MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic Acid Bacteria) là nhóm vi khuẩn có lợi được sử dụng phổ biến trên thế giới. Bên cạnh được sử dụng làm giống khởi động trong các sản phẩm lên men lactic, chúng còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, exopolysaccharide (EPS)… hay được dùng để sản xuất các chế phẩm probiotic. Những polysaccharide (PS) được sử dụng trong thực phẩm và y dược thường có các tính chất cơ lý tốt cho các ứng dụng như: kéo sợi, màng, keo, chất làm đặc, tạo gel tác nhân truyền dẫn thuốc… Nguồn cung cho các PS này hiện nay chủ yếu từ thực vật như tinh bột, agar, galactomannan, pectin, carageenan và aginate. Nhờ vào cấu trúc mạch dài, các PS này có thể đáp ứng được những yêu cầu trên. Tuy nhiên, để hoàn thiện các tính chất lưu biến này, hầu như các hợp chất PS có nguồn gốc thực vật khi đưa vào sử dụng đều phải được xử lý bằng phương pháp enzyme và phương pháp hóa học. Vì vậy, khả năng ứng dụng của chúng vẫn có một số hạn chế nhất định. Trong lúc đó, việc khai thác các hợp chất PS từ vi sinh vật có nhiều tính ưu việt hơn so với từ thực vật như chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ điều khiển quá trình sản xuất. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại các PS như PS nội bào, PS tạo cấu trúc cho thành tế bào (lipopolysacchride, peptidoglycan..) và EPS (PS ngoại bào). Hơn nữa, nếu được tổng hợp từ những loại vi sinh vật không gây hại, PS là vật liệu an toàn và có khả năng phân hủy sinh học tốt. Thậm chí có thể sử dụng trực tiếp vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp PS ngoại bào vào trong một số sản phẩm. Ngoài việc đóng vai trò cho hoạt động sống của tế bào, EPS cũng như các hợp chất PS khác có các tính chất chức năng công nghệ được sử dụng như các chất phụ gia thực phẩm. Ở các nước châu Âu và Mỹ, các hợp chất này thường được sử dụng để cải thiện chất lượng của các sản phẩm chế biến từ sữa. Chúng không chỉ có vai trò rất quan trọng trong việc tăng khả năng hấp dẫn bởi hình thức bên ngoài của thực phẩm mà còn góp phần ổn định sản phẩm và hoàn thiện tính lưu biến. Các nhà công nghệ đã dựa trên cơ sở đó mà phát triển sản phẩm mới. Bên cạnh đó, EPS của vi khuẩn lactic còn có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe người và động vật như hoạt tính tăng cường khả năng miễn dịch, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư và chống cao huyết áp. Vì vậy, nghiên cứu về khả năng thu nhận EPS của vi khuẩn lactic cùng với cấu trúc, tính chất cũng như khả năng ứng dụng của chúng đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ những lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu nhận, xác định tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide từ một số chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum”. Đề tài được thực hiện với các nội dung: 1. Xác định điều kiện nuôi cấy và thu nhận EPS từ dịch lên men của các chủng L. plantarum nghiên cứu. 2. Khảo sát một số tính chất có lợi của các EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng L. plantarum nghiên cứu. 3. Cung cấp thông tin về cấu trúc của EPS thu nhận được. 4. Bước đầu khảo sát khả năng ứng dụng các chủng L. plantarum nghiên cứu trong lên men sữa đậu nành.
FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN BẢO KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN, XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VÀ THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE CỦA EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MỘT SỐ CHỦNG THUỘC LOÀI Lactobacillus plantarum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NĂM 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.1.2 Khái niệm exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.1.3 Cấu trúc phân loại exopolysaccharide 1.1.3.1 Homopolysaccharide 1.1.3.2 Heteropolysaccharide 10 1.1.4 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 12 1.1.4.1 Cơ chế sinh tổng hợp homopolysaccharide 12 1.1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp heteroexopolysaccharide 15 1.2 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide vi khuẩn lactic 18 1.2.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp exopolysaccharide 19 1.2.1.1 Nguồn carbon 19 1.2.1.2 Nguồn nitrogen 20 1.2.1.3 pH môi trường 21 1.2.1.4 Nhiệt độ nuôi cấy 22 1.2.1.5 Thời gian nuôi cấy 22 1.2.2 nuôi cấy Điều kiện tách chiết tinh chế exopolysaccharide từ môi trường 23 1.2.3 Đặc tính sinh lý chức công nghệ exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 24 1.2.3.1 Chức sinh lý 24 1.2.3.2 Tính chất chức công nghệ exopolysaccharide thực phẩm 26 1.2.4 Cấu trúc exopolysaccharide 28 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42 iv 2.2 Hóa chất 42 2.2.1 Các hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn 42 2.2.2 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm exopolysaccharide 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Các phương pháp vi sinh 42 2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn 43 2.3.1.2 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối 43 2.3.2 Xác định hàm lượng exopolysaccharide phương pháp phenol – sulfuric acid 43 2.3.3 Xác định hàm lượng N tổng số phương pháp Kjeldahl 43 2.3.4 Phương pháp tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy L plantarum 43 2.3.4.1 Kết tủa protein dịch nuôi cấy TCA 44 2.3.4.2 Kết tủa exopolysaccharide dịch nuôi cấy ethanol tuyệt đối 44 2.3.5 Xác định khả hòa tan nước chế phẩm exopolysaccharide 44 2.3.6 Phương pháp khảo sát khả giữ nước giữ dầu chế phẩm exopolysaccharide 44 2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa exopolysaccharide sinh tổng hợp chủng L plantarum nghiên cứu 45 2.3.8 Xác định thành phần đường mối liên kết phân tử exopolysaccharide phương pháp GC-MS NMR 46 2.3.9 Xác định khối lượng phân tử exopolysaccharide phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 47 2.3.10 Các phương pháp khảo sát khả ứng dụng L plantarum 47 2.3.10.1 Phương pháp xác định trạng thái gel sữa đậu nành lên men 47 2.3.10.2 Phương pháp xác định khả giữ nước gel sữa đậu nành lên men 47 2.3.10.3 Phương pháp xác định thuộc tính dòng chảy sữa đậu nành lên men 48 2.3.11 Sơ đồ thực nội dung nghiên cứu 48 2.3.12 Bố trí thí nghiệm nội dung nghiên cứu 49 2.3.12.1 Nội dung 49 2.3.12.2 Nội dung 49 2.3.12.3 Nội dung 50 v 2.3.12.4 Bố trí thí nghiệm nội dung 51 2.3.12.5 Bố trí thí nghiệm nội dung 51 2.3.12.6 Bố trí thí nghiệm nội dung 51 2.3.13 Chương Phương pháp xử lý số liệu 51 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Khảo sát khả sinh tổng hợp exopolysaccharide số chủng L plantarum phân lập từ thực phẩm truyền thống 52 3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng L plantarum tuyển chọn 53 3.2.1 Nguồn carbon 54 3.2.2 Nguồn nitrogen 57 3.2.3 Mật độ tế bào gieo cấy ban đầu 60 3.2.4 pH ban đầu môi trường 61 3.2.5 Nhiệt độ nuôi cấy 63 3.2.6 Thời gian nuôi cấy 65 3.3 Ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến khả thu nhận exopolysaccharide từ dịch lên men chủng L plantarum tuyển chọn 67 3.3.1 Nồng độ TCA 68 3.3.2 Hàm lượng ethanol tuyệt đối 70 3.3.3 Thời gian kết tủa 71 3.4 Một số tính chất exopolysaccharide từ chủng L plantarum tuyển chọn 72 3.4.1 Khả hòa tan nước 73 3.4.2 Khả giữ nước, giữ dầu 75 3.4.3 Khả chống oxy hóa 78 3.5 Xác định phần cấu trúc phân tử exopolysaccharide sinh tổng hợp chủng L plantarum W1 80 3.5.1 Khối lượng phân tử exopolysaccharide sinh tổng hợp L plantarum W1 81 3.5.2 Thành phần monosaccharide exopolysaccharide sinh tổng hợp L plantarum W1 82 3.5.2.1 Thành phần monosaccharide 83 3.5.2.2 Mối liên kết glycoside 86 3.6 Khảo sát khả đồng tạo gel sữa đậu nành lên men chủng L plantarum tuyển chọn 94 vi 3.6.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến trạng thái gel sữa đậu nành lên men 94 3.6.2 Khả giữ nước gel sữa đậu nành lên men 96 3.6.3 Độ nhớt sữa đậu nành lên men 97 KẾT LUẬN 101 KIẾN NGHỊ 102 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Đặc điểm EPS từ L plantarum 36 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn C đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 55 Bảng 3.2 Hiệu suất thu nhận EPS cao dịch ni cấy có bổ sung nguồn C chủng L plantarum tuyển chọn 57 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 58 Bảng 3.4 Hiệu suất thu nhận EPS cao dịch ni cấy có bổ sung nguồn N chủng L plantarum tuyển chọn 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng ethanol tuyệt đối đến khả thu nhận EPS từ dịch lên men chủng L plantarum tuyển chọn 71 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến khả thu nhận EPS từ dịch nuôi cấy chủng L plantruam tuyển chọn 72 Bảng 3.7 Khả chống oxy hóa EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum tuyển chọn 79 Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) monosaccharide cấu trúc EPS-W1 84 Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu liên kết glycoside tương ứng EPS-W1 86 Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR 13C – NMR EPS-W1 đo D2O 90 Bảng 3.11 Trạng thái gel theo thời gian sữa đậu nành lên men chủng L plantarum tuyển chọn 95 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn đơn vị lặp lại số glucan Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn đơn vị lặp lại số fructan Hình 1.3 Sơ đồ đặc điểm HoPS sinh tổng hợp từ LAB 10 Hình 1.4 Sơ đồ đặc điểm HePS sinh tổng hợp từ LAB 11 Hình 1.5 Mơ hình trình sinh tổng hợp glucan fructan 13 Hình 1.6 Sơ đồ trình sinh tổng hợp HePS tế bào LAB 16 Hình 1.7 Cấu tạo UDP-Glc TDP- Glc 17 Hình 1.8 Sơ đồ biểu diễn tính chất tăng cường sức khỏe có EPS từ LAB 25 Hình 1.9 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus 766 29 Hình 1.10 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus Lb161 29 Hình 1.11 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus K16 30 Hình 1.12 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbrueckii subsp bulgaricus LBB.B26 30 Hình 1.13 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbrueckii subsp bulgaricus NCFB2074 31 Hình 1.14 Cấu trúc EPS tổng hợp L rhamnosus KL37C 31 Hình 1.15 Cấu trúc EPS tổng hợp L rhamnosus KL37B 31 Hình 1.16 Cấu trúc EPS tổng hợp L fermentum TDS030603 32 Hình 1.17 Cấu trúc EPS tổng hợp L johnsonii 151 32 Hình 1.18 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbruckii subsp bulgaricus 32 Hình 1.19 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbruckii subsp bulgaricus EU23 33 Hình 1.20 Cấu trúc EPS tổng hợp L plantarum BC-25 33 Hình 1.21 Cấu trúc EPS tổng hợp L pentosus LPS26 34 Hình 1.22 Cấu trúc EPS tổng hợp L acidophilus 5e2 34 Hình 1.23 Cấu trúc EPS tổng hợp L acidophilus LMG9433 34 Hình 1.24 Cấu trúc EPS tổng hợp L paracasei 34-1 35 Hình 1.25 Cấu trúc EPS tổng hợp L sake 0-1 35 Hình 1.26 Cấu trúc EPS tổng hợp L brevis G-77 35 Hình 3.1 Khả sinh tổng hợp EPS số chủng L plantarum 52 ix Hình 3.2 Ảnh hưởng mật độ tế bào gieo cấy ban đầu đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 61 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu mơi trường đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 62 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 63 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng L plantarum tuyển chọn 66 Hình 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng TCA bổ sung đến khả kết tủa protein hàm lượng EPS thu nhận từ dịch nuôi cấy chủng L plantarum tuyển chọn69 Hình 3.7 Khả hòa tan nước EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum tuyển chọn 74 Hình 3.8 Khả giữ nước, giữ dầu EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum tuyển chọn 76 Hình 3.9 Phổ đồ GPC đo khối lượng phân tử trung bình EPS-W1 81 Hình 3.10 Sắc ký đồ phổ GC-MS EPS-W1 83 Hình 3.11 Phổ 1H-NMR EPS-W1 87 Hình 3.12 Phổ 13C-NMR EPS-W1 88 Hình 3.13 Phổ HSQC EPS-W1 89 Hình 3.14 Phổ HMBC EPS-W1 92 Hình 3.15 Phổ NOESY EPS-W1 93 Hình 3.16 Cấu trúc đơn vị lặp lại phân tử EPS-W1 94 Hình 3.17 Trạng thái gel sữa đậu nành lên men 96 Hình 3.18 Khả giữ nước gel sữa đậu nành lên men chủng L plantarum tuyển chọn 96 Hình 3.19 Độ nhớt biểu kiến sữa đậu nành lên men 99 x MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic Acid Bacteria) nhóm vi khuẩn có lợi sử dụng phổ biến giới Bên cạnh sử dụng làm giống khởi động sản phẩm lên men lactic, chúng có khả sinh tổng hợp bacteriocin, exopolysaccharide (EPS)… hay dùng để sản xuất chế phẩm probiotic Những polysaccharide (PS) sử dụng thực phẩm y dược thường có tính chất lý tốt cho ứng dụng như: kéo sợi, màng, keo, chất làm đặc, tạo gel tác nhân truyền dẫn thuốc… Nguồn cung cho PS chủ yếu từ thực vật tinh bột, agar, galactomannan, pectin, carageenan aginate Nhờ vào cấu trúc mạch dài, PS đáp ứng yêu cầu Tuy nhiên, để hồn thiện tính chất lưu biến này, hợp chất PS có nguồn gốc thực vật đưa vào sử dụng phải xử lý phương pháp enzyme phương pháp hóa học Vì vậy, khả ứng dụng chúng có số hạn chế định Trong lúc đó, việc khai thác hợp chất PS từ vi sinh vật có nhiều tính ưu việt so với từ thực vật chu kỳ sinh trưởng phát triển ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ điều khiển q trình sản xuất Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại PS PS nội bào, PS tạo cấu trúc cho thành tế bào (lipopolysacchride, peptidoglycan ) EPS (PS ngoại bào) Hơn nữa, tổng hợp từ loại vi sinh vật khơng gây hại, PS vật liệu an tồn có khả phân hủy sinh học tốt Thậm chí sử dụng trực tiếp vi sinh vật có khả sinh tổng hợp PS ngoại bào vào số sản phẩm Ngồi việc đóng vai trò cho hoạt động sống tế bào, EPS hợp chất PS khác có tính chất chức công nghệ sử dụng chất phụ gia thực phẩm Ở nước châu Âu Mỹ, hợp chất thường sử dụng để cải thiện chất lượng sản phẩm chế biến từ sữa Chúng khơng có vai trò quan trọng việc tăng khả hấp dẫn hình thức bên ngồi thực phẩm mà góp phần ổn định sản phẩm hồn thiện tính lưu biến Các nhà cơng nghệ dựa sở mà phát triển sản phẩm Bên cạnh đó, EPS vi khuẩn lactic có nhiều tác dụng tốt sức khỏe người động vật hoạt tính tăng cường khả miễn dịch, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư chống cao huyết áp Vì vậy, nghiên cứu khả thu nhận EPS vi khuẩn lactic với cấu trúc, tính chất khả ứng dụng chúng lĩnh vực nhiều nhà khoa học quan tâm Từ lý đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu nhận, xác định tính chất thành phần monosaccharide exopolysaccharide từ số chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum” Đề tài thực với nội dung: Xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS từ dịch lên men chủng L plantarum nghiên cứu Khảo sát số tính chất có lợi EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum nghiên cứu Cung cấp thông tin cấu trúc EPS thu nhận Bước đầu khảo sát khả ứng dụng chủng L plantarum nghiên cứu lên men sữa đậu nành Hình 4.2a Phổ 1H EPS-W1 xxx Hình 4.2b Phổ giãn 1H EPS-W1 xxxi Hình 4.2c Phổ giãn 1H EPS-W1 xxxii Hình 4.3a Phổ 13C EPS-W1 xxxiii Hình 4.3b Phổ giãn 13C EPS-W1 xxxiv Hình 4.4a Phổ HMBC EPS-W1 xxxv Hình 4.4b Phổ giãn HMBC EPS-W1 xxxvi Hình 4.4c Phổ HMBC EPS-W1 xxxvii Hình 4.5a Phổ HSQC EPS-W1 xxxviii Hình 4.5b Phổ giãn HSQC EPS-W1 xxxix Hình 4.5c Phổ HSQC EPS-W1 xl Hình 4.5d Phổ HSQC EPS-W1 xli Hình 4.6a Phổ NOESY EPS-W1 xlii Hình 4.6b Phổ giãn NOESY EPS-W1 xliii Phụ lục 5: Thành phần môi trường MRS lỏng Bảng 5.1 Thành phần môi trường MRS lỏng Thành phần Khối lượng (g) Peptone 10 Cao thịt Cao nấm D – Glc 20 K2HPO4 2,62 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.4H2O 0,038 (NH4)2C6H6O7 CH3COONa.3H2O Tween 80 mL Nước cất Định mức đủ 1000 mL xliv ... học quan tâm Từ lý đó, tiến hành thực đề tài Nghiên cứu điều kiện thu nhận, xác định tính chất thành phần monosaccharide exopolysaccharide từ số chủng thu c loài Lactobacillus plantarum Đề... thực với nội dung: Xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS từ dịch lên men chủng L plantarum nghiên cứu Khảo sát số tính chất có lợi EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum nghiên cứu Cung cấp thông... Nam, công bố nghiên cứu EPS từ LAB, đặc biệt L plantarum khơng nhiều Các cơng trình cơng bố chủ yếu nghiên cứu xác định điều kiện tách chiết, tính chất dược lý, khả chống oxy hóa từ số loài nấm nấm