Nghiên cứu sàng lọc các chủng xạ khuẩn và đánh giá khả năng sinh hoạt chất kháng xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Kim Nữ Thảo, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Trương Quốc Phong, người hỗ trợ giúp đỡ nhiều trình thực đề tài nghiên cứu Tơi xin cảm ơn anh chị Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học – Đại học Quốc Gia Hà Nội dạy tạo điều kiện giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tài trợ Quỹ IFS (Mã số: F/5369 – 1) Quỹ NAFOSTED (Mã số: 106 – 4S.04 – 2013.07) cho nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ người thân gia đình tơi, người ln sát cánh, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu, hoàn thiện luận văn Hà Nội, ngày 29/09/2015 Học viên Trần Thị Hằng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh bạc lúa 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh bạc lúa 1.1.2 Tình hình bệnh bạc lúa giới Việt Nam 1.1.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) 1.1.4.Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lúa 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm chung 1.2.2 Xạ khuẩn hoạt chất thứ cấp từ xạ khuẩn .10 1.2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn khống chế bệnh bạc lúa Việt Nam 12 1.3 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 12 1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu 12 1.3.2 Nội dung 12 CHƢƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2.Hóa chất 13 2.1.3.Thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu .13 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1.Hoạt hóa chủng xạ khuẩn .15 2.2.2.Thử hoạt tính kháng Xoo phương pháp thỏi thạch .15 2.2.3.Xác định hoạt tính kháng Xoo theo phương pháp khuếch tán thạch 15 2.2.4 Xác định điều kiện ni cấy xạ khuẩn thích hợp 16 2.2.5.Xác định điều kiện tách chiết dịch chiết thô .16 2.2.6 Xác định hoạt chất kháng Xoo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)16 2.2.7 Tinh hoạt chất kháng Xoo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).17 ii 2.2.8 Phân tích khối phổ .17 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Kết sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả kháng Xoo 18 3.2 Xác định điều kiện ni cấy xạ khuẩn thích hợp 19 3.3 định dung môi phương pháp tách chiết dịch nuôi xạ khuẩn 25 3.4.Tinh phân tích hoạt chất kháng Xoo sinh chủng xạ khuẩn 26 3.5 Kết phân tích trọng lượng phân tử hai hoạt chất sinh từ hai chủng VTCC-A-378 VTCC-A-3247 44 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Mơi trường hoạt hóa giống 14 Bảng 2.2 Môi trường để xác định điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn 14 Bảng 2.3 Nồng độ kênh phân tích mẫu thời gian 35 phút 17 Bảng 3.1 Môi trường thời gian ni cấy thích hợp chủng xạ khuẩn 24 Bảng 3.2 Bảng tóm tắt nhóm hoạt chất dự đốn 42 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh lúa bị nhiễm bệnh bạc A Lá lúa không bị nhiễm Xoo B Lá lúa bị nhiễm Xoo [57] Hình 1.2 Tình hình bệnh bạc lúa Việt Nam từ 2010 - 2013 [75] Hình 1.3.A Hình ảnh khuẩn lạc Xoo [48] Hình 1.3.B Hình ảnh tế bào Xoo [4] Hình 3.1 Kết sàng lọc chủng xạ khuẩn kháng Xoo 18 Hình 3.2 Ảnh hưởng mơi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-289 19 Hình 3.3 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-378 20 Hình 3.4 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-2271 20 Hình 3.5 Ảnh hưởng mơi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-456 21 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-465 21 Hình 3.7 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-3969 23 Hình 3.8 Ảnh hưởng mơi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-3247 23 Hình 3.9 Ảnh hưởng mơi trường thời gian nuôi cấy lên khả kháng Xoo chủng VTCC-A-3970 24 Hình 3.10 Ảnh hưởng dung môi đến khả tách chiết hoạt chất từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn 26 Hình 3.11 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-289 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 27 Hình 3.12 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-289 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 28 Hình 3.13 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-378 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 29 v Hình 3.14 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-378 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 30 Hình 3.15 Kết phân tích HPLC dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-2271 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 35 Hình 3.16 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-2271 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 36 Hình 3.17 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-456 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 36 Hình 3.18 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-456 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 36 Hình 3.19 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-465 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 36 Hình 3.20 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-465 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 36 Hình 3.21 Kết phân tích HPLC dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-3969 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 39 Hình 3.22 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-3969 A Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh B Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 39 Hình 3.23 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-3247 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 39 Hình 3.24 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-3247 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 39 vi Hình 3.25 Kết phân tích HPLC dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-3970 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254 nm B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 40 Hình 3.26 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-3970 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn 41 Hình 3.27 Kết phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo chủng VTCC-A-378 44 Hình 3.28 Kết phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo chủng VTCC-A-3247 45 Hình 3.29 Cấu trúc hóa học factumycin [70] 45 Hình 3.30 Cấu trúc hóa học actinomycin X2 [81] 46 vii TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) MT SKS VTCC Xoo PSA Môi trường Sinh kháng sinh Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật) Xanthomonas oryzae pv oryzae Potato sugar agar (Môi trường khoai tây) viii ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạc lúa bệnh gây tổn thất nghiêm trọng lúa Việt Nam khu vực trồng lúa khác giới Các thống kê cho thấy bệnh bạc lúa làm giảm suất lúa khu vực châu Á đến 60% [6] Ở Việt Nam, bệnh bạc lúa phát nhiều nơi nước Đặc biệt hai thập niên trở lại đây, tập quán cấy lúa dầy bón nhiều phân đạm làm gia tăng hội phát triển bệnh bạc lúa khiến tổn thất bệnh gây lớn Bệnh bạc lúa loại vi khuẩn gram âm Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây Có nhiều nghiên cứu tiến hành nay, chưa có phương pháp phịng trừ bệnh bạc lúa đánh giá hiệu quả, an toàn kinh tế Phương pháp chuyển gen để tạo giống lúa kháng bệnh chưa đạt hiệu cao phổ kháng hẹp hai gen chuyển vào lúa Các phương pháp hoá học chưa thực thành cơng tính đa dạng cao nịi Xoo, dẫn đến phát triển nhanh chóng nịi kháng thuốc [11] Chính vậy, phương pháp kiểm soát sinh học (biocontrol) đánh giá cao tính hiệu mức độ an tồn mơi trường phương pháp Một số nghiên cứu giới sử dụng chủng Bacillus sp., Streptomyces sp có khả kháng Xoo bước đầu cho thấy tiềm phương pháp kiểm soát sinh học bệnh bạc lúa [11, 37] Xạ khuẩn đánh giá nguồn sinh chất có hoạt tính sinh học lớn Khoảng ba phần tư chất kháng sinh nhóm chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính khác sinh xạ khuẩn Dưới tài trợ quỹ NAFOSTED, TS Phan Thị Phương Hoa cộng Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC), Viện vi sinh vật công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn lưu giữ VTCC phát 17 chủng xạ khuẩn có khả kháng 10 nịi Xoo tìm thấy Việt Nam [15, 16] Thử nghiệm dịch nuôi cấy chủng VTCC-A-2776 lúa cho kết khả quan, giảm đến 43,2% khả giảm suất lúa Xoo Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp kiểm soát sinh học dừng lại mức độ phun bào tử, phun dịch nuôi cấy lên trồng mà thành phần, hàm lượng chất có hoạt tính sinh học chất gây hại khác chủng vi sinh vật sinh Chính vậy, chúng tơi thực đề tài "Nghiên cứu sàng lọc chủng xạ khuẩn đánh giá khả sinh hoạt chất kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa" nhằm sàng lọc chủng kháng Xoo mạnh tinh bước đầu xác định chất hóa học chất có hoạt tính Kết nghiên cứu tạo bước tiến gần đến việc chế tạo ứng dụng chế phẩm sinh học khống chế bệnh bạc lúa từ xạ khuẩn Mục tiêu: Sàng lọc đánh giá khả sinh hoạt chất kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae từ xạ khuẩn Nội dung: - Sàng lọc số chủng xạ khuẩn có khả kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae tốt - Lựa chọn mơi trường thích hợp để ni cấy xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae cao - Nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh bước đầu xác định chất hóa học số hoạt chất có hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae từ xạ khuẩn Với điều kiện phân tích HPLC chủng trên, chủng VTCC-A- h 3970 sinh hoạt chất kháng Xoo tập trung phân đoạn 21 có phổ hấp thụ giống với phổ hấp thụ actinomycin (Hình3.25, 3.26) Như vậy, số chủng phân tích, chủng VTCC-A-2271, VTCC-A-3969, VTCC-A-3247 VTCC-A3970 sinh hoạt chất kháng Xoo có cấu trúc tương tự actinomycin khỏi cột Cadenza C18 phút 21 Kết trùng lặp cho thấy độ tin cậy cao phương pháp phân tích tinh sử dụng nghiên cứu Thời gian (phút) Đường kính vịng kháng Xoo (mm) A 12 10 B B 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Phân đoạn (phút) Hình 3.25 Kết phân tích HPLC dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-3970 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 254nm; B Kết thử hoạt tính kháng Xoo phân đoạn sau HPLC 40 Cường độ hấp thụ bước sóng360 nm (mAU) Thời gian (phút) B Cường độ hấp thụ (mAU) Cường độ hấp thụ (mAU) A Bước sóng (nm) C Phổ hấp thụ chất chuẩn actinomycin X2 Phổ hấp thụ chất phân tích Bước sóng (nm) Hình 3.26 Kết phân tích HPLC hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VTCC-A-3970 A Phổ hấp thụ HPLC bước sóng 360 nm B Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600nm hoạt chất tinh C Kết so sánh phổ hấp thụ hoạt chất tinh chất chuẩn Từ kết phân tích trên, hoạt chất sinh từ chủng xạ khuẩn dự đốn có cấu trúc giống với chất khác nhau: factumycin, actinomycin, quinomycin nhóm polyene Kết tóm tắt lại bảng 3.2 41 Bảng 3.2.Bảng tóm tắt nhóm hoạt chất đƣợc dự đốn Số thứ tự nhóm Tên chủng xạ khuẩn Tên nhóm hoạt chất dự đốn Nhóm VTCC-A-289 Factumycin VTCC-A-378 Nhóm VTCC-A-456 Quinomycin Nhóm VTCC-A-465 Polyene Nhóm VTCC-A-2271 Actinomycin VTCC-A-3969 VTCC-A-3247 VTCC-A-3970 Factumycin kháng sinh thuộc nhóm với aurodox, kirromycin, efrotomycin, mocimycin, heneicomycin Nhóm tác giả Gullo cộng phát loài Streptomyces lavendulae sinh factumycin [14] Năm 2011, Kimura cộng chứng minh dịch lên men chủng Streptomyces spp K07-0034 có khả ức chế T3SS (hệ thống tiết típ 3) vi khuẩn Gram âm [23] Năm 2012, Thaker cộng phát factumycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini WAC 5292 có hoạt tính kháng số loại vi khuẩn thường tìm thấy mầm bệnh đa kháng thuốc y tế như: Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosavà Staphylococcus aureus [51] Trong nghiên cứu chúng tôi, hoạt chất kháng Xoo sinh từ chủngStreptomyces toxytriciniVTCC-A-2776 factumycin (kết chưa cơng bố) Actinomycin chất kháng sinh dạng lacton chromopeptide có màu vàng; nhóm chất quan trọng, phát cách 60 năm tiếp tục nghiên cứu, khám phá đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh học ngành sản xuất thuốc kháng sinh [39] Actinomycin có 30 chất tự nhiên nhiều dạng biến thể tổng hợp Cho đến nay, theo thống kê, có 27 lồi thuộc chi Streptomyces 42 lồi thuộcchi Micromonospora có khả sinh hoạt chất thuộc nhóm Actinomycin [25, 39, 55] Kết ghiên cứu Omrane Toumatia cộng cho thấy chủng S mutabilis NBRC12800T sinh Actinomycin D với lượng nhiều 46, 7mg/l/ngày Tiếp sau chủng Streptomyces griseoruber MTCC 8121 đạt hiệu suất 35mg/l/ngày nuôi môi trường ISP – [39] Mặc dù actinomycin loại kháng sinh phổ biến ứng dụng có độc tính tế bào động vật có vú Quinomycin nhóm chất mà cấu trúc có oxit lưu huỳnh tạo liên kết ngang nội phân tử Sự khác chất thuộc nhóm vị trí khác nhóm amino acid chuỗi oligopeptide Có nhiều lồi thuộc chi Streptomyces sinh quinomycin như: Streptomyces echinatus, Streptomyces sp 732 [59], … Quinomycin nghiên cứu nhóm chất có khả kháng nhiều dịng tế bào ung thư có khả kháng khuẩn Polyene nhóm chất kháng nấm lâu đời nhất, phát lần từ năm 1950 [29, 33] Polyene chủ yếu tìm thấy từ xạ khuẩn đất đặc biệt từ loài thuộc chi Streptomyces Ví dụ natamycin sinh từ lồi Streptomyces natalensis, nystatin tìm thấy từ Streptomyces noursei hay amphotericin B tìm thấy từ Streptomyces nodosus… Trong cấu trúc chất thuộc nhóm polyene có chưa 20 – 44 vịng lacton, có từ đến liên kết đơi nội phân tử Vì vậy, polyene nhóm có phổ hấp thụ bước sóng từ 200 – 600 nm với đỉnh cực đại Đây phổ hấp thụ đặc trưng polyene Mặc dù có nhiều chất công bố số lượng chất ứng dụng chưa nhiều Chỉ có amphotericin B nystatin sử dụng rộng rãi lâm sàng Amphotericin B sinh từ Streptomycesnodosus Nó sử dụng 40 năm chưa có thuốc cạnh tranh với amphotericin B việc điều trị bệnh nấm [42] Nystatin tìm thấy lần từ lồi Streptomyces noursei Nystatin có tác dụng kìm hãm diệt nhiều loại nấm khơng gây tác động đến vi khuẩn hay tế bào người Với nhóm chất trên, chưa có nhóm chất cơng bố có khả kháng Xoo Đặc biệt, factumycin hoạt chất có tiềm factumycin 43 khơng có tính độc người động vật Bên cạnh đó, chủng Streptomyces toxytricini VTCC-A-2776 sinh factumycin thực nghiệm giống lúa nhiễm Xoo Oryza sativa L SS1 Oryza sativa L KD18 Kết chiều dài tổn thương Xoo gây giảm 38,3%, 29,8% suất lúa tăng lên 36,6%, 29,3% phun dịch nuôi cấy chủng lên giống lúa nhiễm bệnh [16] Như vậy, kết nghiên cứu tiền đề để phát triển mở rộng khả ứng dụng xạ khuẩn khống chế bệnh bạc lúa 3.5 Kết phân tích trọng lƣợng phân tử hai hoạt chất dự đoán đƣợc sinh từ hai chủng VTCC-A-378 VTCC-A-3247 Hình ảnh kết phân tích trọng lượng phân tử hai hoạt chất sinh từ chủng VTCC-A-378 VTCC-A-3247 phương pháp phân tích khối phổ thể hình 3.27 3.28 Hình 3.27 Kết phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo chủng VTCC-A378 44 Hình 3.28 Kết phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo chủng VTCC-A3247 Hoạt chất sinh từ chủng VTCC-A-378 phân tích khối phổ có [M+Na]+ = 801,4 [M+K]+ = 817,4 nên chất có khối lượng phân tử 778,4 Kết thu trùng với kết nghiên cứu Thaker cộng Thaker chứng minh factumycin sinh từ chủng Streptomyces toxytricini WAC 5292 có khối lượng phân tử 778,4 phổ hấp thụ có bước sóng cực đại 230 nm 360 nm Cấu trúc hóa học factumycin thể hình 3.29 [51] Hình 3.29 Cấu trúc hóa học factumycin [51] Kết phân tích khối phổ so sánhvới kết nghiên cứu Thacker cho thấy hoạt chất sinh từ chủng VTCC-A-378 factumycin Tương tự, kết phân tích khối phổ hoạt chất sinh từ chủng VTCCA-3247 có [M+H]+ = 1270,8 [M+Na]+ = 1292,8 nên khối lượng phân tử hoạt chất 1269,8 Đây khối lượng phân tử actinomycin X2 sinh 45 từ chủng Streptomyces sp R-5 nghiên cứu Shimizu [43] Mặt khác so sánh phổ hấp thụ đặc trưng từ bước sóng 200 – 600 nm thấy hai chất có đỉnh hấp thụ cực đại hai bước sóng khoảng 241 nm 444nm [43].Vậy khẳng định chủng VTCC – A – 3247 sinh actinomycin X2 Hình 3.30 Cấu trúc hóa học actinomycin X2 [57] Như vậy, số hoạt chất kháng Xoo từ chủng xạ khuẩn, hoạt chất hai chủng VTCC-A-378 VTCC-A-3247 phân tích khối phổ Kết phân tích hoàn toàn trùng với kết luận dựa việc so sánh phổ hấp thụ với thư viện hồ sơ sắc ký Trong nghiên cứu tiếp theo, hoạt chất lại tiếp tục nghiên cứu 46 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - 16 chủng xạ khuẩn lưu giữ VTCC kiểm tra lại hoạt tính kháng Xoo nhận thấy có chủng kháng Xoo mạnh - chủng xạ khuẩn nuôi lắc loại môi trường SKS, 2M, 3M, A16, N8 301 nhận thấy SKS mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng Xoo cao Riêng chủng VTCC-A-465 xác định thích hợp với môi trường A16 - Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn tách chiết loại dung môi ethyl acetate, butanol ethanol nhận thấy ethyl acetate dung mơi thích hợp để tách chiết dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn Riêng chủng VTCC-A465 dung mơi thích hợp butanol - Các chất tan dung môi tách chiết phân tích tinh qua sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết bước đầu dự đoán hoạt chất có khả kháng Xoo từ chủng xạ khuẩn xếp vào nhóm: Polyene, quinomycin, actinomycin, factumyin 4.2 Kiến nghị - Xác định cấu trúc hóa học hoạt chất tinh phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân - Phát triển chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn để khống chế bệnh bạc lúa Xoo gây 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arcamone F., Cassinelli G., Fantini G., Grein A., Orezzi P., Pol C (1969), Adriamycin, 14-Hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from Streptomyces peucetius var caesius, Biotechnology and Bioengineering, 11, pp 1101–10 Bérdy, J (2005), Bioactive microbial metabolites, Journal of Antibiotics, 58, pp 1-26 Challis G.L., Hopwood D.A (2003), Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species, Proceedings of the National Academy of Sciences, 100, pp 14555-61 Chand T., Sing N., Sing H., Thind B.S (1979), Fieldefficacy of stable bleaching powder to control bacterial blight of rice in rice, International Rice Research Newsletter, 4(44), pp 12-13 Chu Z.H., Yuan M., Yao J.L., Ge X.J., Yuan B., Xu C.H., Li X.H., Fu B.Y., Li Z.K., Bennetzen J.L., Zhang Q.F., Wang S.P (2006), Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice, Genes & Development, 20, pp 1-5 Dai L.Y., Liu X.L., Xiao Y.H., Wang G.L (2007), Recent advances in cloning and characterization of disease resistance genes in rice, Journal of Integrative Plant Biology, 49, pp 112-9 Demain A.L., Sanchez S (2009), Microbial drug discovery: 80 years of progress, Journal of Antibiotics, 62, pp 5-16 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, tr 39-41 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 54-55 48 10 Gnanamanickam S.S., Priyadarisini V.B., Narayanan N.N., Vasudevan P., Kavitha S (1999), An overview of bacterial blight disease of rice and strategies for its management, Current science, 77 (11), pp 1435-43 11 Gnanamanickam, S.S (2009), Biological control of bacterial blight of rice Biological control of rice diseases, Progress in Biological Control, 8, pp 67-78 12 Gopalakrishnan S., Kumar R., Humayun P., Srinivas V., Ratnakumari B., Vijayabharathi R., Singh A., Surekha K., Padmavathi C., Somashekar N., Rao R.P., Rao L.V.S., Babu V.R., Viraktamath B.C., Goud V.V., Loganandhan N., Gujja B (2013), Assessment of different methods of rice (Oryza sativa L) cultivation for growth parameters, soil chemical, biological and microbiological properties, water saving and grain yield in rice-rice system, Paddy Water Environment, 13, pp 362-366 13 Gu K., Sangha J.S., Li Y., Yin Z.C (2008), Highsolution genetic mapping of bacterial blight resistance gene Xa-10, Theoretical and Applied Genetics, 116, pp 155-63 14 Gullo V.P., Zimmerman S.B., Dewey R.S., Hensens O., Cassidy P.J (1982), Factumycin, a new antinbiotic (A40A): Fermentation, isolation and antibacterial spectrum, Journal of Antibiotic, 12, pp 1705- 07 15 Hoa P.T.P., Quang N.D., Sakiyama Y., Hop D.V., Hang D.T., Van N.T., Quy N.T.K., Dao N.T.A (2012), Screening for actinomycetes isolated from soil able to inhibit Xanthomonas oryzae pv oryzae causing rice bacterial blight disease in Vietnam, African Journal of Biotechnology , 11, pp 14586-89 16 Hoa P.T.P., Hop D.V., Quang N.Q., Ton P.H., HaT.H., Hung N.V., Van N.T., Hai T.V., Quy N.T K., Dao N.T.A., Thom V.T.(2014), Biological Control of Xanthomonas Oryzae pv Oryzae Causing Rice Bacterial Blight Disease by Streptomyces toxytricini (VN08-A-12), Isolated from Soil and Leaf-litter Samples in Vietnam, Biocontrol science, 19, pp 49 17 Ishizuka M., Takayama H., Takeuchi T., Umezawa H (1967), Activity and toxicity of bleomycin, The Journal of Antibiotics, 20, pp 15-24 18 Jensen P.R., Dwight R., Fenical W (1991), Distribution of actinomycetes in near -shore tropical marine sediments, Applied and Environmental Microbiology, 57, pp 1102-8 19 Jensen P.R., Williams P.G., Oh D.C., Zeigler L., Fenical W (2007), Speciesspecific secondary metabolite production in marine actinomycetes of the genus Salinispora, Applied and Environmental Microbiology, 73, pp 1146-52 20 Ji G.H et al (2008), Biological control of rice bacterial blight by Lysobacter antibioticusstrain 13-1, Biological Control, 10, pp 1016 21 Kathiresan K., Balagurunathan R., Masilamani Selvam M (2005), Fungicidal activity of marine actinomycetes against phytopathogenic fungi, Indian Journal of Biotechnology, 4, pp 271-76 22 Kekuda T.R.P., Shobha K.S., Onkarappa R (2010), Studies on antioxidant and anthelmintic activity of two Streptomyces species isolated from Western Ghat soils of Agumbe, Karnataka, Journal of Pharmacy Research, 3, pp 26-9 23 Kimura K., Bugg T.D.H (2003), Recent advances in antimicrobial nucleoside antibiotics targeting cell wall biosynthesis, Natural Product Reports, 20, pp 252-73 24 Khush G.S., Kinoshita T (1991), Rice karyotype, marker genes, and linkage groups, Rice biotechnology, pp 83-108 25 Kurosawa K., Bui V.P., Van Essendelft J.L., Willis L.B (2006), Characterization of Streptomyces MITKK-103, anewly isolated actinomycin X2-producer, Applied Microbiology and Biotechnology, 72, pp 145–54 26 Lam, K.S (2007), New aspects of natural products in drug discovery, Trends in Microbiology, 15, pp 279-89 50 27 LinW., Anuratha C.S., Datta K., Potrykus I., Muthukrishnan S., Datta S.K (1995), Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight, Biology Technology, 13, pp 686-91 28 Iyer A.S., McCouch S.R (2004), The rice bacterial blight resistance gene xa-5 encodes a novel form of disease resistance, Molecular Plant-Microbe Interactions, 17, pp 1348 -54 29 Mathew B.P., Nath M (2009), Recent approaches to antifungal therapy forinvasive mycoses, ChemMedChem, 4, pp 310–23 30 Mew, T.W (1987), Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice, Annual Review of Phytopathology, 25, pp 359-82 31 Mew, T.W (1993), Xanthomonas oryzae pathovars on rice, cause of bacterial blight and bacterial leaf streak, Chapman & Hall, London, pp 30-40 32 Mizukami T., WakimotoS (1969), Epidemiology and control of bacterial leaf blight of rice, Annual Review of Phytopathology journal , 7, pp 51-72 33 Mohr J., Johnson M., Cooper T (2008), Current options in antifungal pharmacotherapy, Pharmacotherapy, 28, pp 614–45 34 Ninox-Lui D.O., Ronald P.C., Bogdanove A.J (2006), Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop, Molecular Plant Pathology, 7, pp 303-24 35 Nguyen X.H., Naing K.W., Lee Y.S., Tindwa H., Lee G.H., Jeong K.S (2012), Biocontrol potential of Streptomyces griseus H7602 against root rot disease (Phytophthora capsici) in pepper, The Plant Pathology Journal, 28, pp 282-89 36 OEPP/EPPO (2007), Xanthomonas oryzae, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 37, pp 543-53 37 Park S.B., Lee I.A., Joo-Won S., Jeong-Gu, K., Lee, H.W (2011), Screening and identification of antimicrobial compounds from Streptomyces bottropensis 51 suppressing rice bacterial blight Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, pp 1236–42 38 Lê Xuân Phương (2011), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất xây dựng, Hà Nội Tr 47-49 39 Praveen V., Tripathi C.K.M (2009), Studies on theproduction of actinomycinD by Streptomyces griseoruber – a novel source, Letter in Applied Microbiology, 49, pp 450–55 40 Ramesh S., Rajesh M., Mathivanan N (2009), Characterization of a thermostable alkaline protease produced by marine Streptomyces fungicidicus MML1614 Bioprocess Biosystems Engineering, 32, pp 791-800 41 Sanchez C.A., Brar D.S., Huang N., Li Z., Khush G.S (2000), Sequence Tagged Site marker-assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice, Crop Science, 40, pp 792-7 42 Seco E.M., Cuesta T., Fotso S., Laatsch H., Malpartida F (2005), Two Polyene Amides Produced by Genetically Modified Streptomyces diastaticusvar, Chemistry&Biology, 12, pp 535–43 43 Shimizu M., Igarashi Y., Furumai T., Onaka H., Kunoh H (2004), Identification of endophytic Streptomyces sp R-5 and analysis of its antimicrobial metabolites, Journal of General Plant Pathology, 70, pp 66-68 44 Singh K., Vikal Y., Mahajan R.K.K., Cheema D., Bhatia R., Sharma J.S., Bharaj T.S (2007), Three novel bacterial blight resistance genes identified, mapped and transfer to cultivated rice O sativa L Proceedings of the 2nd International Conference on Bacterial Blight of Rice, Nanjing, China, pp 8284 45 Song W.Y., Wang G.L., Chen L.L., Kim H.S., Pi L.Y., Holsten T., Gardner J., Wang B., Zhai W.X., Zhu L.H., Fauquet C., Ronald p (1995), A receptor kinase-like proteine encoded by the rice disease resistance gene, Xa-21, Science, 270, pp 1804-6 52 46 Sun X.L., Cao Y.L., Yang Z.F., Xu C.G., Li X.H., Wang S.P., Zhang Q.F (2004), Xa-26, a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae in rice, encoding an LRR receptor kinase-like protein, Plant Journal, 37, pp 517-27 47 Tagami Y., Mizukami T (1962), Historical review of the researches on bacterial leaf blight of rice caused by Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson Special report of the plant diseases and insect 35 pests fore casting service, Plant protection Division, Ministry of Agriculture and Forestry, Tokyo, Japan, 10, pp 112 48 Takagi M., Motohashi K., Nagai A., Izumikawa M., Tanaka M., Fuse S., et al (2010), Anti-influenza virus compound from Streptomyces sp RI18, Organic Letters, 12, pp 4664-46 49 Takatsuki A., Tamura G (1971), Tunicamycin a new antibiotic Some biological properties of the antiviral activity of tunicamycin, Journal of Antibiotics, 24, pp.224-31 50 Terada R., Shimamoto K (2004), Expression of CaMV35S-GUS gene in transgenic rice plants Molecular Genetics, 220, pp 389-92 51 Thaker M.N., Garcıa M., Koteva K., Waglechner N., Sorensen D., MedinabR., Wright R.D (2012), Biosynthetic gene cluster and antimicrobial activity oftheelfamycinantibiotic factumycin, Medicinal Chemistry Communications, 3, pp 1020–26 52 Trejo W.H., Bennett R.E (1963), Streptomyces nodosus sp.n., the amphotericin - producing organism, Journal of Bacteriology, 85, pp 436-39 53 Velusamy P., Ebenezar I.J., Gnanamanickam S.S (2013), Rhizosphere bacteria for biocontrol of bacterial blight and growth promotion of rice, Rice Science, 20(5), pp 356−62 53 54 Vincent P.G., Sheldon B.Z., Ray S.D (1982), Factumycin, a new antibiotic (A40A): Fermentation, isolation and antibacterial spectrum, The journal of antibiotics, 12, pp 1705-07 55 Wagman G.H., Marquez J.A., Watkins P.D., Gentile F (1976), A new actinomycin complex produced by a Micromonospora species: fermentation, isolation, and characterization, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 9, pp 465–69 56 Xiang Y., Cao Y., Xu C., Li X., Wang S (2006), Xa-3, conferring resistance for rice bacteraial blight and encoding a receptor kinase-like protein, is the same as Xa-26, Theoretical and Applied Genetics, 113, pp 1347-55 57 Xiong Z.Q., Zhang Z.P., Li Z.H., Wei S.J., Tu G.Q (2011), Characterization of Streptomyces padanus JAU4234, a Producer of Actinomycin X2 Fungichromin and a New Polyene Macrolide Antibiotic, Applied and Environmental Microbiology, pp, 589-92 58 Yang P.W., Li M.G., Zhao J.Y., Zhu M.Z., Shang H., Li J.R (2010), Oligomycins A and C, major secondary metabolites isolated from the newly isolated strain Streptomyces diastaticus, Folia Microbiologica, 55, pp 10-16 59 Yoshida T., Katagirl K (1967), Influence of isoleucineupon quinomycin biosynthesis by Streptomyces sp., Journal Bacteriology, 93, pp 1327-1331 60 Zhang J., Xi L., Jiang G., Xu Y., He Y (2006), Pyramiding of Xa7 and Xa21 for the improvement of disease resistance to bacterial blight in hybrid rice, Plant Breed, 125, pp 600-5 Tài liệu tham khảo website http://www.mard.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/75/Baocao_12_20 13.pdf http://bacmap.wishartlab.com/organisms/233 http://baolamdong.vn/doi-song/201408/khong-nen-xem-thuong-benh-bac-lalua-2348720/ 54 ... gây hại khác chủng vi sinh vật sinh Chính vậy, thực đề tài "Nghiên cứu sàng lọc chủng xạ khuẩn đánh giá khả sinh hoạt chất kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa" nhằm sàng lọc chủng. .. khuẩn Mục tiêu: Sàng lọc đánh giá khả sinh hoạt chất kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae từ xạ khuẩn Nội dung: - Sàng lọc số chủng xạ khuẩn có khả kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae tốt -... cấy xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae cao - Nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh bước đầu xác định chất hóa học số hoạt chất có hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae