Nghiên cứu tách chiết và tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh có nguồn gốc từ một số chủng xạ khuẩn phân lập tại thái nguyên

MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Chất kháng sinh (Antibiotic) chất có nguồn gốc thiên nhiên sản phẩm cải biến chúng đường hóa học Chúng có khả tác dụng chọn lọc phát triển vi sinh vật, tế bào ung thư nồng độ thấp [7] Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ kháng sinh mà y học loại bỏ bệnh nhiễm trùng Ngồi ra, chất kháng sinh đóng vai trò quan trọng số lĩnh vực khác chăn nuôi, bảo quản thực phẩm,… đặc biệt bảo vệ thực vật Hiện với phát triển cơng nghệ thơng tin cơng nghệ sinh học coi ngành hàng đầu giới Trong phải kể đến cơng nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh phục vụ đời sống người có phát triển vượt bậc Từ phương pháp sinh tổng hợp bán tổng hợp cơng nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò Cho đến phát 17.000 chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp, có 1-2% chất kháng sinh tổng số có đủ tiêu chuẩn sử dụng y học [21] Trong số vi sinh vật có khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nhóm có tiềm lớn chiếm tới 80% số chất kháng sinh mô tả Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh Streptomyces chi xạ khuẩn gồm nhiều lồi có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc điểm kháng khuẩn Trong tương lai chắn có nhiều chất kháng sinh khác tìm đa số vi sinh vật có khả tạo thành chất kháng sinh nghiên cứu thuộc chi Streptomyces Bacillus Tuy nhiên có vấn đề gây lo âu nhà nghiên cứu xuất vi sinh vật kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus số vi khuẩn nguy hiểm Chúng nguyên nhân trực tiếp gián tiếp hàng loạt bệnh nhiễm khuẩn: viêm phổi, viêm phế quản, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm khuẩn vết mổ… Đồng thời, tỷ lệ kháng kháng sinh chủng ngày tăng cao Sự xuất ngày nhiều vi khuẩn đa kháng thuốc thiếu hụt kháng sinh làm cho phải đối mặt với “thời kì hậu kháng sinh” Chính nhiệm vụ đặt cho ngành cơng nghiệp sản xuất chất kháng sinh là: mặt cải biến chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu để tìm chất kháng sinh Thái Nguyên vùng đất có nguồn vi sinh vật phong phú, đặc biệt có nhiều nhóm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, từ chủng xạ khuẩn phân lập Thái Nguyên, thực đề tài: “Nghiên cứu tách chiết tìm hiểu tính chất chất kháng sinh có nguồn gốc từ số chủng xạ khuẩn phân lập Thái Nguyên” Mục tiêu nghiên cứu - Tìm dung mơi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh từ hai chủng xạ khuẩn HT17.8 HT28 - Xác định số tính chất chất kháng sinh từ hai chủng HT17.8 HT28 Nội dung nghiên cứu - Kiểm tra mức độ ổn định HTKS chủng nghiên cứu - Xác định mơi trường lên men kháng sinh thích hợp cho chủng HT17.8 - Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối dịch ngoại bào dung môi hữu - Xác định khả bền pH chất kháng sinh - Xác định khả bền với nhiệt độ chất kháng sinh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xạ khuẩn 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Theo hệ thống phân loại xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn chuẩn (Eubacteria) siêu giới nhân sơ (Procaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, Actinomycetales, bao gồm 10 bộ, 35 họ, 110 chi 1000 lồi có 478 lồi cơng bố thuộc chi Streptomyces 500 lồi thuộc tất chi lại xếp vào nhóm xạ khuẩn Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên đất, nước, hợp chất hữu có sẵn, chí chất mà vi khuẩn nấm không phát triển Nhưng chủ yếu phân bố nhiều đất Xạ khuẩn có vai trò quan trọng tự nhiên, chúng tham gia vào trình phân hủy, chuyển hóa chất đất Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ ẩm, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật… Đất giàu hữu cơ, khống lớp bề mặt có nhiều mùn thường có nhiều xạ khuẩn Xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tốt 25- 280C, độ ẩm thích hợp xạ khuẩn khoảng 40- 55%, pH trung tính kiềm yếu, axit yếu, giới hạn pH khoảng 6,8- 7,5 Ở nơi có pH axit kiềm thường có xạ khuẩn, đặc biệt nơi kiềm XK Theo Waksman, 1gam đất có khoảng 29.000- 2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9- 45% tổng số vi sinh vật [26] Một đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh Theo nhiều nghiên cứu cho thấy có khoảng 60- 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả chủ yếu thuộc chi Streptomyces [2, 6] Trong số có nhiều chất kháng sinh sử dụng y học để điều tra bệnh nhiễm trùng 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển giống hệ sợi nấm Đường kính khuẩn ty thay đổi khoảng từ 0,2- 1,0 µm đến 2- µm Khuẩn ty xạ khuẩn phân nhánh, khơng có vách ngăn không bị đứt đoạn Màu sắc khuẩn ty phong phú, gặp màu: trắng, vàng, nâu, đỏ, lục, lam, tím,… Khi ni cấy môi trường đặc, khuẩn ty xạ khuẩn phát triển thành hai loại: Một loại cắm sâu vào môi trường để lấy nước thức ăn gọi khuẩn ty chất với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi khuẩn ty khí sinh có chức sinh sản Người ta gọi khuẩn ty khí sinh khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp loại khuẩn ty bắt đầu phát triển từ bào tử nảy mầm Khuẩn ty khí sinh thường có dạng vơi, lơng tơ hay bột mịn với nhiều màu sắc hình dạng khác nhau, có loại màu lục, nâu, trắng, đen,… Ở đa số xạ khuẩn, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm, loại vi sinh vật có tên gọi xạ khuẩn [5, 11] Một số xạ khuẩn khơng có sợi khí sinh mà có sợi chất, làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn khó tách cấy truyền Loại có sợi khí sinh ngược lại, dễ tách toàn khuẩn lạc khỏi môi trường [23] Khuẩn lạc xạ khuẩn đặc biệt, không trơn ướt khuẩn lạc vi khuẩn nấm men mà thường chắc, xù xì có dạng thơ ráp, dạng phấn vơi, khơng suốt, có nếp tỏa theo hình phóng xạ Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loại xạ khuẩn tuỳ vào điều kiện ni cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình từ 0,5 – mm [20] Khuẩn lạc có ba lớp: Lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản phẩm trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ,… tích lũy sinh khối tế bào xạ khuẩn hay tiết mơi trường lên men [8] Tế bào xạ khuẩn có cấu tạo tương tự tế bào vi khuẩn Dưới kính hiển vi điện tử thấy rõ thành phần tế bào: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, chất nhân hạt dự trữ Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20 nm Thành phần chủ yếu peptidoglycan tạo nên lớp vách tế bào tương đối vững giúp trì khuẩn ty bảo vệ tế bào Đây thành phần quan trọng để phân biệt với vi khuẩn Gram (-) Thành tế bào có cấu tạo gồm lớp, lớp ngồi dày từ 60 – 120A0, lớp rắn dày khoảng 50A0, lớp dày khoảng 50A0 Thành tế bào cho phép chất kháng sinh, axit amin, nhiều hợp chất khác kể hợp chất có kích thước lớn protein, dextran qua cách dễ dàng Bên cạnh thành tế bào cho phép chất dinh dưỡng từ mơi trường ngồi thẩm thấu có chọn lọc qua màng Bên ngồi thành tế bào có lớp vỏ nhày (capsule) cấu tạo từ polixacarit thường mỏng, số xạ khuẩn lớp vỏ nhày tạo thành trình hình thành bào tử [8, 11] Màng sinh chất có độ dày từ 7-9 nm cấu tạo lớp photpholipit (PL), chiếm khoảng 30-40% khối lượng protein nằm phía trong, phía ngồi hay xun qua màng chiếm 60-70% khối lượng Mỗi phân tử PL chứa đầu tích điện phân cực (đầu photphat) khơng tích điện, khơng phân cực (đầu hidrocacbon) Đầu phân cực tan nước nằm phía Đầu photphat gọi đầu ưa nước đầu hidrocacbon gọi đầu kị nước Các PL màng làm màng hóa lỏng cho phép protein di động tự Sự hóa lỏng động học cần thiết cho chức màng Cách xếp PL protein gọi mô hình khảm lỏng [5] Tế bào chất xạ khuẩn có chứa số thành phần chủ yếu meroxom, thể nhân, vật thể ẩn nhập gồm hạt poliphotphat polixacarit Nhân tế bào xạ khuẩn khơng có cấu trúc điển hình, NST khơng có màng Khi non, tồn tế bào có NST sau thành hạt rải rác toàn hệ khuẩn ty [23] Xạ khuẩn sinh sản bào tử Bào tử hình thành sợi khuẩn ty khí sinh chun hóa gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử xạ khuẩn có nhiều loại hình dáng kích thước khác nhau: Thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng Cuống sinh bào tử xạ khuẩn đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Hình dạng bào tử xạ khuẩn khác nhau, gặp dạng hình tròn, hình van, hình que, hình trụ,… Trên cuống sinh bào tử thường mang từ 30 – 100 bào tử có nhiều hơn, mang – bào tử Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lơng Nhìn chung lồi, hình dạng bảo tử xạ khuẩn tương đối ổn định Vì xem đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn 1.2 Đại cương chất kháng sinh 1.2.1 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ sản phẩm vi sinh mà nồng độ thấp (µm/ml) ức chế tiêu diệt vi sinh vật khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…) cách chọn lọc [25] Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” kháng lại, “bios” sống Tuy nhiên, thuật ngữ khơng phản ánh tính chất chất kháng sinh Đã có nhiều định nghĩa khác chất kháng sinh Theo Waksman, chất kháng sinh chất hóa học vi sinh vật sinh ra, có khả ức chế phân hủy tế bào vi khuẩn vi sinh vật khác Ngày nay, chất kháng sinh coi chất đặc hiệu sinh vật sinh trình sống mà nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt vi sinh vật khác cách có chọn lọc Tuy nhiên, việc sử dụng hợp chất quinolon – hợp chất hóa học khơng có nguồn gốc từ vi sinh vật để điều trị bệnh nhiễm khuẩn mở rộng định nghĩa chất kháng sinh y học đại Các chất kháng sinh không bao gồm chất có nguồn gốc từ vi sinh vật mà bao gồm chất kháng sinh bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần Năm 1928, Alexander Fleming (1881 – 1955) phát penixillin – chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium có khả ức chế phát triển tụ cầu vàng – Staphylococcus aureus Nhưng phải 10 năm sau, vào năm 1940, nhóm nhà khoa học tách chiết thành cơng chế phẩm Penicillin Kể từ đó, Penicillin thức dùng làm thuốc chữa bệnh cho người, đẩy lùi nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm Đây thành tựu vĩ đại kỷ XX Cùng với việc phát Penicillin, thập kỷ 40, 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc việc khám phá hàng loạt chất kháng sinh có giá trị y học Streptomycin (Waksman, 1940), Cloramphenicol (Erhlich, 1947), Chlotetraxyclin (Dugar, 1948),… Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày đẩy mạnh Nhiều Trung tâm nghiên cứu khoa học y học, dược phẩm nông nghiệp nhiều nước giới liên tục phát hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng thực tiễn Năm 1945 phát 30 CKS, năm 1949 số 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS, năm 1980 có 5.500 chất đến số lượng chất kháng sinh phát lên tới 17.000 chất khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp [8,16] Tuy nhiên, số có 1- 2% chất kháng sinh có đủ tiêu chuẩn để sử dụng y học Ở Việt Nam, người nghiên cứu chất kháng sinh GS Đặng Văn Ngữ Ơng lấy dịch ni cấy nấm Penicillium xạ khuẩn Streptomyces griseus để rửa vết thương cho thương binh chiến dịch Đông Xuân 1951 – 1952 Tiếp theo, năm 1968, đơn vị nghiên cứu chất kháng sinh trường Đại học Dược Khoa Hà Nội thành lập GS Trương Công Quyền phụ trách Tại phân lập hàng nghìn chủng xạ khuẩn từ mẫu đất khác Đáng ý tuyển chọn chủng thuộc nhóm Hồng có khả chống vi khuẩn gram âm, có hiệu tốt vi khuẩn gây bệnh mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Kháng sinh lấy tên Dekamycin sau xác định Neomycin Từ năm 1974, Viện Khoa học Việt Nam (nay Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) có nhóm nghiên cứu chất kháng sinh Nhiều chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh ứng dụng bảo vệ thực vật Một số chế phẩm kháng sinh như: tetravit, biovit, baxitraxin,… sản xuất đưa vào sử dụng chăn ni Năm 2004, Tổng cơng ty Hóa chất Tổng cơng ty Dược có dự án hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất cephalosporin nguyên liệu với công suất 300 tấn/năm (thay dự án xây dựng nhà máy sản xuất penixilin nguyên liệu 1000 tấn/năm) [18] 1.2.2 Đặc tính chung chất kháng sinh Chất kháng sinh vi sinh vật sinh nên có đặc tính trước hết chống vi khuẩn Có loại kháng sinh vi sinh vật tiết môi trường xung quanh Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, loại khác lại tích lũy tế bào vi sinh vật giải phóng sau phá vỡ tế bào Gramycidin, Prodigiozin Các chất kháng sinh đa dạng thành phần hóa học, chúng có cấu tạo mạch vòng, dị vòng, vòng thơm, axit, kiềm, polypeptit Nghiên cứu chất hóa học chất kháng sinh cần thiết hiểu rõ chế tác dụng chất kháng sinh, biết đường tổng hợp chúng Khi điều kiện phát triển tối ưu chủng vi sinh vật tích lũy chất kháng sinh cực đại Như vậy, công nghiệp sản xuất chất kháng sinh, muốn tạo nhiều sản phẩm phải tạo mơi trường tối ưu Các chất kháng sinh khác có tính chất lý hóa khác nhau, như: độ hòa tan dung mơi, khả bền vững với axit, kiềm, nhiệt độ,… Nghiên cứu tính chất có ý nghĩa việc xác định phương pháp tách chiết, cô đặc, tinh chất kháng sinh Độ hòa tan chất kháng sinh khác dung mơi, có loại hòa tan tốt nước, cồn, dung môi lipit, có loại hòa tan số dung mơi định Khả bền vững với nhiệt độ chất kháng sinh khác nhau, có loại bị phân hủy nhanh nhiệt độ phòng penicillin Nhưng có loại bền với nhiệt độ, 60 0C chí 1000C khơng bị hoạt tính streptomixin, tetracyclin, chloramphenicol Tính chất ứng dụng sản xuất chất kháng sinh Các chất kháng sinh hòa tan huyết dịch mơ mà khơng bị hoạt tính Đặc tính chất kháng sinh có ý nghĩa y học Độ độc chất kháng sinh thể bậc cao khác Đa số chất kháng sinh từ vi sinh vật ngồi tính kháng khuẩn gây độc cho thể bậc cao Ví dụ: chloramphenicol dùng nhiều lâu gây suy tủy, tetracyclin dùng nhiều lâu gây ảnh hưởng đến gan Một số chất kháng sinh khác có độ độc trung bình, dùng để điều trị vết thương chỗ Một đặc tính bật chất kháng sinh có tác động chọn lọc vi sinh vật Vì khơng thể có chất kháng sinh tác động lên tất vi sinh vật 1.2.3 Cơ chế tác động chất kháng sinh Cơ chế tác động chất kháng sinh cách thức mà chất kháng sinh tác động lên vị trí đích khác tế bào qua ảnh hưởng đến sinh trưởng vi sinh vật Cơ chế tác động chất kháng sinh phụ thuộc vào chất hóa học nồng độ chất kháng sinh Khơng thể có chế chung cho tác động chất kháng sinh lên tế bào vi sinh vật Nhìn chung chế tác động chất kháng sinh biểu theo hướng sau: * Ức chế tổng hợp thành tế bào Thành tế bào cấu trúc chủ yếu thành phần peptidoglycan (PG), có chức giữ hình dạng đặc trưng cho tế bào, bảo vệ cho tế bào khỏi vỡ áp lực thẩm thấu cao bên tế bào PG đại phân tử cấu tạo chuỗi polisaccarit bao gồm đơn phân hai loại dẫn xuất glucoza nằm xen kẽ lặp lại cách liên tục (NAG – NAM) Để sinh trưởng phân chia, tế bào phải tổng hợp đơn vị PG vận chuyển tới vị trí sinh trưởng thành tế bào Phần lớn tác nhân kháng khuẩn thông thường hoạt động dựa ức chế trình hình thành liên kết chéo tetrapeptit tiểu phần NAM Nổi bật chất kháng sinh ß-lactam mà đại diện penixillin cephalosporin Đây chất có vùng chức vòng ß-lactam Các kháng sinh ß-lactam ức chế hình thành PG cách gắn với transpeptidaza enzym cần thiết cho hình thành liên kết chéo chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính enzym làm gián đoạn tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Các penixillin không thấm qua màng vi khuẩn Gr (-) nên hiệu chống vi khuẩn thấp Tuy nhiên penixillin cephalosporin phổ rộng bán tổng hợp vượt qua màng vi khuẩn Gr (-) Một số chất kháng sinh khác vancomycin ức chế hình thành thành tế bào theo cách cản trở trực tiếp đến hình thành cầu D-alanin-Dalanin liên kết tiểu phần NAM vi khuẩn Gr (+) * Phá hủy màng sinh chất Thuộc nhóm bao gồm có kháng sinh: colistin, polymyxin, 10 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh dịch chiết từ sinh khối Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) ST T Dung môi HT17.8 HT28 ĐC Etyl axetat 16,7 ± 0,61 14,2 ± 0,08 2,8 ± 0,04 Axeton 19,9 ± 0,49 16,3 ± 0,12 2,1 ± 0,33 Metanol 18,4 ± 0,65 14,4 ± 0,29 3,2 ± 0,08 n- propanol 20,6 ± 0,45 13,7 ± 0,65 5,5 ± 0,69 Iso butanol 19,7 ± 0,61 15,6 ± 0,24 5,9 ± 0,73 Etanol 19,3 ± 0,53 19,6 ± 0,29 2,9 ± 0,04 (ĐC - đối chứng: dung mơi hữu cơ) Hình 3.4 HTKS dịch chiết từ sinh khối 1-etyl axetat; 2- axeton; 3- metanol; 4- n-propanol; 5- iso butanol; 6- etanol Sáu loại dung môi sử dụng để tách chiết chất kháng sinh dung môi thông dụng, có tính hòa tan tốt đặc biệt độc so với nhiều loại dung mơi khác dùng để tách chiết Kết bảng 3.2 hình 3.4 cho thấy loại dung mơi dùng để chiết chất kháng sinh từ chủng HT17.8 HT28 + Chủng HT17.8: Dịch chiết n – propanol cho hoạt lực mạnh (20,6 mm), axeton, iso butanol etanol (hình 3.5) Tuy 31 nhiên, khơng có khác nhiều loại dung mơi Vì vậy, ngồi n –propanol sử dụng dung mơi để tách chiết mà cho hiệu cao Đây điểm thuận lợi công nghệ tách chiết chất kháng sinh + Chủng HT28: Dịch chiết etanol cho hoạt lực mạnh (19,6 mm), dịch chiết n- propanol cho hoạt lực yếu (13,7 mm) (hình 3.5) Điều thuận lợi kinh tế để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối tế bào etanol vừa rẻ tiền lại khơng độc hại Từ kết trên, lựa chọn dung mơi thích hợp cho chủng HT17.8 HT28 để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối HT17.8 HT28 Hình 3.5 HTKS dịch chiết từ sinh khối 1-etyl axetat; 2- axeton; 3- metanol; 4- n-propanol; 5- iso butanol; 6- etanol 3.3.2 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch ngoại bào Chất kháng sinh tích lũy sinh khối tiết mơi trường xung quanh Nhưng có trường hợp, chất kháng sinh vừa nằm sinh khối, vừa nằm môi trường Vì để kiểm tra chất kháng sinh hai chủng HT17.8 HT28 có dịch ngoại bào hay nằm sinh khối, tiếp tục tách chiết chất kháng sinh từ dịch ngoại bào Các chủng ni lắc 220 vòng/phút 5-7 ngày Ly tâm dịch nuôi cấy để thu dịch ngoại bào Một đặc tính chất kháng sinh cần 32 quan tâm khả hòa tan chất kháng sinh dung môi phụ thuộc nhiều vào pH Để xác định pH cho hiệu tách chiết chất kháng sinh cao nhất, tiến hành tách chiết chất kháng sinh từ dịch ngoại bào dung môi pH = 3, pH = pH = 10 Kết xác định hoạt tính kháng sinh dịch chiết thể bảng 3.3 hình 3.6 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng sinh dịch ngoại bào Hoạt tính kháng sinh ( D – d, mm ) Chủng HT17.8 Dung môi pH = pH = pH = 10 n - butanol 22,8 ± 0,12 21,1 ± 0,57 20,9 ± 0,37 Iso - butanol 21,7 ± 0,61 20,0 ± 0,40 20,7 ± 0,28 Benzen 18,6 ± 0,24 13,5 ± 0,49 18,3 ± 0,28 Cloroform 16,8 ± 0,53 15,5 ± 0,37 12,8 ± 0,57 Etyl axetat 20,8 ± 0,53 16,4 ± 0,49 19,6 ± 0,24 Đối chứng 23,2 ± 0,40 23,1 ± 0,57 23,4 ± 0,49 n - butanol 24,5 ± 0,77 23,0 ± 0,69 21,3 ± 0,53 Iso - 24,9 ± 0,40 23,7 ± 0,24 21,5 ± 0,49 Benzen 16,7 ± 0,73 9,30 ± 0,37 3,10 ± 0,77 Cloroform 17,0 ± 0,45 9,60 ± 0,77 7,70 ± 0,77 Etyl axetat 20,1 ± 0,65 8,40 ± 0,33 2,90 ± 0,28 Đối chứng 27,6 ± 0,33 26,3 ± 0,73 26,5 ± 0,73 butanol HT28 (Đối chứng: Dịch nuôi cấy loại sinh khối) 33 (a) (b) Hình 3.6 HTKS dịch ngoại bào hai chủng xạ khuẩn chiết dung mơi thích hợp mức pH khác (a): HTKS chủng HT17.8; (b): HTKS chủng HT28 Chúng sử dụng loại dung môi: n-butanol, iso butanol, benzen, cloroform, etyl axetat để tách chiết CKS từ dịch ngoại bào Kết bảng cho ta thấy hai chủng, pH = 3, dịch chiết dung môi cho hoạt lực cao Điều chứng tỏ khả hòa tan chất kháng sinh dung môi tốt mơi trường axit Vì để tách chiết 34 chất kháng sinh từ dịch ngoại chủng HT17.8 HT28 đạt hiệu cao nên tách môi trường axit Khả hòa tan chất kháng sinh loại dung môi khác Đối với chủng HT17.8, pH = 3, n-butanol cho dịch chiết có hoạt lực mạnh (22,8 mm) chiết với hiệu suất khoảng 92,3%, tiếp iso butanol etyl axetat, cloroform cho hoạt lực (16,8 mm) (hình 3.7) Chủng HT28, pH = 3, iso butanol dung môi tách chiết tốt (24,9 mm) với hiệu suất chiết khoảng 90,2%, sau đến n-butanol, benzen cho hoạt lực (16,7 mm) (hình 3.7) HT17.8 HT28 Hình 3.7 Hoạt tính kháng sinh dịch ngoại bào chiết pH = 1- n-butanol; 2- iso butanol; 3- benzen; 4- cloroform; 5- etyl axetat Vậy, từ kết cho thấy, chất kháng sinh hai chủng HT17.8 HT28 nằm sinh khối dịch ngoại bào Do vậy, để thu nhận chất kháng sinh hai chủng cần phải tách chiết sinh khối dịch ngoại bào 3.4 Một số tính chất chất kháng sinh chủng HT17.8 HT28 3.4.1 Khả bền chất kháng sinh pH Khả bền pH chất kháng sinh đặc điểm cần ý có ý nghĩa cơng nghệ tách chiết ứng dụng chất kháng sinh Để xác định khả bền pH chất kháng sinh chủng HT17.8 HT28, tiến hành nuôi chủng mơi trường thích 35 hợp Sau 5- ngày, ly tâm dịch nuôi cấy để thu dịch kháng sinh Điều chỉnh dịch kháng sinh mức pH từ đến giữ nhiệt độ phòng 10 phút, sau lại điều chỉnh pH = Xác định HTKS phương pháp đục lỗ Kết thể bảng 3.4 hình 3.8 Bảng 3.4 Khả bền chất kháng sinh pH Hoạt tính kháng sinh ( D – d, mm) pH Chủng HT17.8 Chủng HT28 17,3 ± 0,37 21,0 ± 0,45 17,8 ± 0,49 22,5 ± 0,27 18,3 ± 0,40 22,6 ± 0,09 18,7 ± 0,40 22,7 ± 0,18 18,9 ± 0,35 23,3 ± 0,40 19,1 ± 0,52 23,2 ± 0,27 17,9 ± 0,37 22,7 ± 0,31 Hình 3.8 Khả bền chất kháng sinh pH Các kết cho thấy, dịch kháng sinh hai chủng giữ 36 hoạt tính dải pH từ đến thời gian 10 phút hoạt tính khơng thay đổi mức pH (hình 3.9) Điều chứng tỏ chất kháng sinh có khả bền vững pH Đây đặc điểm thuận lợi công nghệ thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng thời mở rộng khả ứng dụng hai chất kháng sinh Nhiều chất kháng sinh có độ mẫn cảm cao với axit bị khả kháng khuẩn môi trường axit Song, ngược lại có chất kháng sinh bị giảm hoạt tính mơi trường kiềm Khả bền vững chất kháng sinh với pH khác phụ thuộc vào chất hóa học loại kháng sinh HT17.8 HT28 Hình 3.9 Khả bền dịch kháng sinh pH 3.4.2 Khả bền nhiệt chất kháng sinh Khả bền với nhiệt độ chất kháng sinh đặc điểm cần nghiên cứu để phục vụ cho công nghệ tách chiết tinh chế chất kháng sinh có hiệu cao Để xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh chủng HT17.8 HT28, tiến hành lên men chủng môi trường thích hợp Thu dịch kháng sinh, xử lý với nhiệt độ mức 40 0C, 600C; 800C; 1000C khoảng thời gian 20, 40, 60 phút Hoạt tính kháng sinh dịch xử lý xác định phương pháp đục lỗ Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.10 37 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng sinh dịch lọc sau xử lý nhiệt độ khác Ký hiệu Thời gian chủng xử lý (phút) Chủng HT17.8 Chủng HT28 Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) 400C 600C 800C 1000C Đối chứng 20 22,3 ± 0,49 22,3 ± 0,45 22,2 ± 0,57 22,1 ± 0,45 40 21,9 ± 0,69 21,9 ± 0,49 21,8 ± 0,33 21,6 ± 0,53 22,5 ± 0,53 60 21,7 ± 0,37 21,6 ± 0,33 21,3 ± 0,69 21,0 ± 0,73 20 20,8 ± 0,24 19,3 ± 0,28 19,0 ± 0,16 18,9 ± 0,20 40 20,5 ± 0,08 19,2 ± 0,73 18.1 ± 0,20 14,4 ± 0,20 20,8 ± 0,49 60 17,4 ± 0,45 17,3 ± 0,24 15,0 ± 0,16 5,40 ± 0,37 ( Đối chứng: Dịch kháng sinh chưa xử lý với nhiệt độ ) 38 Hình 3.10 HTKS dịch lọc sau xử lý nhiệt độ khác Từ kết trên, nhận thấy khả bền với nhiệt độ chất kháng sinh chủng HT17.8 HT28 có khác rõ rệt + Chủng HT17.8, hoạt tính kháng sinh thay đổi sau xử lý mức nhiệt độ khác Ở 40 0C 20 phút đầu hoạt tính kháng sinh thay đổi Ngay 100 0C kéo dài 60 phút, hoạt tính kháng sinh khoảng 93% so với đối chứng (hình 3.11) Do việc tách chiết sử dụng bảo quản chất kháng sinh chủng HT17.8 không gặp trở ngại nhiệt độ 39 + Chủng HT28, hoạt tính kháng sinh có thay đổi rõ rệt xử lý mức nhiệt độ khác Ở 400C 20 phút đầu HTKS không thay đổi thay đổi Tuy nhiên tăng mức nhiệt độ thời gian xử lý HTKS giảm rõ rệt Ở 100 0C kéo dài 60 phút, hoạt tính kháng sinh khoảng 26% so với đối chứng (hình 3.11) HT17.8 HT28 Hình 3.11 HTKS dịch lọc xử lý nhiệt độ khác vòng 60 phút Đã có nhiều nghiên cứu khả bền nhiệt chất kháng sinh xạ khuẩn, có nhiều kháng sinh bền với nhiệt độ, 100 0C kéo dài tới 60 phút, hoạt tính kháng sinh khoảng 80% [19] giảm chút [14] Tuy nhiên, có nhiều chất kháng sinh bền với nhiệt độ, 50 0C, HTKS bị giảm hoàn toàn [22] So sánh với kết cho thấy 100 0C 60 phút hoạt tính kháng sinh chủng HT28 với tỷ lệ thấp HTKS chủng HT17.8 với tỷ lệ cao Chứng tỏ chất kháng sinh tổng hợp từ chủng HT28 thuộc loại bền với nhiệt độ, nên tách chiết sử dụng bảo quản chất kháng sinh nhiệt độ không 50 0C để bảo đảm hoạt lực kháng sinh Còn chất kháng sinh tổng hợp từ chủng HT17.8 bền với nhiệt độ, chất kháng sinh chịu nhiệt thuận lợi cho việc tách chiết chúng nghiên cứu 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã kiểm tra hoạt tính kháng sinh hai chủng xạ khuẩn HT17.8 HT28 nhận thấy hai chủng giữ hoạt tính cao, ổn định, có hoạt phổ rộng, ức chế hai nhóm vi khuẩn Gram âm Gram dương Đã xác định môi trường Gause môi trường lên men kháng sinh thích hợp cho chủng xạ khuẩn HT17.8 Đã khảo sát loại dung môi để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối loại dung môi để tách chiết chất kháng sinh từ dịch ngoại bào cho hai chủng HT17.8 HT28, đồng thời xác định dung mơi thích hợp nhất:  Chủng HT17.8: Trong sinh khối dung môi tách chiết tốt n-propanol dịch ngoại bào dung môi tách chiết tốt n-butanol tách chiết có hiệu cao điều kiện pH =  Chủng HT28: Trong sinh khối dung môi tách chiết tốt etanol dịch ngoại bào dung môi tách chiết tốt iso butanol tách chiết có hiệu cao điều kiện pH = Đã xác định số tính chất chất kháng sinh từ hai chủng HT17.8 HT28  Chất kháng sinh chủng HT17.8 thuộc loại bền với nhiệt độ Ở 100 0C 60 phút, hoạt tính khoảng 93% so với đối chứng 41  Chất kháng sinh chủng HT28 thuộc loại bền với nhiệt độ Ở 100 0C 60 phút, hoạt tính giảm 26% so với đối chứng  Chất kháng sinh hai chủng HT17.8 HT28 thuộc loại bền với pH Hoạt tính kháng sinh giữ dải pH từ đến KIẾN NGHỊ Hai chủng xạ khuẩn HT17.8 HT28 hai chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, hoạt phổ rộng Vì cần tiếp tục nghiên cứu nội dung sau: Phân loại chủng HT17.8 Tiếp tục nghiên cứu để hồn thiện quy trình tách chiết chất kháng sinh Xác định chất hóa học chất kháng sinh hai chủng nghiên cứu 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt Ngơ Đình Quang Bính, Vi sinh vật học cơng nghiệp, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Trang 53-71, 2005 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất (NXB) Khoa học (KH) Kỹ thuật (KT) Hà Nội, 2004 Nguyễn Lân Dũng (dịch), N X Egrov (hiệu đính), Thực tập vi sinh vật học, NXB KH KT, Hà Nội, Trang 73-81, 1983 Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội, Trang 101-109, 1972 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, Vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến, Vi sinh vật học, tập 1, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Thái Nguyên, 2008 43 Đỗ Thu Hà, Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng phân lập từ đất Quảng Nam, Tạp chí Sinh học tập 24, số 1, Trang 5, 2001 10 Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội, 2004 11 Nguyễn Bá Hiên, TS Hoàng Hải, PGS TS Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB GD, 2006 12 Trịnh Ngọc Hồng, Nghiên cứu tính đối kháng xạ khuẩn với số vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009 13 Lê Mai Hương, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993 14 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 15 Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, Cơ sở công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Giáo dục, 2010 16 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất Y học Hà Nội, Trang 7-20, 2005 17 Phan Quốc Kinh, Cơng nghiệp hóa chất, thơng tin kinh tế & Công nghệ, số 1, 2004 18 Biền Văn Minh, Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ, Nhà xuất (NXB) Đại học Sư phạm (ĐHSP) Hà Nội, 2002 19 Liễu Thị Phương, Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với số vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện, Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Thái Nguyên, 2008 44 20 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền, Giáo trình vi sinh vật học nơng nghiệp, NXB ĐHSP, 2003 21 Bùi Thị Tho, Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi, NXB Hà Nội, 2003 22 Nguyễn Thị Thu Thủy, Hoàng Thị Kim Hồng, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa màu Thừa Thiên – Huế, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn Quốc, 2009 23 Trần Thị Cẩm Vân, Giáo trình vi sinh vật học mơi trường, NXB ĐHQG Hà Nội, 2001 B Tài liệu tiếng anh 24 Newman D J, Cragg G.M, Snader K M, Natural products as sourees of new drugs over the period, J Nat Prod, 66, 1022-1037, 2003 25 Paul Singleton, Diana, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edi, Sainburg, John Willey & Son, 1999 26 Waksman, S.A., The actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 1961 45 ... trên, từ chủng xạ khuẩn phân lập Thái Nguyên, thực đề tài: Nghiên cứu tách chiết tìm hiểu tính chất chất kháng sinh có nguồn gốc từ số chủng xạ khuẩn phân lập Thái Nguyên Mục tiêu nghiên cứu - Tìm. .. tách chiết chất kháng sinh từ hai chủng xạ khuẩn HT17.8 HT28 - Xác định số tính chất chất kháng sinh từ hai chủng HT17.8 HT28 Nội dung nghiên cứu - Kiểm tra mức độ ổn định HTKS chủng nghiên cứu. .. 8000 chất kháng sinh biết giới, có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4] Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng Trong số có nhiều chất sử dụng y học để điều trị bệnh