Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (tóm tắt)

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm xảy sử dụng thức ăn, nước uống không bảo quản cách dẫn đến sản phẩm bị hư thối nhiễm khuẩn hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần xác định nguyên nhân nhiều trường hợp ngộ độc thức ăn vi khuẩn E coli E coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều tự nhiên, ruột người gia súc Trong đường ruột, chúng diện chủ yếu đại tràng nên gọi vi khuẩn đại tràng E coli nhiễm vào đất, nước… từ phân động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi cho phát triển chúng gây bệnh Đa số chủng E coli chủng độc hại, nhiên có vài chủng độc chủng E coli O157:H7 tìm thấy ruột phân loài gia súc, đặc biệt phân bò, chất thải bò sản phẩm thịt bò, sữa bò chưa khử trùng Các bệnh có liên quan đến E coli tiêu chảy, viêm phổi, viêm đường dẫn tiểu số bệnh khác Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thường khác nhau, nhìn chung, bệnh nhân hay có triệu chứng như: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết da, tăng huyết áp, tiêu chảy thường có máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau đến ngày Vì vi khuẩn E coli phổ biến, nên hàng năm khắp giới có người mắc bệnh vi khuẩn Các chuyên gia ước tính Mỹ năm có khoảng 70 nghìn người mắc bệnh liên quan đến E coli O157:H7 Ở Việt Nam, theo thống kê Cục Vệ sinh An tồn Thực phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 người mắc, có 3978 người phải nhập viện 51 người tử vong Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, có 4700 người mắc với 3663 người phải nhập viện 27 người tử vong Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, có 5541 người mắc với 4335 người nhập viện 34 người tử vong Như vậy, ba năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 người tử vong Trong năm 2013 nước ta xảy nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng tháng cuối năm Số liệu thống kê quý III năm 2013 cho thấy, 40 vụ ngộ độc thực phẩm 23 vụ vi sinh vật gây Chủng vi khuẩn E coli O157:H7 xác định lần Việt Nam vào năm 2005, tiếp có nghiên cứu E coli O157:H7 Trong vụ dịch gây tiêu chảy nước ta chưa tìm thấy diện chủng E coli O157:H7, nhiên vi khuẩn thuộc nhóm khác gây ngộ độc bệnh liên quan phát nhiều trường hợp Trong sinh hoạt hàng ngày, không ngoại trừ trường hợp bị nhiễm E coli O157:H7 thông qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người, động vật gia cầm Việc xác định nhanh, xác có mặt vi khuẩn E coli O157:H7 mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho người cần thiết Việc sử dụng kháng thể kháng E coli O157:H7, yếu tố quan trọng để phát E coli O157:H7 cịn chưa nghiên cứu Chính vậy, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu kỹ thuật phát chủng vi khuẩn E coli O157:H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E coli O157:H7 Nội dung nghiên cứu (i) Xác định chủng E coli O157:H7 kỹ thuật di truyền: (1) Tách dịng xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dịng xác định trình tự gen mã hóa cho độc tố Stx1, Stx2 (3) Kỹ thuật LAMP (ii) Tạo dịng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phage display; (iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7; (iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp Những điểm đề tài: (i) Tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phage display (ii) Đã sử dụng phức hợp nano-kháng thể việc phát vi khuẩn E coli O157:H7 phương pháp soi kính hiển vi Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học (i) Đánh giá phương pháp (PCR nhân gen 16S rRNA, gen độc tố kỹ thuật LAMP) việc phát phân loại chủng E coli O157:H7 (ii) Cung cấp dẫn liệu khoa học khả ứng dụng kỹ thuật phage display việc tạo protein kháng thể tái tổ hợp (iii) Đã nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen protein kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu E coli O157:H7 có nguồn gốc từ thư viện phage display 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Các kết nghiên cứu luận án cho thấy sử dụng phương pháp khác PCR nhân gen 16S rRNA, gen độc tố kỹ thuật LAMP hướng tới việc thiết kế phát triển kit phát nhanh vi khuẩn E coli O157:H7 cách đơn giản, hiệu quả, giá thành thấp, phù hợp với điều kiện Việt Nam Bên cạnh đó, việc tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu E coli O157:H7 có vai trị quan trọng việc phát triển kit phát vi khuẩn mẫu thực phẩm phác đồ điều trị bệnh liên quan đến E coli O157:H7 với độ nhạy độ đặc hiệu cao Cấu trúc luận án Luận án gồm 106 trang (kể tài liệu tham khảo), chia thành phần: Mở đầu: trang; Chương Tổng quan tài liệu: 32 trang; Chương Vật liệu phương pháp: 16 trang; Chương Kết thảo luận: 42 trang; Kết luận đề nghị: trang; Danh mục cơng trình công bố kết liên quan đến luận án: trang; Tài liệu tham khảo: 13 trang với 103 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Luận án có 12 bảng số liệu, 38 hình Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tổng kết 106 tài liệu có tài liệu tiếng Việt, 97 tài liệu tiếng Anh tài liệu Internet vấn đề: (1) Đặc điểm vi khuẩn E coli O157:H7 bao gồm nội dung: đặc điểm chung chủng vi khuẩn E coli O157:H7, độc tố Shiga-like toxin chất tác hại ,t ; (2) Các phương pháp phát xác định vi khuẩn E coli O157:H7 bao gồm nội dung: phương pháp PCR dựa DNA, kỹ thuật LAMP, sử dụng kháng thể tái tổ hợp phát vi khuẩn E coli O157:H7, p E coli O157:H7 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Vi khuẩn E coli O157:H7 cung cấp Bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQG Hà Nội - Các vật liệu khác thư viện Thực khuẩn thể Griffin.1, chủng tế bào E coli , enzyme, kháng thể, mua hãng tiếng như: Merck, Invitrogen, Sigma, Biolabs, Fermentas, Promega, nước Mỹ, Anh, Đức, Trung Quốc 2.2 Thiết bị Các thí nghiệm tiến hành trang thiết bị thuộc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen phịng Cơng Cơng nghệ Việt Nam Các thiết bị thường sử dụng như: Máy ly tâm, điện di đứng, máy Speed Vac, mua từ nhiều hãng 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng luận án thực theo Sambrook cộng (2001) có cải tiến phù hợp Một số phương pháp tiến hành theo kit hướng dẫn nhà sản xuất Gồ ứu DNA;Kỹ thuật bộc lộ thực khuẩn thể (phage display); protein; Phương pháp phân tích sử lý số liệu ứu Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN : 3.1 sưu p ng vi u n T n Griffin ng c nh Gen t gen t n ng u t LAMP a ng n ng c Stx k c ng gen 16S rRNA T o u Protein ng vi u n E Coli O157:H7 ng & n gen ng m tra T nh a c ng u Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm luận án 3.1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DNA 3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật PCR gen mã hóa 16S rRNA 3.1.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn Chủng E coli O157:H7 nuôi môi trường LB lỏng, thu sinh khối tế bào tách chiết DNA Kết điện di cho thấy hai mẫu xuất băng sáng, khơng bị đứt gẫy khơng có sản phẩm phụ chứng tỏ DNA tổng số tách chiết từ vi khuẩn E coli O157:H7 có độ tinh cao 3.1.1.2 Nhân đoạn gen mã hoá 16S rRNA Tiếp theo, gen mã hoá 16S rRNA nhân với cặp mồi đặc hiệu 16S rRNA-F/16S rRNA-R Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% (Hình 3.3) Kết hình 3.3 cho thấy, sản phẩm PCR mẫu băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,5 kb phù hợp với kích thước tính tốn lý thuyết Các băng sáng, đậm, rõ nét đủ tiêu chuẩn để tiến hành thí nghiệm Để khẳng định xem đoạn gen nhân được có phải gen mã hóa 16S rRNA hay khơng, sản phẩm PCR tiến hành tách dòng xác định trình tự Marker: Marker 1kb Mẫu 1: E coli O157:H7 số Mẫu 2: E coli O157:H7 số Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA 3.1.1.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA vào tế bào E coli DH5α Q trình tách dịng xác định trình tự gen mã hoá 16S rRNA thực cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR vào vector tách dịng pBT Sau vector tái tổ hợp pBT mang đoạn gen 16S rRNA tách chiết kiểm tra phương pháp cắt enzyme giới hạn BamHI Tiếp theo, plasmid tái tổ hợp tách chiết với số lượng lớn tinh để sử dụng cho phản ứng xác định trình tự 3.1.1.4 Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA Sau tách chiết tinh DNA plasmid, gen 16S rRNA xác định trình tự theo nguyên tắc F Sanger cộng (1981), sử dụng máy xác định trình tự tự động Đoạn gen 16S rRNA tách dịng có kích thước 1499 bp Kết so sánh trình tự với trình tự cơng bố Ngân hàng Gen Quốc tế phần mềm FASTA (http://www.ebi.ac.uk/) cho thấy trình tự nucleotide đoạn gen thu nhận có độ tương đồng cao (trên 99%) với trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn E coli O157:H7 khác Như vậy, kết luận chủng vi khuẩn nuôi cấy E coli O157:H7 Chủng E coli O157:H7 tách dịng có độ tương đồng cao với chủng E coli O157:H7 khác Ngân hàng Gen Quốc tế cao với chủng E coli O157:H7 mã số AB035923 (99,4%) So với chủng vi khuẩn khác E coli chủng WD01, AE1-2 chủng vi khuẩn E coli O157:H7 phân lập độ tương đồng khoảng 99% Trình tự gen 16S rRNA xác định đăng ký Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163 3.1.2 Tách dòng xác định trình tự đoạn gen Stx1 Stx2 vi khuẩn E coli O157:H7 3.1.2.1 Nhân đoạn gen Stx1 Stx2 Sau tách chiết DNA tổng số vi khuẩn E coli O157:H7, gen Stx1 Stx2 khuếch đại với hai cặp mồi đặc hiệu tương ứng Stx1F/Stx1R Stx2F/Stx2R Đối chứng âm vi khuẩn DH5α Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình 3.7 M: marker 1kb 1: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R E coli DH5α 2: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R E coli DH5α 3: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R E coli O157:H7 4: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R E coli O157:H7 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 Stx2 Kết điện di hình 3.7 cho thấy giếng số giếng số không xuất băng chứng tỏ E coli DH5α không mang gen độc Giếng số xuất băng có kích thước khoảng 180 bp, tương ứng với kích thước gen Stx1 theo tính tốn lý thuyết Ở giếng số có băng vạch sáng đậm có kích thước khoảng 200 bp phù hợp với kích thước gen Stx2 tính tốn theo lý thuyết Các băng sáng, đậm, rõ nét đủ tiêu chuẩn để tiến hành thí nghiệm Tiếp theo, sản phẩm PCR thu được tiến hành tách dòng xác định trình tự 3.1.2.2 Chọn dịng gen Stx1 Stx2 vector pJET1.2/blunt Sản phẩm PCR nhân hai gen Stx1 Stx2 tách dòng cách gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt, sau vector tái tổ hợp pJET1.2 mang gen Stx1 Stx2 biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Kiểm tra dòng kỹ thuật PCR với cặp mồi vector pJET1.2 Để khẳng định kết tách dòng gen Stx1 Stx2, plasmid dòng số mang gen Stx1 dòng số mang gen Stx2 tinh giải trình tự 3.1.2.3 Xác định trình tự đoạn gen Stx1 Stx2 Sau tách chiết tinh DNA plasmid, đoạn gen Stx1 Stx2 xác định trình tự Kết xác định trình tự cho thấy đoạn gen Stx1 có kích thước 150bp, đoạn gen Stx2 có kích thước 205bp Đoạn gen Stx1 Stx2 nằm tiểu phần A, tiểu phần có vai trị enzyme N-glycosidase Trình tự gen Stx Stx2 được so sánh với trình tự cơng bố Ngân hàng Gen Quốc tế phần mềm phân tích độ tương đồng BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih) Kết nhận cho thấy trình tự nucleotide thu có độ tương đồng 99% với trình tự đoạn 10 E coli O157:H7 chủng vi khuẩn gen Stx E coli khác 3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coli O157:H7 3.1.3.1 Trên gen đích có vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c đầu 3’ vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c đầu 5’ Tuy nhiên, theo nghiên cứu Maruyama số mồi tối thiểu cần để tiến hành cặp mồi BIP/FIP Do vậy, nghiên cứu này, sử dụng mồi theo nghiên cứu Maruyama nhằm làm sáng tỏ thêm vấn đề 3.1.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn DNA tổng số vi khuẩn E coli O157:H7 tách chiết làm mẫu nghiên cứu, song song với vi khuẩn E coli O157:H7, vi khuẩn E coli ATCC sử dụng làm đối chứng âm 3.1.1.2 Phản ứng LAMP Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP M: Marker 1kb 1: vi khuẩn E coli O157:H7 2: vi khuẩn E coli ATCC Trong phương pháp phát điện di gel agarose thông dụng Sản phẩm LAMP tổng hợp nhiều đoạn DNA cuộn xoắn có kích thước khác Băng nhỏ (< 250bp) tương ứng với kích thước đoạn gen nằm hai mồi Nếu 13 3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI VI KHUẨN E COLI O157:H7 3.2.1 Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 Trong nghiên cứu này, thư viện phage Griffin1 sử dụng để sàng lòng Để thu kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích (ở tế bào E coli O157:H7) từ thư viện này, cần tiến hành vịng sàng lọc Trong nghiên cứu có vòng sàng lọc, vòng 1, 2, 3, sử dụng tế bào E coli O157:H7 làm kháng nguyên vòng vòng sàng lọc loại trừ (sử dụng tế bào E coli ATCC 25922 làm kháng nguyên) Đánh giá khả gắn kết hỗn hợp phage với tế bào đích sau vịng sàng lọc đánh giá kỹ thuật ELISA Kết sau vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu chứa chủ yếu dòng phage mà kháng thể bộc lộ gắn đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157:H7 Để tạo dòng, hỗn hợp phage sau vòng sàng lọc xâm nhiễm vào E coli chủng TG1, sau 37 khuẩn lạc chứa phagemid chọn nhân lên thu phage Phage thu từ khuẩn lạc riêng rẽ dạng dòng riêng biệt sử dụng cho thí nghiệm xác định khả gắn kết với E coli O157:H7 phương pháp ELISA 3.2.2 Chọn dòng kháng thể phage đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 37 dòng khuẩn lạc sau chọn lọc tiến hành tách phage để thực phản ứng ELISA đánh giá độ gắn kết Kết nhận cho thấy tất 37 dòng phage chọn thể khả gắn với E coli O157:H7 qua phản ứng ELISA Ngoại trừ dòng phage 20 có tín hiệu ELISA cao vượt trội, dịng phage cịn lại có kết trung bình gắn đồng với E coli O157:H7 (Hình 3.17) 14 Điều chứng tỏ sau vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu chứa chủ yếu dòng phage có khả gắn với E coli O157:H7 Từ kết trên, số dịng phage có tín hiệu ELISA trung bình cao (bao gồm dịng phage 20) từ lần phản ứng ELISA trước tiến hành chọn lọc ELISA để phân tích khả gắn kết dịng phage đích E coli O157:H7 so với đối chứng âm (giếng chứa PBS) đối chứng dương (giếng chứa vi khuẩn E coli ATCC 25922) Kết xác nhận khả nhận biết liên kết đặc hiệu với tế bào E coli O157:H7 (các dịng phage cao trung bình) kỹ thuật ELISA thể hình 3.18 OD 450 Dịng phage Hình 3.17 Kết phản ứng ELISA đánh giá lực hỗn hợp phage vòng sàng lọc Hình 3.18 Kết đánh giá lực dòng phage 20 với tế bào E coli O157:H7 tế bào E coli ATCC 25922 Kết Hình 3.18 cho thấy hầu hết dịng phage chọn có tín hiệu ELISA cao so với giếng đối chứng âm đối chứng dương Đặc biệt dịng phage 20 có kết cao hẳn so với giếng đối chứng so với dịng phage cịn lại Điều nhận định kháng thể phage thu nhận có khả nhận biết liên kết đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157:H7 15 Để nghiên cứu sâu chất kháng thể phage đơn chuỗi thu nhận được, trình tự đoạn gen mã hóa kháng thể tiến hành xác định 3.2.3 Nhân gen mã hóa kháng thể PCR Dịng phage 20 nhân lên tế bào E coli chủng TG1, sau tách DNA phage để làm khn nhân đoạn gen mã hóa đoạn kháng thể phản ứng PCR với cặp mồi LABF/LABR Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% thể hình 3.19 Hình 3.19.Kết điện di sản phẩm PCR dòng 20 với cặp mồi LABF/LABR M: Marker DNA 1: Sản phẩm PCR So sánh với băng vạch biết trước kích thước thang DNA chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600bp tương ứng với kích thước gen mã hóa kháng thể theo tính tốn lý thuyết Tiếp theo, gen mã hóa kháng thể tiến hành giải trình tự 3.2.4 Giải trình tự gen mã hố kháng thể Trình tự gen mã hóa kháng thể xác định theo phương pháp F Sanger cộng sự, sử dụng máy xác định trình tự tự động Đoạn kháng thể thu nhận có trình tự amino acid suy diễn sau: MNTYCLRQPLDCYYSRPSRPWPRCSCRSTSSGGGGSGGGG SGGSALQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGYYP NWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAAL TLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGAMVFGGGTKLTVLGAAA 16 Đoạn gen mã hóa cho kháng thể có độ dài 623bp (với tỉ lệ C+G 54.98%) mã hóa cho protein kháng thể gồm159 amino acid Đoạn kháng thể thu đoạn scFv đầy đủ mà gồm toàn chuỗi nhẹ (VL) nối với phần chuỗi nặng (VH) Vùng linker nối hai đoạn chuỗi nặng chuỗi nhẹ có trình tự amino acid SSGGGGSGGGGSGGS Tính đặc hiệu kháng thể nằm vùng định tính bổ trợ (complementarity determining region, CDR), vùng tạo hình dạng vị trí gắn kết với kháng nguyên (mỗi chuỗi nặng chuỗi nhẹ chứa vùng CDR) Khi sử dụng hệ xác định Kabat (cách xác định CDR dựa trình tự kháng thể có sẵn) vùng định tính bổ trợ chuỗi nhẹ kháng thể xác định CDR1 (ASSTGAVTSGYYPN), CDR2 (STSNKHS), CDR3 (LLYYGGAMV) So sánh với trình tự protein cơng bố Ngân hàng Gen Quốc tế cho thấy trình tự amino acid phân tử protein kháng thể có độ tương đồng từ 65% đến 100% so với trình tự kháng thể cơng bố Trong trình tự amino acid protein thu nhận giống đến 98% so với trình tự vùng 4A chuỗi nhẹ globin miễn dịch dạng lambda người (Ig lambda chain V region 4A) Các phần khác hai trình tự tập trung chủ yếu vào CDR Nhằm tìm hiểu rõ cấu trúc khơng gian, phân tử kháng thể tái tổ hợp xây dựng cấu trúc 3D trang web www.sbg.bio.ic.ac.uk www.ncbi.nlm.nih.gov (Hình 3.20) Phân tích hình 3.20 thấy cấu trúc kháng thể tái tổ hợp phần kháng thể, nhiên chứa đầy đủ vùng CDR, vùng định bắt cặp kháng nguyên kháng thể Phần có mầu vàng hình 3.20A vùng bắt cặp đặc 17 hiệu với kháng thể, vùng tạo thành vùng CDR Kết so sánh cho thấy phân tử kháng thể tái tổ hợp có cấu trúc giống với vùng biến đổi chuỗi nhẹ, hình 3D xây dựng dựa cấu trúc mẫu d1f4xl1 (IgV chuỗi nhẹ Lambda) Trình tự giống đến 69% so với cấu trúc mẫu, độ tin tưở Đầu N → C: xanh → đỏ Kích thước chiều (Å): X:30.474 Y:30.140 Z:40.837 B A Vùng khoanh trịn vị trí gắn kết với kháng nguyên Hình 3.25 Cấu trúc 3D kháng thể tái tổ hợp Như vậy, cấu trúc phân tử kháng thể tái tổ hợp hoàn toàn giống với phân tử kháng thể khác Sự khác hầu hết nằm vùng CDR, vậy, giống đế 2% khác cho thấy bắt cặp đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp với kháng nguyên bề mặt vi khuẩn E coli O157:H7 Thảo luận Kỹ thuật phage display tạo kháng thể có chất hồn tồn từ người mà lại có giá thành rẻ, đơn giản nhanh chóng so với kỹ thuật khác Do vậy, việc sử dụng kỹ thuật phage display để sàng lọc đoạn kháng thể E coli O157:H7 phù hợp 18 3.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 3.3.1 3.26 Hình ảnh điện di sản phẩ M: Marker Đối với mảnh kháng thể scFv vùng định tính đặc hiệu liên kết kháng nguyên-kháng thể vùng CDR Mặt khác để làm giảm kích thước đoạn gen biểu vi khuẩn E coli đoạn gen mã hóa kháng thể vùng CDR có kích thước 405 bp tiến hành nhân nhằm tạo đầu gắn tương thích đưa vào vector biểu Đoạ ếch đại với cặp mồi biểu có gắn trình tự cắt hạn chế BamHI HindIII từ Sản phẩm PCR với cặp mồi biểu hiệ ẽ có kích thước khoả ện di kiể điện di hình 3.21 cho thấy đường chạy số ới kích thước thang DNA chuẩ 400bp, phù hợp vớ 3.3.2 Thiết kế vector pET28a TRX mang gen mã hố kháng thể ạo dịng vector TOPO PCR2.1 Tiếp theo đoạn gen kháng thể PCR với cặp mồi 157F/157R lai với vector biểu pET28a TRX Vector biểu tái tổ hợp pET28a TRX mang đoạn gen kháng thể chọn 19 dòng kiểm tra phương pháp phản ứng cắt enzyme HindIII, phương pháp PCR với cặp mồi 157F/157R kỹ Bam thuật xác định trình tự gen Đến kết luận gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7 gắn vào vào vector pET28a TRX chiều khung đọ (15,950 kDa) protein kháng thể thu sau biểu có kích thước tính tốn theo lý thuyết 30,8 kDa 3.3.3 3.23 Xác đị ằng điện di SDS-PAGE M: Marker 1: Mẫu không cảm ứ ) ứng IPTG 0,4mM ảm Để nghiên cứu biểu gen mã hoá kháng thể, vector pET28aTRX tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng thể biến nạp vào tế bào E coli chủng BL21(DE3) 50µg/ml Để kiểm tra khả biểu dòng tế bào thu được, mẫu điện di kiể ận đượ ẫu không cảm ứng (đối lự 20 3.3.4 Để hàm lượng protein kháng thể thu lớn nhất, tiến hành tối ưu nhiệt độ nồng độ thấ E coli 37 o 3.4 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 3.4.1 Trước tinh sạch, kháng thể tái tổ hợp kiểm tra độ hòa nhiệt độ 30o 37oC Kết kiểm tra cho thấ 30o 37o Để sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích chẩn đốn, protein tái tổ hợp tinh sạ 500mM Sau tinh sạch, kháng thể tái tổ hợp thẩm tích đệm PBS 4oC qua đêm đo OD280nm để xác định nồng độ Nồng độ protein thu 0,5mg/ml 3.4.2 phƣơng pháp lai blot Để xác định protein thu protein dung hợp kháng thể mang trình tự His-tag, chúng tơi tiến hành kĩ thuật lai Western blot Tiế , phản ứng Dot blot tiến hành sử dụng kháng thể tái tổ hợ E coli ẫ E coli 3.29) 21 3.29 Hình ảnh kết phản ứng Dot blot kháng thể tái tổ hợp với kháng thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam) E coli O157:H7 ậ ổ hợ ặ E coli E.coli ặ ổ hợ ồng độ dụng thí nghiệm thấ ặ E coli ặ E coli , nhiên cần đưa nồng độ tr 3.4.3 Kiểm tra hoạt tính kháng thể ELISA Bảng 3.4 Kết phản ứng ELISA xác định độ nhạy kháng thể tái tổ hợp kháng thể chuẩn OD405nm Kháng thể Kháng thể tái tổ hợp Kháng thể chuẩn (AB75244) PBS 1X 0,05 ± 1.10-6 0,048 ± 3.10-6 ATCC 0,067 ± 2,33.10-6 0,061 ± 0.000013 O157 0,59 ± 0,00026 0,78 ± 0,00079 Mẫu Để đánh giá độ nhạy kháng thể tái tổ hợp tạo với vi khuẩn E coli O157:H7, phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên vi khuẩn 22 E coli O157:H7, mẫu đối chứng vi khuẩn ATCC PBS thực (Bảng 3.4) Dựa vào kết Bảng 3.4 thấy kháng thể tái tổ hợp kháng thể chuẩn không bắt cặp với vi khuẩn ATCC bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157:H7, giá trị OD405nm đo kháng thể chuẩn cao so với kháng thể tái tổ hợp Kết chứng tỏ kháng thể chuẩn có độ đặc hiệu cao kháng thể tái tổ hợp Để khẳng định sai khác hai giá trị trung bình hai loại kháng thể với vi khuẩn E coli O157:H7 có ý nghĩa hay không, hàm T- test với số mẫu n= sử dụng để kiểm tra Sau xử lý số liệu phần mềm Excel, giá trị trung bình đo OD bước sóng 405nm kháng thể tái tổ hợp 0,59 ±0,00026 kháng thể chuẩn 0,78±0,00079 Với hàm T-test kiểm tra chiều thu mức α= 0,01 (với độ tin cậy 99%) t = 27,428 > t0,01= 9,92 Như vậy, sai khác giá trị trung bình hai mẫu có ý nghĩa Hay nói cách khác, độ đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp tạo có lực thấp so với kháng thể chuẩn Hãng Abcam 3.4.4 h tính tái Hình 3.30 Hình ảnh phức kháng thể- silica bắt tế bào E coli O157:H7 Các điểm sáng màu xanh vi khuẩn E coli O157:H7 bắt phức kháng thể- silica soi độ phóng đại 60X kính hiển vi 23 Các hạt nano silica gắn kháng thể tái tổ hợp, sau phức hợp silica-kháng thể nhuộm với vi khuẩn E coli O157:H7 với đối chứng sử dụng vi khuẩn ATCC chụp ảnh kính hiển vi điện tử độ phóng đại 60X (hình 3.30) Kết hình 3.30 cho thấy soi phức kháng thể-silica liên kết với vi khuẩn E coli O157:H7 có nhiều điểm phát quang trường kính Điều chứng tỏ có nhiều kháng thể bám vào vi khuẩn E coli O157:H7 Thí nghiệm tiến hành song song với đối chứng vi khuẩn ATCC, nhiên kháng thể không bám vào vi khuẩn này, dẫn tới vi khuẩn không phát quang khơng quan sát kính hiển vi ận Kháng thể tái tổ hợp phage scFv scFv tự đo đặc hiệu với E coli O157:H7 tạo có lợi phân tử có chất người hồn tồn Kháng thể scFv có chất kháng thể đơn dịng, có đầy đủ khả ứng dụng giống kháng thể đơn dòng khác: dùng nghiên cứu, chẩn đoán điều trị bệnh Đặc biệt hơn, kháng thể scFv sản xuất nhanh chóng, dễ dàng vào có giá thành rẻ việc ứng dụng chúng đơn giản nhiều Kháng thể tái tổ hợp scFv đặc hiệu E coli O157:H7 tạo dễ dàng thực phản ứng chẩn đốn xác vi khuẩn E coli O157:H7 mẫu nghiên cứu mẫu thực phẩm kỹ thuật Dot blot, Western blot, ELISA Với kháng thể scFv tái tổ hợp tạo ra, hy vọng kháng thể sử dụng để tiến hành nghiên cứu xa hơn, giúp chẩn đoán điều trị bệnh liên quan tới vi khuẩn E coli O157:H7 24 KẾT LUẬN Đã tách dòng xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn E coli O157:H7 Việt Nam với kích thước 1,5kb Trình tự 16S rRNA đăng ký Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163 Đã tách dịng xác định trình tự hai đoạn gen Stx1 Stx2 từ vi khuẩn E coli O157:H7 Đoạn gen Stx1 Stx2 có kích thước tương ứng 151 205bp Trình tự nucleotide hai đoạn gen có độ tương đồng 99% so với trình tự gen Stx chủng E coli O157:H7 khác Đã ứng dụng phản ứng LAMP gen Stx2 để xác định vi khuẩn E coli O157:H7 với cặp mồi loop FIP/BIP, nồng độ DNA 93,5pg/µl 25 phút Sản phẩm phát điện di nhuộm chất nhuộm màu phát quang phage mang đoạn gen mã hóa kháng thể scFv có khả nhận biết liên kết với tế bào E coli O157:H7 Biểu đoạn gen mã hóa kháng thể scFv vector biểu pET28a-TRX vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Kháng thể tái tổ hợp dạng dung hợp với TRX có trọng lượng phân tử khoảng 30,8 kDa Tính đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp kiểm tra phương pháp Western Blot, Dot blot ELISA Bước đầu sử dụng phức hợp nano-kháng thể việc phát E coli O157:H7 phương pháp soi kính hiển vi KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng phức liên hợp nano-kháng thể việc phát vi khuẩn E coli O157:H7 Tạo kit xác định vi khuẩn E coli O157:H7 mẫu thực phẩm phân tích dựa kháng thể tái tổ hợp 25 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN HOÀNG PHÚ HIỆP Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 26 Công trình hồn thành Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Quang Huấn PGS TS Nguyễn Bích Nhi Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Thái Nguyên họp tại: ………………………………………………………… ……… 27 LIÊN QUAN ĐẾN C Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Giang, Lê Quang Huấn (2011) Tách dòng xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Tạp chí Dinh dưỡng Thực phẩm, 7(2):77- 81 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2011) Tách dịng xác định trình tự gen Stx1 Stx2 vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (1): 107- 111 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2011) Sử dụng thư viện scFv nghiên cứu tạo dòng gen kháng thể kháng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Tạp chí Y học thực hành, (8): 434- 437 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2012) Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) - Hướng việc tạo kit phát nhanh bệnh truyền nhiễm, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 90 (02): 43- 49 Hồng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2012) Phát triển kỹ thuật LAM (Loop- mediated isothermal amplification) cho việc phát nhanh xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Tạp chí Sinh học, 34(3): 343- 346 Cơng bố 01 trình tự gen 16s rRNA Ngân hàng gen quốc tế Hoang, H.P and Le, H.Q (2011) Escherichia coli O157:H7 16S ribosomal RNA gen, partial sequence, EMBL, GenBank, Accession HQ658163 ... ? ?Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu kỹ thuật phát chủng vi khuẩn E coli O157:H7 tạo kháng. .. tính đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp Những điểm đề tài: (i) Tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phage display (ii) Đã sử dụng phức hợp nano -kháng thể việc phát. .. Stx2 (3) Kỹ thuật LAMP (ii) Tạo dịng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phage display; (iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7;