Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomanas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomanas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Hồng Vân - Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Kỹ sư Đặng Văn Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tác giả

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn

là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

MỤC LỤC

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BẢNG x

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1.1 XẠ KHUẨN 3

1.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4

1.2 ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN 5

1.2.1 Đặc điểm hình thái 5

1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn 6

1.2.3 Sự sinh trưởng và phát triển 8

1.2.4 Sự hình thành bào tử 9

1.2.5 Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11

1.3 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP 13

1.3.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13

1.3.2 Phân loại và định tên xạ khuẩn 13

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH 18

1.4.1 Phương pháp hấp phụ 18

1.4.2 Một số chất hấp phụ 19

1.4.3 Một số chất nhả hấp phụ 21

1.5 BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA 22

1.5.1 Thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với cây lúa 22

1.5.2 Biểu hiện của bệnh bạc lá trên lúa 23

1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa 24

1.5.4 Cơ chế gây bệnh 24

1.5.5 Sử dụng xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa 25

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 VẬT LIỆU 26

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Thiết bị 26

2.1.4 Môi trường 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Bảo quản giống 27

2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học 28

2.2.3 Xác định sinh khối 29

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh 29

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện lên men 30

2.3 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH CÓ TRONG DỊCH LÊN MEN 31

2.3.1 Đánh giá khả năng hấp phụ chất kháng sinh trên các chất hấp phụ 31

2.3.2 Xác định nồng độ chất hấp phụ 31

2.3.3 Thử các dung môi nhả hấp phụ chất kháng sinh 31

2.3.4 Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ 31

2.3.5 Xác định tỷ lệ các thành phần của hỗn hợp dung môi 32

2.3.6 Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 32

2.4 ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 32

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH 33

3.1.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn 33

3.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 34

3.1.3 Khả năng đối kháng trong môi trường dịch thể 37

3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN TB 5.4

38

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 38

3.2.2 Đặc điểm hình thái bào tử 41

3.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa 42

3.3.NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces oligocarbophilus TB5.4 47

3.3.1 Lựa chọn môi trường nhân giống và môi trường lên men 47

3.3.2.Ảnh hưởng của nguồn cacbon thay thế 48

3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 49

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S oligocarbophilus TB5.4 50

3.3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S oligocarbophilus TB5.4 50

3.3.6 Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ở chủng S oligocarbophilus TB5.4 51

3.3.7.Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S oligocarbophilus TB5.4 52

3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN CỦA CHỦNG S oligocarbophilus TB5.4 53

3.4.1 Đánh giá khả năng của kháng sinh trên các chất hấp phụ 53

3.4.2 Xác định nồng độ than hoạt tính 54

3.4.3 Nghiên cứu nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính 55

3.4.4 Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ tốt nhất 56

3.4.5 Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung môi sử dụng cho quá trình nhả hấp phụ chất kháng sinh 57

3.4.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến tính chất hoá lý của chất kháng sinh từ chủng S oligocarbophilus TB5.4 58

3.5 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH SAU LÊN MEN CỦA CHỦNG XẠ

KHUẨN S oligocarbophilus TB5.4 ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA THÓC

60

3.5.1.Ảnh hưởng của dịch kháng sinh thô đến khả năng nầy mầm của hạt 60

3.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch sau lên men đến quá trình nảy mầm của hạt 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 65

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 65

DNA Deoxyribonucleic acide

RNA Ribonucleic acide

CSBT Cuống sinh bào tử

BMBT Bề mặt bào tử

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biểu hiện của lá lúa bị khi bị nhiễm bệnh bạc lá

Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae

Hình 3.1 Vòng đối kháng chủng vi khuẩn X oryzae 020 được tạo ra bởi các chủng

xạ khuẩn bằng phương pháp cục thạch

Hình 3.2 Hoạt tính kháng chủng lại chủng vi khuẩn X oryzae 020 từ dịch sau lên

men của các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng TB5.4 trên môi trường ISP4 sau 7

ngày nuôi ở nhiệt độ 28 C

Hình 3.4 Hình dạng chuỗi và bề mặt bào tử chủng TB5.4 (x 15.000)

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng

sinh của chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng

sinh của chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4

Hình 3.7 Nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính với các dung môi

Hình 3.8 Định tính chất kháng sinh tách chiết và hệ số Rf có trong dịch sau lên

men của chủng S.oligocarbophilus TB5.4 bằng sắc ký giấy

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ngâm ủ đến khả năng nảy mầm của hạt

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Sự phân bố theo nhóm màu của xạ khuẩn

Bảng 3.2 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn

Bảng 3.3 Khả năng đối kháng của dịch sau lên men của các chủng xạ khuẩn với

các chủng vi sinh vật kiểm định đối

Bảng 3.4 Đặc điểm nuôi cấy của chủng TB5.4 sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ

28 C

Bảng 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc của chủng TB5.4 trên một số môi trường

Bảng 3.6 Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng TB5.4

Bảng 3.7 Khả năng đồng hoá đường của chủng TB5.4

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của chủng TB5.4

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng TB5.4

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng TB5.4

Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TB5.4 với chủng chuẩn

Streptomyces oligocarbophilus

Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S oligocarbophilus

TB5.4 trên một số MT lên men

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới hoạt tính kháng sinh của chủng

S.oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới hoạt tính kháng sinh của chủng S

oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất

kháng sinh của chủng S oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh

của chủng S oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

của chủng S oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.18 Khả năng hấp phụ của chất kháng sinh có trong dịch sau lên men của

chủng S oligocarbophilus TB5.4 trên một số chất hấp phụ ở các pH

khác nhau

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ than tới khả năng hấp phụ kháng sinh trong

dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.20 Khả năng nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính bằng các dung

môi khác nhau

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của pH và thời gian đến quá trình nhả hấp phụ chất kháng

sinh có trong than hoạt tính

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nước lên quá trình nhả hấp phụ chất

kháng sinh từ than hoạt tính

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng sinh

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng sinh

Bảng 3.25 Hệ số Rf của chất kháng sinh có trong dịch sau lên men của chủng

S.oligocarbophilus TB5.4

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt thóc

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy S oligocarbophilus TB5.4: X

oryzae 020 (v/v) đến khả năng nảy mầm của hạt thóc

và phòng trừ dịch bệnh, bảo vệ thực vật nhờ khả năng ức chế các vi sinh vật gây hại một cách chọn lọc Chất kháng sinh thu nhận từ vi sinh vật dễ phân giải trong điều kiện tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường

Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm sinh vật có tiềm năng lớn Trong số, khoảng 9000 chất kháng sinh hiện được biết trên thế giới thì có khoảng 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ tác động rộng, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật khác nhau Xạ khuẩn có nhiều trong đất, sử dụng các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tạo chế phẩm sinh học nhằm ức chế các nhóm vi sinh vật gây bệnh có trong đất góp phần hạn chế các bệnh có thể gây ra đối với cây trồng

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra được phát hiện đầu

tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm 1884-1885 Bệnh phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là châu Á (Nhật Bản, Trung quốc, philippin, Ấn Độ, ) Ở nước ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa cũ nhưng đặc biệt

từ năm 1965-1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa Nước ta là một nước nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển Do đó, có thể tìm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh quý, trong đó có kháng sinh chống lại vi

khuẩn Xanthomonas oryzae đây là tác nhân gây bệnh bạc lá Vấn đề đặt ra là làm

sao để sản xuất ra những chế phẩm sinh học có khả năng diệt vi khuẩn

Xanthomonas oryzae trong phòng trừ bệnh bạc lá lúa phục vụ sản xuất nông nghiệp

Với mục đích đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng

sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa”, bao gồm các nội

dung chính sau:

1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng chủng

vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa từ các mẫu đất thu thập tại

Nam Định và Thái Bình

2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, phân loại đến loài chủng xạ khuẩn

3 Nghiên cứu một số điều kiện lên men, tách chiết và một số tính chất hoá lý của chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh ra

4 Bước đầu đánh giá ảnh hưởng của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn tuyển chọn đối với sự nảy mầm của lúa

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 XẠ KHUẨN

1.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomycetales) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố

rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong các cơ chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm mốc không phát triển được [3] Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp đất bề mặt, số lượng không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giầu dinh dưỡng và lớp đất trên bề mặt (đến 40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Số đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất canh tác thường đạt tới hàng triệu mầm

xạ khuẩn, đất hoang hoá chỉ có 10-100 nghìn mầm Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [6, 28]

Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh nhưng có thể kí sinh trên thân cây, ở củ và rễ cây Một số nghiên cứu cũng cho thấy

sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophila, A

mortivalis và A iraquensis, Streptomyces như S antibioticus (MU106, MU107) và

S rimosus (MU114) [15,16, 33] hoặc trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng

thủy sản đặc biệt là ở lớp bùn, xác các hợp chất hữu cơ lắng đọng nhiều

Ngoài ra, pH của môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự phân bố của xạ khuẩn, thường thì trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm, mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các môi trường có độ pH quá cao hoặc quá thấp Xạ khuẩn thường hoạt động ở pH cao hơn so với nấm [6]

Xạ khuẩn được nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên: tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, trong nước, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Bên cạnh đó chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng

nên đã được dùng để sản xuất nhiều loại enzim như proteaza, amilaza, xenlulaza, glucoizomeraza, vitamin và các axít hữu cơ [3] Do có các loại enzim này nên chúng cũng có khả năng phân giải các hợp chất bền vững như kitin, xenluloza, lignin… Một đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh 60-70% xạ khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn [17] Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng đất kiềm, đất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài đồng ruộng Một số

xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ

đậu và có khả năng cố định Nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây Các

chủng Streptomyces spp sinh độc tố phytotoxin ảnh hưởng lớn tới mùa vụ, do

chúng có thể tồn tại trong đất trên 10 năm [3, 6]

1.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới

Trước đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà vi sinh học do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống nấm Trước thế kỉ 19, xạ khuẩn được xếp vào nhóm nấm Về sau, khi đã nghiên cứu sâu hơn người ta đã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn như:

- Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium

- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

- Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với vi khuẩn Đồng thời xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn

- Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể

- Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen

- Xạ khuẩn chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa xenluloza

- Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của môi trường, đặc điểm này không có ở nấm

- Các đặc điểm về sợi và nang bào tử lớn (sporangium) của chi Actinoplanes

cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

Từ những đặc điểm trên (về nhân nguyên thuỷ, kích thước nhỏ bé ) nên

người ta đã xếp xạ khuẩn vào nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria)

Vị trí của nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) được xác định như sau: Năm

1978, Gibbbens và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 4 ngành là

ngành Gracilicutes (gồm các vi khuẩn Gram âm), ngành Tenericute (gồm xạ khuẩn

và các vi khuẩn Gram dương), ngành Mendosicutes gồm các vi khuẩn không chứa Peptidoglican trong thành tế bào, và ngành Mollicutes gồm các vi khuẩn chưa có

thành tế bào

Năm 1977 và 1980, Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành

2 giới là giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tương đương với 3 ngành Gracilicutes,

Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ

(Archaebacteria) (tương đương với ngành Mendosicutes)[3]

Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478

loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi

còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm

1.2 ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt Trên môi trường đặc xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và điều kiện hoàn cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men

mà thường có dạng thô ráp, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”)

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc (dùng que cấy không di được khuẩn lạc của xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu trong thạch) Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm vì khuẩn ty của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8µm; khuẩn ty khí sinh 1,14µm), đường kính khuẩn ty nấm có thể lớn hơn 10 lần đường kính khuẩn ty của xạ khuẩn [3]

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Các sản phẩm trong qúa trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ… được tích lũy trong mỗi lớp khác nhau Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại và điều kiện ngoại cảnh Có loại xạ khuẩn có thể tạo sắc tố tan trong môi trường nuôi cấy, thường gặp các loại mang màu: xanh, tím, đỏ, da cam, vàng, lục, nâu và đôi khi màu đen Có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [3, 6, 34]

1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể

đơn bào, không có nhân thực (procariotic) và có kích thước giống vi khuẩn Cấu

trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài mặt môi trường thạch tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium) cắm sâu vào môi trường để lấy nước và thức ăn Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp phát triển từ các bào tử nảy mầm Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ

chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh Khuẩn

ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí và thường phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử Loại khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty nấm mốc, và có đường kính thay đổi trong khoảng từ 0,2-1,0µm đến 2-3µm Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không

có vách ngăn và không tự đứt đoạn Một số xạ khuẩn có bao sợi là một bao mỏng bọc bên ngoài khuẩn ty khí sinh, có thể thấy rất rõ khi phân hoá thành bào tử [3]

* Màng tế bào xạ khuẩn khá phức tạp: gồm có thành tế bào và màng tế bào:

- Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20nm,

có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hoá học người ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:

Nhóm CW I: Có chứa L, L-DAP và Glixin (Streptomyces,

Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides)

Nhóm CW II: Có chứa mezo-DAP và Glixin

Nhóm CW III: Có chứa mezo-DAP

Nhóm CW IV: Có chứa mezo- DAP, arbinoza và galactoza [3, 29]

Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu chia thành 3 lớp: lớp ngoài dày 60-120Å, khi già có thể dày tới 150Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50Å và lớp trong dày 50Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glucopeptit gồm các gốc N-axetylglucozamin liên kết với N-axetylmuzamic bởi liên kết 1,4-glucozit Khi xử lý bằng lizozim các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá huỷ và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần (protoplast) Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử

lý bằng hỗn hợp eter, clorofoc và các dung môi hoà tan lipit Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenluloza hay kitin [3, 6, 13]

Đối với xạ khuẩn phân lập từ vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dày và

độ bền cơ học cao để có thể chống chịu với môi trường khắc nghiệt bên ngoài (nồng độ muối trung bình 3-4%, pH 6,8 - 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20-35 C) Ở

pH trung tính và kiềm như ở biển, so với xạ khuẩn trung tính, thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptitdoglycan còn chứa nhiều polyme axit như là axit galacturonic, axit gluconic, axit glutamic, axit asparic và axit photphoric Với điện tích âm tạo bởi thành phần axit không thuộc peptidoglican, bề mặt tế bào có thể hấp thụ được ion Na+

và H+ trong khi đẩy ion OH- Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptitdoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khác

nhau về thành phần các hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesosamin và axit amin [25]

- Màng tế bào chất nằm dưới lớp thành tế bào, dày 7,5-10,0 nm Chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2 thành phần là photpholipit và protein; màng chứa nhiều enzym có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình vận chuyển và trao đổi chất qua màng [6]

* Thể trung gian (mezoxom) nằm ở phía trong màng tế bào chất, có hình

phiến, hình bọng hay hình ống Công dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và do đó tăng cường hoạt tính enzim, tăng chuyển điện tử [3]

* Các vật thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt

poliphotphat (hình cầu, bắt mầu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polisaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [3]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân của “vi khuẩn”, nhưng khác với nhóm vi sinh vật không có nhân thực khác là

tỉ lệ G+C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 - 40%

Một trong những đặc điểm đáng lưu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này gây ra một số hiện tượng kì lạ khác: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng [3, 6, 23]

1.2.3 Sự sinh trưởng và phát triển

Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử Một đoạn khuẩn ty (mầm xạ khuẩn) hoặc 1 bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1-2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ genome và tiến hành tổng hợp protein và như vậy hình thành khuẩn ty sơ cấp Đầu khuẩn ty sơ cấp kéo dài và phát triển theo phương pháp mọc chồi phân nhánh Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng 11µm/1giờ và “nhân” của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [6]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng Chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh

bột, rượu, axit hữu cơ, polysacarit, lipit, axit amin, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrat, muối amon…, nitơ hữu cơ: pepton, protein, cao ngô, cao nấm men… Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng

xạ khuẩn khác nhau là khác nhau Phần lớn chúng là các vi sinh vật ưa khí và ưa

ẩm Xạ khuẩn ưa nhiệt thường ít gặp, phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm [6]

Trong môi trường dịch thể, quá trình sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn chia làm 4 pha:

- Pha lag: sinh khối tăng không đáng kể

- Pha log: lượng sinh khối tăng theo hàm log, ở cuối pha này có sự tổng hợp các sản phẩm bậc hai như chất kháng sinh

- Pha cân bằng: ở pha này sinh khối không tăng, hầu hết lượng dinh dưỡng còn lại trong môi trường đều được sử dụng cho việc tổng hợp chất kháng sinh

- Pha suy tàn: sinh khối giảm nhanh, lượng chất kháng sinh cũng giảm

Tế bào xạ khuẩn phân chia theo kiểu amitoz (phân bào vô sắc) - đó cũng là tính chất đặc trưng của vi khuẩn Thời gian phân đôi tế bào ở xạ khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng khoảng 90 phút (trong khi đó ở vi khuẩn là 20-40 phút) [6]

tự bó sợi của nấm

Cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) mang bào tử kín spores) nằm trong túi (nang) bào và bào tử di động [3]

(sporangio-Hình thái, kích thước của cuống sinh bào tử và bào tử là một đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng (R) hay hơi cong (F), dạng xoắn lò

so (kí hiệu S) xoắn đơn giản hình móc câu (RA) Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số vòng khác nhau Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hoặc ngắn với các dạng lông cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài Những đặc điểm này rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức sau:

- Phương thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra các thành của bào tử

- Phương thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa

màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty Trường hợp này gặp ở Planomonospora

- Phương thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia

vào quá trình hình thành bào tử Trường hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [3]

- Hình thái bảo tử cũng là một đặc điểm quan trọng trong định tên xạ khuẩn Bào tử trần (conodiospore) của xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hình trụ Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bào tử trần được hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai phương thức khác nhau:

- Vách ngăn hình thành dần từ phía trong của màng tế bào và tiến dần vào trong tạo ra những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó sợi bào tử mới phân cắt thành các bào tử trần

- Thành tế bào và màng tế bào đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía trong làm cho sợi bào tử phân cắt, đồng thời tạo thành chuỗi bào tử trần [3]

Muốn kích thích hình thành bào tử, trước hết phải kích thích sự sinh trưởng

của khuẩn ty khí sinh Ví dụ khi nghiên cứu 6 chủng S griseus, Kalakoutski và

Agre (1973) nhận thấy muốn kích thích khuẩn ty khí sinh nên sử dụng các môi trường có bổ sung pepton, NaCl và glixerin Một số tác giả khác cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trường cũng kích thích quá trình hình thành bào tử ở

xạ khuẩn Tuy nhiên việc bổ sung các nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định Môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng

sẽ kích thích hình thành bào tử ở xạ khuẩn còn môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Độ ẩm và nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử [6]

Ở các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh thuộc chi Streptomyces, khả

năng sinh kháng sinh liên quan đến sự hình thành bào tử được thể hiện rất rõ Trong nhiều trường hợp khi kích thích hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh giảm đi Khi nghiên cứu đột biến và chọn lọc chủng xạ khuẩn sản xuất oxytetraxylin và streptomyxin người ta nhận thấy nếu sự hình thành bào tử kém thì khă năng sinh tổng hợp kháng sinh lại tăng Đây cũng là đặc điểm cần lưu ý khi nghiên cứu chọn lọc các chủng có hoạt tính cao Như vậy, sự hình thành bào tử và khả năng sinh kháng sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24]

1.2.5 Sinh tổng hợp chất kháng sinh

Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này Trong số 9000 chất kháng sinh đã

được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces là

chi quan trọng nhất trong nhóm xạ khuẩn, với trên 500 loài đã được miêu tả Chi này có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh, một trong số các kháng sinh rất

quan trọng là Streptomycin do S griseus sinh ra Khả năng sinh chất kháng sinh là

kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hoá của xạ khuẩn [17]

Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thường được hình thành ở cuối pha sinh trưởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn [12]

Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, người ta thường mô tả hai pha: pha sinh trưởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồng nhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp (idiophase): sinh trưởng chậm lại đôi khi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và

sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh [6, 16] Cũng có tác giả chia sự phát triển của giống thành 4 hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá tế bào Trong một số trường hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh trưởng như trường

hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp SA 103 phân lập từ Sahara của Algeria,

sinh kháng sinh mutactimycin PR (Anthracycline mới) Quá trình tương tự cũng đã

thấy ở chủng Saccharothrix sp SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S

clavuligerus sinh axit clavulanic [12,30]

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng

đa dạng nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng dường như theo một số con đường nhất định Các con đường này chỉ là sự cải biên các con đường sinh tổng hợp của tế bào Các vật liệu ban đầu của của qúa trình chuyển hoá chất trao đổi bậc hai (chất kháng sinh) là những chất trao đổi sơ cấp Chất kháng sinh được tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùng hợp các hợp chất bậc nhất rồi biến đổi chúng bằng các enzim Mọi con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh đều

có sự tham gia của các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt Các enzim này được

mã hoá bởi các gen nằm trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể hoặc trên

plasmit Ví dụ tổng hợp chlotetraxyclin ở S aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay

hệ thống gen) tham gia: hệ thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển glucoza thành axetyl-CoA; hệ thống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ thống 3 chuyển malonyl CoA thành chlotetracyclin Tổng số gen ở 3 hệ thống liên quan tới tổng hợp chlotetracyclin lên tới 2000 gen [16,31,32,35]

Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1 loại kháng sinh có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi

1 loại vi sinh vật tạo ra nhiều loại kháng sinh khác nhau [31, 32] Ví dụ, có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể tổng hợp được kháng sinh oxytetraxyclin, hay

Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng hợp được oxytetracylin và rimicidin

Ngày nay số lượng chất kháng sinh được sản xuất từ xạ khuẩn tăng lên đáng kể, rất nhiều trong số đó đã được sản xuất ở quy mô thương mại, có ý nghĩa lớn trong y học và mang lại nhiều lợi nhuận

1.3 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP

1.3.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Nhu cầu về các chất kháng sinh sử dụng trong nông nghiệp hiện nay rất lớn

do sự xuất hiện của nhiều tác nhân gây bệnh mới, cùng với hiện tượng kháng thuốc kháng sinh ngày càng phổ biến Việc tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh trên cây trồng sẽ giúp hạn chế thuốc hóa học mà vẫn có tính an toàn cao [31,32,33]

Một trong những chính sách nhằm tách và tinh sạch các chất kháng sinh mới với mong muốn là khám phá các hệ sinh thái đặc biệt, như ở tầng nước sâu, vùng biển có nồng độ muối cao hay vùng khí hậu khô cằn Từ năm 1975 đến 1994, một

số loài xạ khuẩn mới đã được phân lập và mô tả như Actinopolyspora halophila,

Actinopolyspora mortivalis và Actinopolyspora Trong nỗ lực tìm kiếm những chất

kháng sinh mới, gần đây các nhà khoa học đã phân lập được một chủng xạ khuẩn kí

hiệu Actinopolyspora AH1 ở Alibag, một vùng biển ở phía tây Ấn Độ Chủng này thuộc chi Actinopolyspora, có đặc điểm ưa mặn (sinh trưởng ở nồng độ muối 8-

15%w/v) và sinh trưởng tối ưu ở pH 7,6 Chủng này khác với tất cả các chủng

trong chi Actinopolyspore đã được mô tả trước đây nên được coi là một chủng mới [15, 20] Năm 1928, Fleming tình cờ phát hiện ra nấm Penicilium sinh kháng sinh

penicilin Nhưng ngày nay, cũng như các loại vi sinh vật sinh chất kháng sinh khác,

xạ khuẩn được tìm ra theo quy trình tuyển chọn có hệ thống và cân nhắc kỹ lưỡng, thường tuân theo sơ đồ nhất định

Tuy nhiên, hiếm khi phân loại được một chủng từ tự nhiên có khả năng sinh kháng sinh cao đạt yêu cầu cho sản xuất thương mại, do đó công việc tuyển chọn giống luôn gắn liền với những thành tựu của di truyền học và đặc biệt là các phương pháp làm đột biến lí hoá, kỹ thuật khuếch đại gen nhờ plasmit Kết quả của những nghiên cứu cơ bản này đã giúp cho việc lựa chọn những giống có hoạt lực cao trong các điều kiện nuôi cấy ổn định và hình thành quy trình công nghệ áp dụng trong sản xuất có quy mô rộng lớn [1, 9]

1.3.2 Phân loại và định tên xạ khuẩn

Trong số xạ khuẩn đã được đặt tên thì Actinomyces Hart là loài lâu đời nhất

Actinomyces israeli được coi là chủng xạ khuẩn kị khí thuần chủng đầu tiên (1889),

vì trước khi phát triển phương thức giữ giống đông khô thì khó có thể bảo quản vi sinh vật lâu dài và nhiều chủng giống đã bị thất lạc Do vậy không có chủng xạ khuẩn nào được tìm ra sớm hơn các chủng mà Waksman phát hiện và lưu trong danh mục Bộ sưu tập giống của ông (1916-1919) Cho đến nay, có thêm rất nhiều chủng xạ khuẩn được lưu trong danh mục giống xạ khuẩn [6, 14]

Ba phương pháp phân loại xạ khuẩn là phương pháp phân loại truyền thống, phương pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử và phân loại số

a) Phương pháp phân loại truyền thống

Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lí và coi đó

là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi

Actinomyces Waksman và Curtis (1916), Waksman (1919) đã đề cập đến những

dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái của bào

tử là đặc tính quan trọng của các cá thể Do vậy họ đã đưa ra một số loài mới có ý nghĩa Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931) – 2 loài, Dunche (1934) – 13 loài Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ

năm 1936 và đến năm 1953 công bố một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên

cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau [11] Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một số hệ thống phân loại và đến năm 1961 có sửa đổi [36] Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc

chi Streptomyces Krassilnikov là một trong những chuyên gia nổi tiếng về nghiên

cứu và phát triển khoá phân loại xạ khuẩn Từ năm 1941 đến năm 1949 ông đã phát triển 38 loài mới Năm 1970, ông lại công bố hệ thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949 Trong đó xạ khuẩn được phân chia thành 6 họ, gồm 26

chi Theo ông Actinomyces được dùng như một tên gọi chung cho những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác hoạ năm 1943 [14]

Một số nhà nghiên cứu người Đức (Flaig và cộng sự, 1952; Flaig và

Kutzner, 1954; Kuster và Geiuz, 1955) cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn

Lần đầu tiên họ sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi

này Kutzner đã phát triển một khoá phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình

dáng cuống sinh bào tử, cấu trúc hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo thành sắc tố tan, hoạt phổ kháng khuẩn và một số đặc điểm sinh lí khác [18]

Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử Hệ thống này cũng được chỉnh lý và tái bản năm 1983 Số lượng

hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây (Praceser, 1968; Kuster, 1972; Pridham, 1974; Arai; 1969; Nonomura, 1974; Szabos, 1965…) Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hính thái và tính chất nuôi cấy Hình thức này hiện nay vẫn đang được sử dụng phổ biến

b) Phương pháp phân loại sinh học phân tử

Ngày nay nhờ sự phát triển cao của kỹ thuật, phương pháp phân loại phân tử

đã được sử dụng vào phân loại xạ khuẩn Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay người ta vẫn dùng 3 phương pháp chính: lai ADN, lai ARN và phân tích rARN 16S [37, 38] Kết quả được biểu hiện bằng số phần trăm sự đồng nhất (homology) Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN Phân tích rARN 16S để liệt kê thứ tự các nucleotit đặc trưng của cá thể và so sánh với bảng liệt kê của cơ thể khác để xác định mức độ giống nhau của chúng Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng

để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%

Bằng phương pháp phân loại này, những kiến thức về phân loại cũng có

nhiều thay đổi Ví dụ các nhà phân loại cho rằng chi Nocardia dị nhân (heterogeneous), nên về mặt di truyền đã xếp loài Nocardia mediterranci sinh rifamixin vào chi Streptomyces và mang tên mới là S mediterranci; hợp nhất hai

chi Streptomyces và Streptoverticillium vào một chi Streptomyces hoặc chuyển loài

Nocardia erythropolis vào chi Mycobacterium (mang tên mới M rodochrous) [23]

Vì số lượng các loài xạ khuẩn mới được mô tả ngày càng nhiều và để việc phân loại nhanh, chính xác về di truyền phân tử, người ta đã sử dụng phương pháp phân loại số (dùng máy vi tính) cũng như đưa thêm các đặc điểm phân loại và phát sinh chủng loại

c) Phân loại số (Numerical taxonomy)

Phân loại số đã được Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi

Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi Phương pháp này dựa trên sự đánh giá

về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hoá Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phương trình sau:

%S =

d s

s

N N

x

N 100

Trong đó: Ns – Tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh

Nd – Tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia

Kết quả phân tích số được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tuỳ theo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster) [26, 27] Bằng

phân loại số, người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm

nhỏ và 13 cụm với những đại diện duy nhất Trên cơ sở nhận được, người ta đưa ra thuật toán học để xác định những chủng xạ khuẩn chưa biết Mặc dù nguyên tắc là giảm số lượng các đặc điểm, nhưng cũng còn tới 139 đặc điểm đã được sử dụng trong phân loại số [10, 21, 23]

Cả ba phương pháp phân loại trên hiện vẫn đang được sử dụng độc lập hoặc kết hợp với nhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay Mỗi phương pháp có một ưu điểm nhất định, tuy nhiên vì lí do thực dụng, người ta vẫn chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống là chủ yếu

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất kháng sinh từ xạ

Trong lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn, các cơ chế như điều hoà cảm ứng, điều hoà ngược, điều hoà dị hoá sẽ được sử dụng hoặc loại bỏ bằng các biện pháp dinh dưỡng, công nghệ hoặc kỹ thuật di truyền Chủng lựa chọn cần phải phá vỡ cân bằng môi trường để làm mất sự điều hoà cần thiết, do đó có thể tổng hợp sản phẩm đáp ứng yêu cầu kinh tế Những hiểu biết về thành phần môi trường lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vô cơ, các chất kích thích hoặc kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh), cũng như ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khác (như pH, nhiệt độ, độ thông khí, đặc điểm của chủng giống) có ý nghĩa to lớn trong điều khiển quá trình lên men nhằm duy trì trạng thái hoạt động và có thể kéo dài pha sinh tổng hợp của chủng sản Ví dụ bổ sung chất dinh dưỡng nhắc lại hoặc điều chỉnh pH bằng CaCO3 sẽ nâng hiệu suất sinh kháng sinh lên 20-30%; bổ

sung thioxianat vào môi trường lên men S aureofaciens cũng làm tăng tổng hợp

chlotetraxyclin, trong khi bổ sung xanh bromothymol lại cho tác dụng ngược lại [16, 23, 24]

a Thành phần môi trường

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng cũng như sinh

tổng hợp chất kháng sinh của chủng S orientalis, do nguồn cacbon không những

tham gia vào cấu tạo thành tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm

Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như glucoza, fructoza…, các loại đường kép như maltoza, saccaroza…, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường Đối với tinh bột chủng có khả năng sử dụng để tạo ra chất kháng sinh bởi khả năng sinh enzym amylaza thuỷ phân tinh bột sử dụng vào quá trình tổng hợp chất kháng sinh, với nguồn cacbon là glucoza thì cho hoạt tính chất kháng sinh thấp do ảnh hưởng của quá trình ức chế ngược đồng thời glucoza chỉ được sử dụng vào quá trình tăng trưởng Với nguồn cacbon là saccaroza cho hoạt tính tốt nhất [1, 6]

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương,…, còn nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh do nó cung cấp các nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để hình thành lên mạch heptapeptid [1]

b Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ từ 20- 35 C thích hợp cho hầu hết các chủng xạ khuẩn Như chủng xạ

khuẩn S orientalis có khả năng phát triển tối ưu cho quá trình sinh vancomycin là

28 C, còn ở nhiệt độ 20 và 35 C chủng này vẫn sinh trưởng nhưng phát triển không tốt, lượng sinh khối tạo thành thấp, đồng thời lượng kháng sinh tạo ra thấp

- Độ pH: pH ban đầu thích hợp cho chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh là trung tính (pH 7,0- 7,5), môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này

- Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật khác, nhất là trong giai đoạn nhân giống Do đó, nồng độ oxy trong môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình lên men Theo kết quả của các nghiên cứu trước thì lượng dịch lên men bằng 15% so với thể tích bình lên men

là thích hợp cho việc tạo kháng sinh, khi độ thông khí cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng đến quá trình này [1]

Ngoài ra, sự sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng của cơ chế điều hoà ngược Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ trong môi trường đến một nồng độ nhất định nào đó sẽ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của chúng dẫn đến làm giảm hiệu suất sinh kháng sinh

1.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH

1.4.1 Phương pháp hấp phụ

Hấp phụ là quá trình hút các chất lên bề mặt các vật liệu nhờ ái lực trên bề mặt hay mọi quá trình làm tập trung chất lên bề mặt phân chia pha đều gọi là sự

hấp phụ Các vật liệu được gọi là chất hấp phụ (adsorbent), chất bị hút gọi là chất bị hấp phụ (adsorbate) [2,5]

Người ta phân ra hai loại hấp phụ vật lý và hấp phụ hoá học Trong một quá trình có thể tồn tại cả hai loại hấp phụ tuy vậy không có ranh giới thật rõ rệt để phân biệt hai quá trình đó [4]

Trong sự hấp phụ vật lý, lực liên kết giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ là liên kết phân tử, như vậy quá trình hấp phụ vật lý tương tự như quá trình ngưng hơi trên bề mặt pha rắn Quá trình hấp phụ vật lý là quá trình thuận nghịch, sản phẩm khử hấp phụ không biến đổi thành phần hoá học Tốc độ hấp phụ vật lý tương đối lớn, khi nhiệt độ tăng độ hấp phụ giảm, lớp hấp phụ vật lý nói chung là lớp đa phân

tử

Hấp phụ hoá học: lực tương tác mang bản chất loại liên kết hoá học Lực liên kết hoá học hay lực hoá trị chỉ tác dụng trong phạm vi kích thước phân tử, nên lớp hấp phụ là lớp đơn phân tử Quá trình khử hấp phụ hoá học tương đối khó, sản phẩm khử hấp phụ thường đã biến đổi thành phần hoá học Như vậy hấp phụ hoá học thực chất là một loại phản ứng hoá học bề mặt, tuy nhiên sản phẩm bề mặt thì không phải lúc nào cũng tách ra được Sự hấp phụ hoá học chỉ xảy ra ở nhiệt độ cao hơn so với hấp phụ vật lý và đòi hỏi một năng lượng hoạt hoá xác định, do đó người ta còn gọi hấp phụ hoá học là hấp phụ kích động

1.4.2 Một số chất hấp phụ

a) Than hoạt tính

Than hoạt tính thường được sử dụng dưới dạng bột hoặc hạt, có thành phần chủ yếu

là cacbon Sự khác biệt giữa các loại than hoạt tính là độ xốp, diện tích bề mặt riêng, hệ thống mao quản, mật độ nhóm chức bề mặt và thành phần các nguyên tố Ngoài thành phần chính là cacbon, than hoạt tính còn có một lượng tro nhất định,

đó là hỗn hợp của các kim loại [2, 5, 7]

Những đặc trưng của than hoạt tính

- Thể tích lỗ xốp riêng: là thể tích không gian rỗng trên một đơn vị khối lượng (m3

/g)

- Diện tích bề mặt riêng: là diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng, bao gồm tổng bề mặt trong mao quản và bề mặt ngoài của các hạt (m2

/g)

- Hình dáng mao quản: hình trụ, hình cầu, hình khe và hình chai

Trong các yếu tố trên thì yếu tố quyết định khả năng hấp phụ là diện tích bề mặt riêng, diện tích bề mặt riêng càng lớn khả năng hấp phụ càng cao do có nhiều trung tâm hấp phụ trên bề mặt than Ngoài ra kích thước mao quản và sự phân bố cũng là yếu tố quan trọng Đường kính mao quản trung bình 2 < d < 50 nm (medopore), kích thước nhỏ d < 2 nm (micropore), kích thước lớn d > 50 nm (macropore) [2,5,7]

Đặc tính hoá học bề mặt của than hoạt tính

Cacbon trên bề mặt chưa bão hoà hóa trị tạo ra các gốc tự do là trung tâm tạo

ra các nhóm chức bề mặt Các nhóm chức bề mặt có đặc tính axit (cacboxyl, hydroxyl…) hoặc bazơ (pyrol, lacton…) Trong môi trường nước, do bề mặt của than hoạt tính tích điện nên nó hình thành một lớp điện tích kép xung quanh bề mặt than pH mà ở đó mật độ điện tích các ion trên bề mặt cân bằng gọi là điểm đẳng điện, điểm đẳng điện của than hoạt tính thường nằm trong vùng axit (pH = 4 - 5) Ở

pH thấp hơn pH đẳng điện, bề mặt than tích điện dương Ở pH lớn hơn pH đẳng điện, bề mặt than tích điện âm [4,5]

Trong hấp phụ hỗn hợp, cơ chế hấp phụ theo cơ chế cạnh tranh và chọn lọc Than hoạt tính là chất ít phân cực sẽ tương tác tốt với các chất hữu cơ trong nước là những chất ít phân cực Chất bị hấp phụ có phân tử lượng lớn có khả năng tương tác cao với than hoạt tính nhưng lại bị khống chế bởi yếu tố không gian [4]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ

Hấp phụ của than với các chất hữu cơ trong nước là hấp phụ vật lý, do đó quá trình hấp phụ bị ảnh hưởng chủ yếu bởi pH môi trường và nhiệt độ

- pH: pH tăng, khả năng hấp phụ giảm do khả năng phân ly của các chất bị hấp phụ ở các pH khác nhau là khác nhau pH càng cao tỷ lệ phân ly để tích điện âm của than càng cao ở pH thấp hơn pH đẳng điện, bề mặt than tích điện dương do đó làm giảm tương tác của hệ dẫn đến giảm khả năng hấp phụ Khả năng hấp phụ cao khi các phân tử chất tan có điện tích nhỏ nhất

- Nhiệt độ: nhiệt độ tăng khả năng hấp phụ của các hệ giảm (do hấp phụ vật lý toả nhiệt), nhiệt độ tăng, lực tương tác của hệ giảm, khả năng hấp phụ giảm

Ngoài ra quá trình hấp phụ còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như nồng độ than, kích thước hạt than, nồng độ chất bị hấp phụ trong dịch ban đầu [1, 4, 7]

b) Các nhựa trao đổi ion

Trao đổi ion cũng là một dạng điển hình của quá trình hấp phụ từ dung dịch Hấp phụ trao đổi ion là quá trình trong đó các ion của chất bị hấp phụ tập trung trên bề mặt chất hấp phụ ở những vị trí mang điện do lực hút tĩnh điện, thay thế cho những ion cùng bản chất của bề mặt [1, 4]

Trao đổi ion (ionit) là một khung vật liệu rắn không hoà tan, trên đó

có gắn bằng liên kết đồng hoá trị với các nhóm ion hoá được Các nhóm mang điện tích này lại được liên kết với các ion đối và các ion đối lại có thể trao đổi thuận nghịch với các ion trái dấu

Một khung có mang các nhóm tích điện dương và ion đối tích điện âm được gọi là nhựa trao đổi anion (anionit) Ngược lại, một nhựa trao đổi cation (cationit)

sẽ mang điện tích âm Ngoài ra các nhựa trao đổi thường khác nhau về bản chất hoá học của giá khung (là gelpolysaccarit hay nhựa tổng hợp) cũng như về lực axit, bazơ của nhóm ion hoá được

Một số nhựa trao đổi ion: Ambelit resin IR-120 có bản chất hoá học là polystyren được liên kết chéo bằng divinylbenzen, nhóm ion hoá -SO3-, là chất trao đổi cation mạnh; Wofatit KPS resin có bản chất là các polime bậc cao, điều chế bằng cách trùng ngưng phenol, amin thơm và formaldehid [1, 4]

1.4.3 Một số chất nhả hấp phụ

a) Aceton (CH3)2CO

Aceton ở điều kiện thường là chất lỏng, không màu, hoà tan tốt trong nước

có thể do tạo thành liên kết hydro với phân tử dung môi Aceton có chứa nhóm carbonyl phân cực về phía nguyên tử oxy Aceton là dung môi có cực thấp nhất dùng để tách chiết chất kháng sinh rất có hiệu quả [2, 4, 5]

b) Alcol

Alcol là hợp chất có nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon

no Nhóm chức của alcol là C-OH Các hợp chất đầu dãy đồng đẳng của alcol có mùi đặc trưng, dễ cháy, hoà tan vô hạn trong nước do tạo liên kết hydro với nước

Độ hoà tan của alcol trong nước giảm dần theo chiều tăng khối lượng phân tử Một

số dung môi thường dùng để nhả hấp phụ bao gồm: methanol, ethanol, n-butanol, isopropanol [4, 7, 8]

1.5 BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA

Ở miền bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể phát sinh phát triển vào tất cả các vụ lúa đông xuân, mùa Trong vụ đông xuân, bệnh thường phát sinh vào tháng 3 - 4 nhưng phát sinh mạnh hơn vào cuối giai đoạn sinh trưởng của lúa, vào khoảng tháng 5 - 6 dương lịch khi lúa xuân đã trỗ và chín Nói chung, bệnh ở vụ xuân thường bị nhẹ hơn, ít tác hại hơn so với vụ mùa, trừ một số trường hợp lúa xuân cấy muộn bị bệnh ngay từ đòng thì bệnh có thể phát triển nặng và gây tác hại ít nhiều Bệnh bạc lá phát sinh sớm từ trung tuần tháng 8, ngay khi lúc lúa mùa đang đẻ nhánh và tiếp tục phát triển mạnh vào thời kì làm đòng, trỗ đến chín Các trà lúa mùa thường bị bệnh rất sớm và khá nặng, đặc biệt trong những năm mưa bão nhiều Nhìn chung cả hai vụ lúa xuân và lúa mùa, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn sinh trưởng của cây lúa, dễ bị nhiễm nhất là lúc lúa làm đòng – trỗ – kéo dài tới chín sữa Sự diễn biến của bệnh nhiều năm đều theo một quy luật tương đối rõ rệt: phát sinh phát triển khi nhiệt độ không khí tương đối cao 26 – 30 C Ẩm độ cao trong những đợt mưa, gió, bão, vào lúc cây lúa đang ở giai đoạn đòng, trỗ trở đi

1.5.1 Thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với cây lúa

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm

1884-1885 Bệnh phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là châu Á (Nhật Bản, Trung quốc, Philippin, Ấn Độ, )

Ở nước ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa cũ nhưng đặc biệt

từ năm 1965-1966 tới nay, có những năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kì bị nhiễm của cây sớm

hay muộn và mức độ bị nặng hay nhẹ Năm 1970, trên diện tích lúa mùa cấy giống NN8 bị nhiễm bệnh ở mức độ 60 – 80%, giảm năng suất từ 30-60% Theo báo cáo của Viện Bảo vệ thực vật (1970) thì tác hại của bệnh bạc lá càng lớn khi mức độ bị bệnh càng nặng

Điều cần chú ý là mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào thời kì bị bệnh Nếu cây lúa bị bệnh ngay từ thời kì đẻ nhánh thì mức độ bị nhiễm bệnh về sau thường rất nặng, ảnh hưởng rất rõ đến năng suất, có thể làm giảm 41% trở lên, nếu

bị bệnh bắt đầu từ thời kì đòng – trỗ tác hại có thể vẫn lớn, trung bình là giảm năng suất của cây lúa khoảng dưới 30% Nhưng nếu ở thời kì cuối (chín sữa – chín chắc) mới bị bệnh thì mức độ tác hại ít hơn, dưới 10% (Lê Lương Tề)

Tác hại chủ yếu của bệnh bạc lá là làm lá lúa, đặc biệt là đòng sớm tàn, nhanh chóng bị chết khô, bộ lá lúa bị xơ xác, ảnh hưởng xấu đến hiệu xuất quang hợp tích luỹ chất khô, dẫn đến giảm khối lượng hạt, tỷ lệ lép cao, năng suất sụt kém

1.5.2 Biểu hiện của bệnh bạc lá trên lúa

Bệnh bạc lá phát sinh phá hại suốt từ thời kì mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kì lúa cấy trên ruộng từ sau đẻ nhánh – trỗ, chín sữa Trên

mạ triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó, dễ nhầm lẫn với các hiện tượng khác Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá

mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô

Trên lá lúa triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc ciểm điển hình sau đây: Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái, vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám Trên một số giống lúa mới ngắn ngày, phàm

ăn, được bón nhiều phân đạm thì vết bệnh biểu hiện nhanh, phiến lá đột ngột xanh sẫm khô tái đi, lá mất sắc bóng có màu xanh mờ đục, mô bệnh không chuyển kịp sang màu xanh vàng rực mà đã khô xác, nâu bạc, chết lụi táp đi Thông thường ranh giới mô bệnh và mô khoẻ trên phiến lá rất rõ rệt, có giới hạn theo đường gợn sóng

vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường chỉ viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng (hình 1.1)

Hình 1.1 Biểu hiện của lá lúa bị khi bị nhiễm bệnh bạc lá

1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Còn gọi là Pseudomonas oryzae Magrou, Xanthomonas oryzae pv oryzae Vi khuẩn X

oryzae hình que hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở đầu kích thước 1-2 x 0.5-0.9 m

Sống trên môi trường có khuẩn lạc hình tròn màu vàng sáp, rìa nhẵn Vi khuẩn nhuộm Gram âm, không có khả năng khử NO3, không dịch hoá gelatin, không tạo indol, có khả năng tạo H2S

Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn X.oryzae sinh trưởng phát triển là 26 –

30 C, nhiệt độ tối thiểu 0 – 5 C, tối đa là 40 C Nhiệt độ gây chết là 53 C trong 10 phút, có thể sống trong môi trường có phạm vi pH 5,7-5,8 thích hợp nhất ở 6,8– 7,2

1.5.4 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá mép lá và đặc biệt qua vết thương trầy xước trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt lá có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương hở rồi

sinh sản nhân lên về số lượng qua các bó mạch lan rộng đi Trong điều kiện mưa

ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà lan truyền tới các lá khác, cây khác để tiến hành nhiễm lặp lại nhiều đợt trong thời kì sinh trưởng Cho nên, tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tuỳ thuộc mưa gió, giông bão xảy ra trong mùa vụ mà bệnh có thể lan truyền với phạm

vi không gian khá rộng Giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, đây chính

là một trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ xuân và trong suốt mùa vụ ở nước ta

1.5.5 Sử dụng xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa

Khi có bệnh, không phun các chất kích thích sinh trưởng, các loại phân bón qua lá và luôn giữ đủ nước trong ruộng Khi bệnh đã phát triển trên đồng ruộng thì việc phun thuốc hoá học thường không có hiệu quả Tuy nhiên tại những vùng thường xuyên xuất hiện bệnh Bạc lá lúa, đặc biệt trên những giống nhiễm nặng có thể sử dụng một số loại thuốc kháng sinh để phun chữa bệnh bao gồm Kasugamicin, Streptomicin sulfate, Gentamicin Sulfate nhưng phải phun sớm, nhất

là trước hoặc ngay sau các đợt mưa giông, kết hợp chăm bón lúa cân đối, hợp lý để phòng ngừa và hạn chế bệnh Tuy nhiên các phương pháp này thường có hiệu quả không cao Hiện nay xu hướng chung trong sản xuất an toàn là kiểm soát dịch bệnh bằng cách sử dụng các nhóm xạ khuẩn có khả năng đối kháng có thể ức chế, tiêu diệt các mầm bệnh dịch hại ngay tại thời điểm ban đầu từ trước khi gieo hạt, ngâm hạt, điều đó có thể giúp phòng trừ bệnh hiệu quả hơn

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

- Mẫu đất được thu thập các vùng khác nhau ở Thái Bình và Nam Định

- Các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis, Sarcina lutea, nhận được từ

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae 020 gây bệnh bạc lá ở lúa nhận được từ Bộ

môn bệnh cây trồng Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

2.1.2 Hóa chất

Bột đậu tương, khô đậu tương Việt Nam

Đường kính, Tinh bột tan Việt Nam

Sacaroza, glucoza dùng trong lên men Việt Nam

Các loại đường: glucoza, mannoza, galactoza Merck (Đức )

Cân điện tử Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy đo pH Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy đo phổ hồng ngoại: FT-IR Impact 410 Đức

Máy đo sắc ký lỏng cao áp: HPLC-SPA-10 Shimadzu Nhật

Máy đo khối phổ: HPLC-MS: Agilent 6310 Ion Trap Mỹ

- MT MPA (g/l): Cao thịt 5; pepton 10; NaCl 5; thạch 20; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT 48 (g/l): Cao nấm men 3; tinh bột tan 10; thạch 20; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT ISP 1 (g/l): Trypton 5; cao nấm men 3; thạch 20; nước cất 1 lít; pH = 7,0-7,2

- MT ISP 2 (g/l): Cao nấm men 4; cao malt 10; dextroza 4; nước cất 1 lít; thạch 20;

pH = 7,3

- MT ISP 4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO42; CaCO3 2; nước cất 1 lít; dung dịch A 1ml; thạch 20; pH = 7,2-7,4 Dung dịch

muối A (%): FeSO4 0,1; MnCl2 0,1; ZnSO4 0,1; nước cất 100 ml

- MT ISP 8 (g/l): Pepton 1; NaCl 0,5; KNO3 1; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT ISP 9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64; K2HPO4 5,65; KH2PO4 2,38; MgSO4 1; dung dịch B 1 ml; nguồn cacbon 10; thạch đã rửa 20-25; nước cất 1 lít; pH = 6,8-7,0

Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; nước cất 100 ml

- MT 79 (g/l): glucoza 10; pepton 10; cazein thuỷ phân 2; cao nấm men 2; NaCl 6;

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bảo quản giống [3]

Các chủng xạ khuẩn phân lập được giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ

4oC và cấy chuyền lại hàng tháng Giống sử dụng trong các nghiên cứu được hoạt

hoá bằng cách nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7 ngày

Để bảo quản chủng lâu dài, giữ giống trong glyxerin ở -20 o

C

2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn theo các phương pháp

của chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP - International Streptomyces Project) và

Bergey’s Manual of Determintative Bacteriology, Vol 4, 1989

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Chủng xạ khuẩn TB5.4 được nuôi trên MT Gauze 1 có cắm lamen nghiêng trên mặt MT, ở nhiệt độ 28-30oC Sau 7-14 ngày, quan sát khuẩn ty và hình dạng cuống sinh bào tử trên lamen bằng kính hiển vi quang học

Bề mặt bào tử: Dùng lưới đồng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử (tại Viện 69, Bộ Quốc phòng)

2.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Chủng xạ khuẩn TB5.4 được nuôi trên các MT Gauze 1, Gauze 2, 48, ISP1, ISP2, ISP4, ISP6, ISP8, ISP9 ở 28-30oC Sau 7, 14 và 21 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra MT theo phương pháp của Tresner và Backus, 1971

Sự hình thành sắc tố melanin: Xạ khuẩn được nuôi trên MT ISP-4 ở 28oC, quan sát màu của MT sau 7 và 14 ngày

2.2.2.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

- Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp: Chủng TB5.4 được nuôi trên MT ISP1

ở nhiệt độ 18 - 40o

C Khả năng sinh trưởng được xác định sau 7 ngày nuôi cấy

- Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Chủng TB5.4 được nuôi trong MT ISP4 đã chỉnh pH từ 3-10, ở nhiệt độ 28-30oC, sau 7 ngày quan sát và xác định sự sinh trưởng

- Khả năng sinh enzym ngoại bào: Chủng TB5.4 được nuôi ở nhiệt độ 28oC trong MT ISP4 có các nguồn cơ chất khác nhau như sữa đã loại chất béo, gelatin,