Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu bằng kỹ thuật Metagenomic

MỞ ĐẦU Cellulase là nhóm enzyme thủy phân các liên kết β-1,4-glucoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác. Cellulase được tổng hợp bởi cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, lên men rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy,... Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt thì nhu cầu sử dụng các nguồn năng lượng thay thế, có thể tái tạo và thân thiện với môi trường ngày càng tăng. Một trong những nguồn năng lượng thay thế được quan tâm nhất hiện nay là nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose. Quá trình chuyển hóa lignocellulose thành các sản phẩm có giá trị như nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cơ và các cụm hóa chất kiến tạo khác thường được thực hiện ở các điều kiện đặc biệt như ở nhiệt độ cao, tiền xử lý bằng kiềm hoặc axit hoặc trong dung môi hữu cơ… Do đó đòi hỏi các nhà khoa học phải nghiên cứu tìm kiếm các cellulase mang những đặc tính mới (như bền với nhiệt độ cao, chịu được áp suất cao, chịu được pH axit/kiềm, dung môi …) để đáp ứng được các yêu cầu của quá trình chuyển hóa lignocellulose và hạ được giá thành sản xuất. Một trong những nguồn địa nhiệt có thể thu nhận cellulase bền nhiệt là nhóm vi sinh vật ưa nhiệt ở suối nước nóng. Tuy nhiên, sử dụng các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật truyền thống không thể khai thác hết được tiềm năng của vật liệu di truyền trong hệ sinh thái này vì có tới 99% các loài vi sinh vật sống trong môi trường là các loài không nuôi cấy được. Hơn nữa, do đặc tính riêng của hệ sinh thái suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp hơn rất nhiều so với các môi trường bình thường khác, vì vậy việc thu nhận được các loài vi sinh vật mới để khai thác nguồn gen của chúng bằng phương pháp nuôi cấy thông thường gặp nhiều khó khăn. Ngày nay, nhờ sự tiến bộ của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, việc tách dòng các gen mới có thể được thực hiện bằng cách tiếp cận cơ sở dữ liệu metagenome kết hợp với các phần mềm tin sinh để dự đoán tính chất của protein tiềm năng trước khi biểu hiện và nghiên cứu đặc tính của enzyme tái tổ hợp. Thông qua cách tiếp cận này, các nhà nghiên cứu không chỉ đánh giá được mức độ đa dạng vi sinh vật ở trong một hệ sinh thái mà còn bảo tồn và khai thác được các gen mới hoặc các protein có tính chất đặc biệt từ các vi sinh vật đó. Với mong muốn có thể đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng thời tiếp cận và khai thác được nguồn cellulase bền nhiệt mới từ suối nước nóng Bình Châu - suối nước nóng có nhiệt độ cao thứ hai ở Việt Nam không thông qua nuôi cấy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thông qua kết quả giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu bằng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, (i) Đánh giá được nguồn đa dạng vi sinh vật ưa nhiệt và xây dựng được bộ dữ liệu các gen mã hóa cho cellulase; ii) Biểu hiện được các cellulase tái tổ hợp đồng thời (iii) Tinh sạch và xác định được tính chất của các cellulase tái tổ hợp này. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam viƯn c«ng nghƯ sinh häc TRẦN THANH THỦY NGHI£N CøU đánh giá đa dạng vi sinh vật, SàNG LọC, THU NHậN Và XáC ĐịNH TíNH CHấT CủA CELLULASE SUốI NƯớC NóNG bình châu, VIệT NAM kỹ thuật metagenomicS luận ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2021 3.2.3 Động thái sinh trưởng biểu endoglucanase β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 82 3.3 Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp 83 3.3.1 Tinh enzyme tái tổ hợp 83 3.3.2 N g h i ê n c ứ u mộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n g l u c a n a s e _ v β - g l u c o s i d a s e _ 27 t i t ổ h ợ p 85 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 95 4.1 Đa dạng vi sinh vật tiềm khai thác gen mã hóa cho cellulase suối nước nóng Bình Châu thơng qua cách tiếp cận khơng phụ thuộc vào nuôi cấy 95 4.1.1 Đa dạng vi sinh vật .95 4.1.2 Tiềm khai thác gen mã hóa cho cellulase 99 4.2 Mối liên hệ mơ hình cấu trúc với đặc điểm endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 104 4.2.1 Phân tích main ch ức c endoglucana se_18 736 β-glucos idase _3 2768 .104 4.2.2 Mơ hình cấu trúc 3D endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 113 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate BGI Beijing Genomics Institute Viện nghiên cứu hệ gen Bắc Kinh BLAST Basic Local Alignment Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương Search Tool đồng trực tuyến NCBI Bp Base pair Cặp base BSA Bovine serum albumin Albumin huyết bò CAZy Carbohydrate – Active Enzyme thủy phân carbohydrate enzymes CBMs hay Carbohydrate Binding Module/Vùng liên kết với CBD modules/Domains carbohydrate CD Catalytic domain Vùng xúc tác CEs Carbohydrate esterases Carbohydrate esterases CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose Cơ sở liệu CSDL dH2O Deionized water Nước deion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic dNTP 2’ – deoxyribonucleoside 2’ – deoxyribonucleoside 5’ - 5’ – triphosphate triphosphate 1,2-bis 1,2-bis (diphenylphosphino) ethylene DPPE (diphenylphosphino) ethylene EBI European Bioinformatics Viện nghiên cứu tin sinh Châu Âu Institute EDTA Ethylene diamine tetra Axit ethylene diamine tetra acetic acetic acid vii EMBL ExPASY European Molecular Phịng thí nghiệm sinh học phân tử Biology Laboratory Châu Âu Expert Protein Analysis Hệ thống chuyên phân tích protein System GH Glycoside hydrolase Họ enzyme thủy phân glycoside GTs Glycosyl transferases Glycosyl transferases HTS High throughput Giải trình tự thơng lượng cao Sequencing IPTG Kb Isopropyl β- D-1- Isopropyl β- D-1- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside Kilo base Đơn vị đo kích thước axit nucleic KDa Kilo Dalton Đơn vị đo kích thước protein KEGG Kyoto Encyclopedia of Cơ sở liệu gen hệ gen Genes and Genomes Kyoto Km Michaelis constants Hằng số Michaelis LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani (LB) MEGAN MEtaGenomic ANalyser Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gen NB Nutrient broth Môi trường Nutrient broth (NB) NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh Biotechnology Information học quốc gia (Mỹ) Next Generation Giải trình tự gen hệ NGS Sequencing NR Non - Redundant Cơ sở liệu chứa trình tự khơng dư thừa NCBI ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PBS Phosphate – Buffered Đệm muối phosphate saline PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi viii PDB Protein Data Bank Ngân hàng liệu protein PEG Polyethylen glycol Polyethylen glycol PLs Polysaccharide lyases Polysaccharide lyases pNPG p-nitrophenyl-β-d- p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside glucopyranoside SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS - SDS – Polyacrylamide gel Điện di gel polyacrylamide PAGE electrophoresis Swiss-Prot Swiss Protein Cơ sở liệu protein Thụy Sĩ TB Terrific Broth Môi trường Terrific broth (TB) TEMED N,N,N′,N′-Tetramethyl N,N,N′,N′-Tetramethyl ethylenediamine ethylenediamine Tm Temperature Melting Nhiệt độ nóng chảy Vmax Maximum Velocity Vận tốc tối đa Uniprot Universal Protein Resource Nguồn liệu phổ biến trình tự chức protein ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân bố cellulase vào họ GH khác Bảng 1.2 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính cellulase vi sinh vật suối nước nóng 14 Bảng 1.3 Đặc điểm cellulase bền nhiệt 20 Bảng 1.4 Cellulase bền nhiệt từ metagenome vi sinh vật suối nước nóng 31 Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh DNA metagenome mẫu nước mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu .54 Bảng 3.2 Kết tinh liệu giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu .54 Bảng 3.3 Kết lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu .55 Bảng 3.4 Thống kê phân loại học DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu giải .56 Bảng 3.5 Tỉ lệ gen phân loại thuộc Ngành vi khuẩn suối nước nóng Bình Châu 58 Bảng 3.6 Tỉ lệ gen phân loại thuộc Lớp vi khuẩn suối nước nóng Bình Châu .59 Bảng 3.7 Tóm tắt kết giải gen dựa vào sở liệu mở 61 Bảng 3.8 Phân bố ORF mã hóa cho cellulase dự đốn từ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 64 Bảng 3.9 Đặc điểm ORF mã hóa cho endoglucanase β-glucosidase thỏa mãn tiêu chí lựa chọn gen/protein 68 Bảng 3.10 Kết tinh endoglucanase β-glucosidase tái tổ hợp cột IMAC-Ni2+ 85 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp .90 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Ngun tắc hoạt động cellulase thủy phân cellulose Hình 1.2 Cấu trúc 3D endoglucanase thuộc họ GH7 thu nhận từ nấm Trichoderma reesei 10 Hình 1.3 Cấu trúc cellulosome A cellulolyticus 11 Hình 1.4 Ba dạng tâm hoạt động họ GH 11 Hình 1.5 Hai chế xúc tác GHsa 13 Hình 1.6 Các phương pháp để phát gen cách sử dụng Metagenomics 22 Hình 1.7 Các bước xây dựng thư viện Metagenomic 24 Hình 1.8 Các bước phân tích tin sinh điển hình cho sở liệu Metagenomic 26 Hình 2.1 Quy trình xử lý, phân tích liệu DNA metagenome sàng lọc gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose tiềm 38 Hình 3.1 Các vị trí lấy mẫu nước mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu 53 Hình 3.2 DNA metagenome mẫu nước bùn suối nước nóng Bình Châu 53 Hình 3.3 Phân bố độ dài contig sau lắp ráp phần mềm SOAPdenovo2 .55 Hình 3.4 Phân bố độ dài gen dự đoán từ liệu D N A m e t a g e n o m e s u ố i n c n ó n g B ì n h C h â u 56 Hình 3.5 Biểu đồ biểu thị nhóm chiếm ưu cho cấp độ phân loại (Ngành, Lớp, Bộ, Họ, Chi, Loài) vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu .57 Hình 3.6 Phân bố họ enzyme tìm thấy liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu so sánh với sở liệu CAZy 62 Hình 3.7 Phân bố ORF thuộc họ enzyme GH tham gia chuyển hóa lignocellulose liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 63 xi Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại Maximum likelihood trình tự axit amin mã hóa cho cellulase từ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 66 Hình 3.9 Dự đốn tính chất protein tham gia vào trình thủy phân cellulose mã hóa gen liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 67 Hình 3.10 Kết phân tích vùng bảo thủ trình tự axit amin endoglucanase_18736 71 Hình 3.11 Kết phân tích vùng bảo thủ trình tự axit amin β-glucosidase_32768 71 Hình 3.12 Mơ hình cấu trúc protein 3D xây dựng phần mềm Swissmodel ExPASy a) Cấu trúc endoglucanase_18736 dựa theo khn mơ hình cấu trúc cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A); b) Cấu trúc khuôn cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A) 72 Hình 3.13 Mơ hình cấu trúc protein 3D xây dựng phần mềm Swissmodel ExPASy a) Cấu trúc β-glucosidase_32768 dựa theo khn mơ hình cấu trúc β-glucosidase (1vff.1.A); b) Cấu trúc β-glucosidase khuôn (1vff.1.A) 73 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET17b mang đoạn gen ngoại lai hai enzyme giới hạn HindIII NdeI 75 Hình 3.15 Hoạt tính endoglucanase_18736 (A) β-glucosidase_32768 (B) pha tan chủng tái tổ hợp 76 Hình 3.16 Ảnh hưởng chủng chủ lên trình sinh trưởng biểu enzyme tái tổ hợp 76 Hình 3.17 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy lên sinh trưởng sinh hoạt tính enzyme chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp .77 Hình 3.18 Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng sinh hoạt tính endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 79 Hình 3.19 Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng sinh hoạt tính β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 79 xii Hình 3.20 Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng biểu endoglucanase_18736 chủng tái tổ hợp 81 Hình 3.21 Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng biểu β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 81 Hình 3.22 Động thái sinh trưởng sinh endoglucanase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 82 Hình 3.23 Động thái sinh trưởng sinh β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 83 Hình 3.24 Điện di đồ SDS-PAGE (a) Zymogram (b) endoglucanase tái tổ hợp .84 Hình 3.25 Điện di đồ SDS-PAGE (a) Zymogram (b) β-glucosidase tái tổ hợp .84 Hình 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp 86 Hình 3.27 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính endoglucanase tái tổ hợp 87 Hình 3.28 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính β-glucosidase tái tổ hợp 87 Hình 3.29 Ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt tính endoglucanase_18736 88 Hình 3.30 Ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt tính βglucosidase_32768 88 Hình 3.31 Độ bền nhiệt endoglucanase_18736 khảo sát giá trị Topt pHopt 91 Hình 3.32 Độ bền nhiệt β-glucosidase_32768 khảo sát giá trị Topt pHopt 92 Hình 3.33 Khả thủy phân số loại chất endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 93 Hình 3.34 Động học enzyme tái tổ hợp 94 xiii MỞ ĐẦU Cellulase nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tương tự khác Cellulase tổng hợp cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật nguyên sinh, thực vật động vật Enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, lên men rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, ngành công nghiệp giấy bột giấy, Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt nhu cầu sử dụng nguồn lượng thay thế, tái tạo thân thiện với môi trường ngày tăng Một nguồn lượng thay quan tâm nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose Q trình chuyển hóa lignocellulose thành sản phẩm có giá trị nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cụm hóa chất kiến tạo khác thường thực điều kiện đặc biệt nhiệt độ cao, tiền xử lý kiềm axit dung môi hữu cơ… Do địi hỏi nhà khoa học phải nghiên cứu tìm kiếm cellulase mang đặc tính (như bền với nhiệt độ cao, chịu áp suất cao, chịu pH axit/kiềm, dung môi …) để đáp ứng yêu cầu trình chuyển hóa lignocellulose hạ giá thành sản xuất Một nguồn địa nhiệt thu nhận cellulase bền nhiệt nhóm vi sinh vật ưa nhiệt suối nước nóng Tuy nhiên, sử dụng phương pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật truyền thống khai thác hết tiềm vật liệu di truyền hệ sinh thái có tới 99% lồi vi sinh vật sống mơi trường lồi khơng ni cấy Hơn nữa, đặc tính riêng hệ sinh thái suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp nhiều so với mơi trường bình thường khác, việc thu nhận loài vi sinh vật để khai thác nguồn gen chúng phương pháp ni cấy thơng thường gặp nhiều khó khăn Ngày nay, nhờ tiến cơng nghệ giải trình tự gen hệ mới, việc tách dòng gen thực cách tiếp cận sở liệu metagenome kết hợp với phần mềm tin sinh để dự đốn tính chất protein tiềm trước biểu nghiên cứu đặc tính enzyme tái tổ hợp Thông qua cách tiếp cận Phụ lục 10 Chỉ tiêu hóa lý mẫu nước thu nhận từ suối nước nóng Bình Châu TT Chỉ tiêu phân tích Ký hiệu Đơn vị tính Kết phân tích Độ đục SiO2 mg/L 1,45 Mùi Cặn không tan Cặn sấy khô M Độ pH pH Độ cứng CaO mg/L 259 Clorua Cl- mg/L 1,885 Nitrate NO3- mg/L 0,4 Nitrite NO2- mg/L 0,001 10 Amoni NH4+ mg/L 0,01 11 Hydrosulfua H2 S mg/L 0,37 13 Asen As mg/L 0,001 14 Đồng Cu mg/L 0,05 15 Kẽm Zn mg/L 0,04 16 Sắt Fe mg/L 0,05 17 Fluor F mg/L 2,84 18 Iodine I mg/L 0,061 19 Phosphate PO43- mg/L - 20 Sulphate SO42- mg/L 368 21 Mangan Mn mg/L 0,09 22 Magie Mg Thối, mặn mg/L 3,8 mg/L 2,18 7,5 7,59 Phụ lục 11 Kết dự đoán tâm hoạt động denovogenes_18736 10 Phụ lục 12 So sánh trình tự axit amin domain xúc tác gen denovogenes_18736 với trình tự axit amin mơ hình domain xúc tác 1up3.1.A Phụ lục 13 Kích thước axit amin mơ hình cấu trúc protein denovogenes_18736 Chú thích: axit amin có màu xanh nhạt → đỏ: axit amin có kích thước bé → lớn 11 Phụ lục 14 Đánh giá tính kỵ nước axit amin cấu trúc bậc bậc denovogenes_18736 Chú thích: axit amin có màu xanh lam→ đỏ: kỵ nước → kỵ nước Phụ lục 15 Vị trí axit amin phân cực (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 12 Phụ lục 16 Vị trí axit amin Cystein cấu trúc bậc bậc (màu vàng) denovogenes_18736 Phụ lục 17 Vị trí proline cấu trúc bậc bậc (màu xanh tím) denovogenes_18736 13 Phụ lục 18 Vị trí axit amin deletions mơ hình (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 Phụ lục 19 Vị trí khả tích điện -, + axit amin cấu trúc protein denovogenes_18736 Chú thích: ED màu hồng: tích điện âm; HKR màu xanh tím: tích điện dương 14 Phụ lục 20 Vị trí aliphatic (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 Phụ lục 21 Vị trí aromatic (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 15 Phụ lục 22 Kết dự đoán cầu disulfide Cys cấu trúc denovogenes_18736 10 20 30 40 50 60 70 AA MLPQVAEAATRTESANNTVLVAGQTGSIVDDRLNVWTIVNGVVKKNGANAGYSARVIQLAYVNDVVWQENADHLWWSWN DB_state DB_conf 80 90 100 .110 .120 .130 .140 .150 AA GSSWDGGWGIPTSPLPQNVSSPSNNTSLTESANNSVLLAGQTGSLVDRQKDVWTIVNGVVKKNNVSAGYSARVIQLAYV DB_state DB_conf 160 .170 .180 .190 .200 .210 .220 .230 AA NGVIWQENADHLWWSWNGSSWDGGWGIPTSPLSTAVTAPAPQPQPEPEPAPAPAPTNSSNPFAGQTLYRSSWSNALNQA DB_state DB_conf + -| 240 .250 .260 .270 .280 .290 .300 .310 AA NAWRSTRPDDAAKMDYLAAQPTARWFGDWNANIQSDVSAYVGEAAAANALPVLVLYNIPFRDCGSYSAGGAGSASGYHD DB_state DB_conf + | 320 .330 .340 .350 .360 .370 .380 .390 AA WIVKVAEGIGTRKAMIVLEPDATSLDCFDDTRAAMLADAVNVLEAKPNVAVYIDAGHPDWVPAATMATRLQKSGIQNAQ DB_state DB_conf + -| 400 .410 .420 .430 .440 .450 .460 .470 AA GMALNVSNFYSTDSNMAYGNDLSSRLGGKHYIIDTARNHNGWQGEWCNPQGAGIGKAPTTNTGSALFDAGLWIKPPGES DB_state DB_conf -+ | .480 .490 .500 AA DGPCNGGPGAGSWWADYALKLYNQGTH 16 DB_state DB_conf DB_bond bond(300,343) DB_bond bond(442,478) Conn_conf 0.913818 Chú thích: AA: Trình tự axit amin; DB_state: dự đoán trạng thái liên kết disulfide (1 = liên kết disulfide, = khơng có liên kết disulfide); DB_conf: độ tin cậy dự đoán trạng thái liên kết disulfide (0 = thấp đến = cao); DB_bond: vị trí theo trình tự cặp cystein dự đoán tạo thành cầu nối disulfide; Conn_conf: độ tin cậy việc gán kết nối đưa trạng thái liên kết disulfide dự đoán (giá trị thực [0,1]) Phụ lục 23 Vị trí Ser/Thr (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 17 Phụ lục 24 Kích thước axit amin mơ hình cấu trúc denovogenes_32768 Chú thích: axit amin có màu xanh nhạt → đỏ: axit amin có kích thước bé → lớn Phụ lục 25 Đánh giá tính kỵ nước axit amin cấu trúc bậc bậc denovogenes_32768 Chú thích: axit amin có màu xanh lam→ đỏ: kỵ nước → kỵ nước 18 Phụ lục 26 Vị trí axit amin phân cực (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 27 Vị trí axit amin Cystein cấu trúc bậc bậc (màu vàng) denovogenes_32768 19 Phụ lục 28 Vị trí Ser/Thr cấu trúc (màu xanh tím) denovogenes_32768 Phụ lục 29 Vị trí proline (màu xanh tím) cấu trúc bậc bậc denovogenes_32768 20 Phụ lục 30 Vị trí axit amin deletions (màu xanh tím) mơ hình cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 31 Vị trí khả tích điện -, + axit amin cấu trúc denovogenes_32768 Chú thích: ED màu hồng: tích điện âm; HKR màu xanh tím: tích điện dương 21 Phụ lục 32 Vị trí aliphatic (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 33 Vị trí aromatic (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 22 Phụ lục 34 So sánh trình tự axit amin domain xúc tác gen denovogenes_32768 với trình tự axit amin mơ hình domain xúc tác 1vff.1.A Phụ lục 35 Sự khác biệt trình tự axit amin denovogenes_32768 (query 23187) Cen502 (query 23189) Query_23187 MEKK FPEGFYWGAXIT AMIN TSSFQTEGGIENI -DWAKGAREGRVPPIGNACDFYNRYESDFDIAIELG -HNCHRI 68 Query_23189 MKKLCLLAGVYMWGTATAXIT AMIN LQIEGAKKLCLLVPGGWKTVLDLGDVCPKACVCVQRRQRQCSLRQLSSLPSRYGVHLPTRL 80 Query_23187 69 SI EWARIEPEEGKFDEKEIEHYLQVLAXIT AMIN MRKRHI-KPFITIWHFSLPQWFADKGGFEHRDSPEIFARY 135 Query_23189 81 SYISFRGLLATYIPTWCTWSQSRG IGRIIIVKLI CLNDNIGLPFSTLYDRVLPQPLQLAVGWGNPPRIQAFVQF Query_23187 136 CGYVAQKLGNDCRHFATINEALP YTTNGWIRGSWPPFKEVPGLGWSLSHIPGHMPITMDTRWKNVLLYFRVRKNLARA 213 Query_23189 155 AETMFREFHGKIQHWHSFNEPWCTIAFVIQYVNGSCPGSDLSPDCDC -CRTSSWLA 209 Query_23187 214 HNLAYDEIKKHAFGAEVGIVHQIILFHANSNPLNQALAGCMNWFWTHSFI 263 Query_23189 210 HGLSVRRFRVLGTSGDSGIAPNVSWAVPYWHSEVDKAXIT AMIN CARTISLHSGLFLQPIFQGTIPQFLVDWFALQGGTVPIQDGD Query_23187 264 -RRVYQKCDSIGINYYLHKKFGDTAT YRKTDMNWDFYPEGICGALLMMKRYGR-PLWVAEAGIADEDD 329 Query_23189 290 MEYIGEPIDMIGINYYSMSVNRFNPVAPFLQSEEINMPLPLTDIGWPLVARAVYEVLHYLQKYGNIDIYFTENGACYNHE 369 Query_23187 330 -DQRAEYITKLIHGMWTAIQSGVDLRGYMYWSLLDNYELAHGYTKRFGLVEVNFETQERNIRPSAYVYKRII 400 Query_23189 370 VVKRAKVQVDRRISKLQQHFQLVQRTIHDRLHVKGYMACSLLDNFLRAEGYKMTFGMIVVDFRTQVRTGLESYYWYGNVL 449 Query_23187 401 ENNGLVE - 407 Query_23189 450 SNNWLETRPQSFELLG 465 23 154 289 ... dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận xác định tính chất cellulase suối nước nóng Bình Châu, Vi? ??t Nam kỹ thu? ??t Metagenomics” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thông qua kết giải trình tự DNA metagenome vi sinh. .. dụng kỹ thu? ??t 29 metagenomic, tranh vi sinh vật trở nên phong phú đa dạng hơn, nhiều loài phát Trong hệ sinh thái vi sinh vật, suối nước nóng hệ sinh thái gặp nhiều khó khăn nghiên cứu đa dạng vi. .. thời (iii) Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khai thác liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật xây dựng