gian ngắn. Sự xuất hiện nhanh chóng các chủng kháng thuốc còn do tốc độ sinh sản nhanh của HIV–1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của reverse transcriptase (1/10.000 base). Điều này dẫn đến tốc độ đột biến rất cao của HIV và HIV luôn tạo ra những chủng mới, thậm chí cả khi không điều trị. Khi có ART, các chủng mang đột biến kháng đƣợc chọn lọc và trở thành chủng ƣu thế (Hoffmann và tập thể, 2007).

Các phương pháp xét nghiệm kháng thuốc

Có hai phƣơng pháp xét nghiệm kháng thuốc hiện đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng đó là: xét nghiệm kháng thuốc kiểu gen và xét nghiệm kháng thuốc kiểu hình (Wilson, 2003).

Xét nghiệm kháng thuốc kiểu gen dựa trên phân tích các đột biến liên quan tới kháng thuốc bằng cách giải trình tự gen của virus sau khi đã đƣợc nhân bản hoặc bằng các kỹ thuật lai đặc hiệu với các oligonucleotide kiểu dại hoặc kiểu kháng thuốc.

Ngƣời ta chú ý nhất đến vùng pol mã hóa cho các enzyme của virus (protease, reverse transcriptase và integrase) và vùng env (mã hóa cho glycoprotein

vỏ với 2 tiểu phần gp41 và gp120). Các xét nghiệm kiểu gen chỉ phát hiện các chủng đột biến chiếm ít nhất 20-30% tổng số virus trong cơ thể và chỉ là một phép đo kháng thuốc gián tiếp. Các đột biến gây giảm ái lực với các chất ức chế enzyme đã đƣợc mô tả rất rõ cho đa số các thuốc kháng HIV, nhƣng do có nhiều loại hình đột biến khác nhau, có thể có các đột biến bù trừ, nên việc đánh giá mức độ kháng thuốc đối với 1 thuốc nhất định là khó.

Xét nghiệm kháng thuốc kiểu hình là cách trực tiếp đo mức độ nhạy cảm với