• Trong nông nghiệp
Enzyme chitinase ức chế nấm, côn trùng và chân đốt bao gồm nhiều loại sâu bệnh gây hại. Nấm chứa chitin bị ức chế bởi enzyme chitinase bao gồm
Fusarium, Gliocladium, Rhizotonia, Trichoderma, Ustilago, Erysiphe, Botrytis,
Sclerotium và Alternaria. Côn trùng chứa chitin bị kìm hãm bởi chitinase gồm
Lepidoptera: Trichoplusia (sâu cải), Pieris rapae (ấu trùng cây cải), sâu trên râu bắp, bướm đêm, ấu trùng vỏ tròn hồng, sâu thuốc lá … Lớp Coleoptera bao gồm bọ cánh cứng khoai tây Colorado, bọ vòi voi vỏ tròn, bọ cánh cứng đậu Mexico và ấu trùng sống ở rễ bắp. Homoptera bao gồm rệp cây bông cải, rệp cây khoai tây, rệp đỏ California. Thysanoptera bao gồm bọ trĩ ở củ hành, Orthoptera bao gồm châu chấu, Hemiptera bao gồm bọ xít ở lúa.
Người ta có thể sử dụng chitinase như một tác nhân điều chỉnh sinh học an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học [14]. Ở đây việc ức chế bằng enzyme chitinase tinh sạch được thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng. Enzyme chitinase tinh khiết có thể được sử dụng như một dung dịch và có nồng độ xác định (50-100ppm) và được ứng dụng trong thuốc xịt [14] hay một dịch đặc chitinase tinh khiết cùng hiện diện với chất mang gắn với nó (methyl cellulose, gum Arabic) được dùng như là một loại thuốc bột.
• Trong y dược
- Tổng hợp chitooligosaccharide
Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharide ngày càng được nghiên cứu sâu. Trong y học, người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân kháng ung thư. Enzyme chitinase của Vibrio alginolyticus phân cắt huyền phù chitin thành chitopentaose và chitotriose.
Enzyme N,N’-diacetylchitobiase được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi đầu cho sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học. Chitinase thu nhận từ S. griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục được cải biến hóa học thành một dẫn xuất disaccharide mới 2-acetamido-2-deoxy-D- allopyranose. Đây là chất trung gian để tổng hợp nên chất ức chế enzyme. Ngược lại, có thể sử dụng chitinase của Bacillus để tổng hợp chitobiose nhờ sự kết nối N-acetyl-D-glucosamine với dẫn xuất đường oxazolin.
- Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase
Các loài vi nấm chính liên quan đến các bệnh cơ hội ở các bệnh nhân AIDS là Candidosis, Cryptococcosis (nấm men), Histoplasmosis,
Coccidioimycosis (nấm lưỡng hình). Những nguồn kháng nguyên của nấm (manna của Candidosis, glucuronoxylomanan trong nấm men) có thể hoạt động như là một nhân tố ngăn chặn tế bào T trong sự phát triển của AIDS. Một lượng nhỏ kháng nguyên của nấm có thể kích thích phản ứng miễn dịch nhưng sự thừa thải kháng nguyên có thể gây ra tác động ngược lên tính miễn dịch của tế bào. Do đó, điều cần thiết là việc điều trị phải được tiến hành một cách nhanh chóng và có hiệu quả trước khi những tình trạng trên có điều kiện lan rộng.
Nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm được đề xuất như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử … để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao. Những bất lợi chung trong hầu hết các phương pháp hiện sử dụng là khó áp dụng đối với các mẫu dịch cơ thể bởi vì khó cố định được các mẫu này. Các phương pháp nhuộm như GMS (Grocott methenamine AgNO3 staining), calcofluor/cellufour, India Ink, lectin label, rylus BSU được dùng nhuộm cố định các tiêu bản nấm nhưng không có tính đặc hiệu cao và cần sử dụng các thiết bị đắt tiền.
Chitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong những vết chồi. Do đó cần một phương pháp nhuộm chitin đặc biệt cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả các loài nấm gây bệnh.
Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng enzyme chitinase đã được phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh.
- Chế phẩm thuốc mới: enzyme chitinase và các dược chất kháng nấm
Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase. Các tác nhân đó bao gồm:
- Amphotericin B và những phức chất có cấu trúc tương tự nystatin và pyramycin
- 5-fluorocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol…
- Allylamine-thiocarbamate như tolnaftat, terbinafin… - Griseofulvin, acid undecylenic, bezoic…
Enzyme chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc kết hợp giữa enzyme chitinase và laminarinase được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng enzyme chitinase).
Người ta đã đề nghị phương thức điều trị bệnh nấm bao gồm chitinase và một dịch pha loãng hay thể mang và cũng có thể bao gồm các tác nhân kháng nấm khác. Liều lượng được chỉ định đủ để bổ trợ cho hoạt động của chitinase nội sinh. Những phương thuốc hữu hiệu từ 1μg/kg-100mg/kg trọng lượng cơ thể và khoảng 0,1-20mg chitinase/kg thể trọng cơ thể. Các thành phần của phương pháp điều trị có thể được điều khiển bằng các hướng khác nhau tùy thuộc vào bệnh truyền nhiễm nào được điều trị, bao gồm: đi qua dưới da, trong cơ, trong tĩnh mạch, trong phổi, định khu, bằng đường miệng hay điều khiển thuốc điều trị trong âm đạo…
Các nhà khoa học đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của enzyme chitinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các loại nấm khác nhau thuộc nhóm Aspergillus, Candida … Hiệu quả của sự điều trị vơí tác nhân kháng nấm được ước lượng trên 3 điểm:
- Giảm tỉ lệ chết.
- Giảm số lượng tế bào nấm được nuôi cấy từ các cơ quan - Giảm mức độ lưu thông kháng nguyên nấm
I.2. CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS VAØ CHITINASE TRONG MỦ
CAO SU
I.2.1. Cây cao su
Trong thiên nhiên có rất nhiều cây cao su thuộc nhiều loại thực vật khác nhau (chưa kể có loại cây cho ra chất tương tự cao su như cây gutta-percha và balata). Nói chung cây cao su trên thế giới thuộc vào 5 họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae và Composeae. Chúng thích hợp với khí hậu vùng nhiệt đới, đặc biệt là miền Bắc Nam Mỹ,
Brasil, Trung Mỹ, châu Phi từ Maroc đến Madagasca, Sri Lanka, miền Nam Aán, Việt Nam, Lào và Campuchia, Thái Lan, Malaysia và Indonesia [4].
Trong số những loại cây cao su, đặc biệt loại được ưa chuộng nhất là cây
Hevea brasiliensis, cung cấp khoảng 95-97% cao su thiên nhiên trên thế giới. Những đồn điền trồng với giống cải thiện, giống seedling (cây trồng hột, cho latex ít hơn cây tháp và sản xuất muộn hơn, nhưng khi cạo mủ vỏ cây dễ lành vết thương hơn) và nhất là giống tuyển nhân ghép năng suất thông thường đạt được từ 1 tấn đến 1,5 tấn cao su/hecta/năm. Việc sử dụng các cây giống mới có thể tăng năng suất vượt lên trên 2 tấn cao su khô/hecta/năm. Viện khảo cứu cao su Việt Nam cho biết đã trao đổi kỹ thuật về giống cây với nhiều viện khảo cứu cao su quốc tế và đã nhập được những giống mà năng suất ở vườn thí nghiệm của viện đạt đến 3 tấn/hecta/năm [4]. Một cây cao su Hevea brasiliensis có kích thước lớn được xử lý thích hợp có thể chịu được trên 20 lần cạo mủ trong mùa thu hoạch, cung cấp tới 10 lít latex ứng với 3kg cao su khô.
Qua năng suất kể trên, ta thấy loại cao su này bỏ xa năng suất đạt được với những cây cao su khác (Ficus, Manihot, Puntomia, Guayule hay Kok-saghyz) năng suất của chúng chỉ vào khoảng vài kg cao su/hecta/năm [4]. Ngoài ra, các cây cao su loại khác có các đặc tính không tốt khi so sánh với Hevea brasiliensis
như khó trồng, kém chịu đựng cạo mủ, chất lượng cao su không tốt, không tinh khiết, khó chiết rút cao su...
• Heveabrasiliensis
Phân loại: Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Malpighiales Họ : Euphorbiaceae Họ phụ : Crotonoideae Tộc : Micrandreae Tộc phụ : Heveinae Giống : Hevea
Loài : Hevea brasiliensis [28]
Hevea brasiliensis là một loại cây cao su (Pará rubber tree, rubber tree) to lớn, cao từ 20 mét đến 40 mét, có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazone và chi lưu (Nam Mỹ) ở trạng thái ngẫu sinh [4].
Cũng như các loại khác thuộc giống Hevea, cây Hevea brasiliensis có hoa đơn tính, màu vàng, không cánh, hình chuông nhỏ, tập trung thành chùm. Lá dài từ 20cm đến 30cm, thuộc lá kép 3. Đây là cây đơn tính đồng chu, có trái là hột nang có 3 ngăn, mỗi ngăn chứa 1 hột. Lúc chín, trái nổ phóng thích hột. Hột tròn, dài từ 2cm đến 3,5cm có màu nâu sậm. Nhân hột giàu chất béo (ta trích gọi là dầu hột cao su), do đó hột mất khả năng nẩy chồi nhanh [4].
Hoa đực gồm 10 bao phấn xếp thành 2 hàng dọc đều đặn (trên cuống nhị), nó cũng có 36 nhiễm sắc thể như các loại Hevea khác. Mỗi năm cây thay lá một lần, thay hoàn toàn hoặc thay dần (ta gọi là mùa thay lá). Cây bén rễ cùng một lượt với rễ trụ và rễ ngang. Rễ trụ có thể đi sâu xuống 5m đến 6m, chỉ ngưng phát triển khi gặp lớp đất cứng hay lớp nước thường trực. Vỏ cây nhẵn và đều, gỗ mềm và giòn [4].
Hệ thống nhựa mủ (latex) cây này thuộc loại mạch nhánh, do các tế bào dài tạo thành, nằm nối và vách chung tự tiêu, đường kính mạch latex khoảng 20μm đến 50μm. Những mạch này nằm trong nhu mô của cây, không thấy có trong mộc. Trong vỏ thân và nhánh, chúng hợp thành kiểu hình trụ hoặc kiểu “vỏ khoác” kết hợp. Các “vỏ khoác” của mạch latex tương giao với nhau và đặc biệt có nhiều trong kết cấu libe gần mô mới sinh hoặc nói chung ở các libe - mộc. Vỏ cây dày 8mm đến 18mm đối với những cây trưởng thành, gần ngoại biên có những tế bào rắn lại nhiều hay ít tùy theo tuổi. Sau khi cạo mủ, vỏ cây tái sinh lại dễ dàng [4].
Tại châu Mỹ, Hevea brasiliensis sinh trưởng tự nhiên thành rừng, cây thường bị bệnh cháy lá trầm trọng do loại Dothidella ulei gây ra. Bệnh này hầu như không gặp tại các nước Viễn Đông [4].
Về phương diện sinh thái, cây chỉ thích hợp với khí hậu vùng xích đới hay nhiệt đới. Cây đòi hỏi nhiệt độ trung bình là 25oC, lượng mưa tối thiểu là 1.500mm mỗi năm và có thể chịu hạn được nhiều tháng trong mùa khô. Cây mềm và giòn do đó có thể bị gãy khi gặp gió mạnh. Mặc dù cây cao su ít đòi hỏi chất lượng đất nhưng thích hợp nhất với đất đai phì nhiêu, sâu, dễ thoát nước, hơi chua (pH từ 4 đến 4,5) và giàu mùn [4].
Dù cho các loại nhựa dẻo, cao su tổng hợp đang phát triển mạnh khắp thế giới, cao su thiên nhiên vẫn là một loại nguyên liệu quan trọng. Hevea brasiliensis cung cấp hầu hết tổng lượng cao su thiên nhiên trên thị trường thế giới [4]. Hầu hết giống cao su trồng hiện nay ở nước ta và các nước khác chính là cây cao su Hevea brasiliensis này.
I.2.2. Mủ cao su
• Nguồn gốc latex và hệ thống mạch latex
Mủ cây cao su (latex) được tạo ra từ những tế bào sống chuyên biệt (laticifer, tế bào cây chứa nhựa mủ [17]) có trong nhu mô cây, đặc biệt là trong vùng tạo lập libe vỏ. Các tế bào tạo latex được một lớp nguyên sinh chất mỏng bao phủ, bao cả một không bào lớn là nơi mà nguyên sinh chất tiết ra latex [4]. Như vậy latex được tạo ra tại chỗ từ nước và muối khoáng do rễ hấp thụ, không phải từ quang tổng hợp của lá. Có 5 loại tế bào chứa nhựa mủ được phân loại dựa theo các giai đoạn phát triển hoặc các vị trí khác nhau trong cây: thứ nhất là các mạch có trong cuống lá ở thời kỳ đầu trước sự dung hợp của các tế bào laticifer. Chúng giống với tế bào chất của các tế bào nhu mô sống ngoại trừ sự
có mặt của các nhiều phần tử cao su. Loại thứ hai là mạch từ libe thứ cấp ở thân xanh, có chứa các hạt cao su. Đường kính mạch từ 100-5000Å. Ở đây, các hạt lutoid nổi bật và chứa các vi sợi. Loại mạch này có chứa ty thể và đôi khi có các phức hợp Frey-Wyssling, thể golgi và lục lạp. Loại mạch thứ ba có trong libe thứ cấp ở thân cây trưởng thành, ở phần bên trong của vỏ, cách phần mộc 1mm. Chứa các hạt cao su kích thước nhỏ 50Å-2μm. Các hạt lutoid tồn tại nhưng không chứa các vi sợi. Ngoài ra còn có ty thể. Loại thứ tư là mạch latex khi đã chịu sự cạo mủ và chứa rất nhiều hạt cao su. Lutoid và các phức hợp Frey- Wyssling có mặt thường xuyên, đôi khi có các ty thể, mạng lưới nội chất, rất hiếm khi có nhân tế bào. Loại cuối cùng có ở các mạch lão hóa ở vỏ ngoài. Ở loại này các hạt cao su kích thước khá lớn và không quan sát rõ các bào quan [31].
Toàn bộ latex trong cây tạo thành một mạng lưới hay hệ thống [17]. Tùy theo loại cây cao su, hệ thống latex được tạo từ tế bào cô lập hoặc từ mạch. Trong trường hợp thứ nhất như loại Parthenium argentatum (guayule), tế bào latex nằm rải rác không tương thông với nhau trong cơ quan cây. Trong trường hợp sau, mạch latex được tạo bởi các tế bào có kích thước lớn trong nhu mô nhưng không tương giao với nhau hoặc từ mạng tế bào dài nằm nối tiếp có vách chung tự tiêu. Loại mạch latex thứ nhất thường có đa số ở loại cây cao su. Loại mạch thứ hai là loại mạch nhánh hoặc mạch tiếp hợp chỉ có ở giống Hevea và
Manihot (họ Euphorbiaceae) và ở các cây thuộc họ Composées có hoa hình cánh lá (Pissenlit, scorsonère) [4]. Ngoài thân cây, các cơ quan khác của cây cũng đều có chứa latex.
Ở Hevea brasiliensis, hệ thống latex là hệ thống kín có dạng mạch phân nhánh và tương giao với nhau [4], giống như hệ tuần hoàn trong cây. Khi muốn thu hoạch cao su, cần phải thực hiện rạch cạo một đường trên vỏ thân cây nhằm
cắt đứt các mạch latex, làm tổn thương các tế bào chứa nhựa mủ để cho latex cao su tiết, chảy ra ngoài. Phương pháp thu hoạch này, được gọi là phương pháp “cạo mủ”, được áp dụng vào cây cao su Hevea brasiliensis vì latex của cây này có độ nhớt thấp và do cây cao su này lại có khả năng tái tạo latex nhanh chóng và có thể khai thác được suốt cả năm [4]. Phương pháp “cạo mủ” này hiện đang được áp dụng tại nước ta.
• Chức năng latex
Latex là một chất lỏng mang tính động học tham dự vào hoạt tính sinh lý thực vật. Hệ thống latex được xem là một nơi mà cây dùng để trữ nước và nhiều chất khác, sẽ đem ra dùng vào những lúc hoạt động sinh lý mạnh nhất [4].
• Cấu tạo và đặc tính latex
Latex là một chất lỏng phức tạp có bản chất là tế bào chất của tế bào cây chứa nhựa mủ. Thành phần, hàm lượng các thành phần và tính chất latex khác biệt nhau tùy theo loại cây, tùy theo các điều kiện về khí hậu, hoạt tính sinh lý và hiện trạng sống của cây cao su. Các phân tích latex từ nhiều loại cây cao su khác nhau chỉ đưa ra những con số phỏng chừng về thành phần latex: cao su chiếm từ 30-40% [17, 31], nước từ 52-70%, protein chiếm 2-3%, acid béo và dẫn xuất 1-2%, glucid và heterosid khoảng 1%, khoáng chất từ 0,3-0,7%. Nhiều dạng cao su trên thị trường đều có chứa nhiều hoặc ít lượng chất cấu tạo latex phụ hoặc có chứa những chất biến đổi của chúng và có thể chúng có tính liên hệ mật thiết với tính chất của cao su thô hay latex được bảo quản.
Trị số pH của latex có ảnh hưởng quan trọng tới độ ổn định latex. Latex