Nghiên cứu tách chiết phospholid để chế tạo liposom và bước đầu thử tác dụng lipsom trên chuột thực nghiệm

BỌ GIAO DỰC VA ĐAO TẠO IK) Y TE TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC D ợ c HÀ NỘI ĩỊ« s tt 8*: :! t :[ t :[ t sỉ« ĩ Ị ĩ : | : :Ị t HÁN MẠNH HƯNG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHOSPHOLIPID ĐỂ CHẾ TẠO UPOSOM VÀ BƯỚC ĐẦU THỬTÁC DỤNG LIPOSOM TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM C huyên n g n h : D uọc lý - Dược lâm sàng M ã số : 03 02 02 LUẬN VĂN T H Ạ C SỸ I ) ợ c H Ọ C H n g dẫn kh o a h ọ c : P G S T S N guyễn X u ân T h ắ n g H N ộ i - 2001 J lfii e ả n t ổ n Qíỗi xỉn bàụ, iỏ b iết đít sâ n Aắe ió'i ^Ị)(Ậ$.rJiS Q ĩg u ụ ễit (X)uản r ĩliắ iK ị, eiiủ tth iệ n t hộ m ò n 'lơ e rSỈ/th ỉvtKỊ (Đ ọ i h ọ a Q)ượe W)à Q ĩộ i - Iiựu’ò ’1 th ầ ụ íitêtt- Infill (td I f (Ị lù êti, ờíi lúi tơ i tr ê n ũtìíỉ íTỉitỉitụ h ọ e t ậ p , rtụ k iêit etíit k h o a h ọ e từi đ ã tíà tiỉt tơ tơ i s ự iú p đ õ q u ý Íịỉtí (tê t ô i h o n ih tiu h ín ộ tt n ả n củ titìn ỉt £7ồ i x i n (< e (tô U ặ ỗ o t ìn h b o th u ậ t x in h , ụ iú p itê b ù ụ rB ộ Ịĩiê tt lò n tỊ đ iễ u th n h b ìê t ổ n e iiittj iú n n iô tt ĩtở , tạ o h o n tỏ r Ỉ)Ù Ú C ‘ ỉ t ị , ítỉê n ỉu ậ tt n ả n e ỉtă r t t h ỉ rB ộ tíitiậ n c n iítà n h b ộ m n lố i tià tó ! e ẩ a e ò n tỊ ttỉiâ tt rỉ ) u ọ e J lả m fjto th tj cỗ ụ iú o , lủ ê tt 03 ộ tttô ti i n q tơ i ỉt/iữ ttạ lí ĩtã ỉâ n / ỉí'( 'ít ợ iiụ H Ù ỊỊ Q ĩltâ u flip, ttàụ., tơ i eiintf scùt e ỉiâ ti th tih c â m ón (D ả ttụ ttị’/ , OSftti tjifin t h iê n t fỊ)tià iitj ità ft!f> tan íTíti /to e íitiò in / pháp ch ế lạo liposom 12 ì 4.6 Tiêu chuẩn ílạn,í> thuốc Uposom 13 ì 3.7 Nghiên cứu tỷ lệ phospholipid tạo liposom 13 ì 3.8 Nghiên cứu Iiăiìíị bọc ihitòc liposom 11 ì 3.9 Â p (I ị i i i ị > h im sàn,tỉ củ a Hposom 16 1.4 Thử khả bọc thuốc ciìn liposom trcn chuột 1.4.1 Thứ độ UIÌ lồn 1/1.2 Thứ khả luhỉỉi học ilm ò r n íd ìiposom II CII chuột CỊIIIỊ Irdnx PIIẤN : NÍỈUYKN IJKU, f X >1 m O N ( ỉ VẢ PIIƯONCỈ PHÁP N(Ỉ1HÍ;N l i m I 71 21 •>■> 23 * Ngun liệu, dối tuợiií* plmig tiện nghiên CÚII 2 ( ac phương phỉip nghiên cứu 24 2 I ớch c h iế t p h o s p h o lip id hằn,i> cồn 2.2.2 rim'oiix pháp tácli ( hiêí phospholipid h(ìit,í> hệ dung mòi Chloroform : 25 clIk mol 2.2.3 Phuifnv, pháp mill ché vù xức (lịnh mức (lộ linh ('lia 26 phospholipid 2.2.4 riìiíơiìíị pháp ílịnlì lính phospholipid 26 2.2.5 riuroiiịi pháp clịnli lưựiỉỉi phospholipid 27 2.2.6 1’hưo'itỉỉ pháp chế tạo lipnsom 27 2.2.7 Đánh Ịịiứ liêu chuẩn liposom 27 2.2.8 Xác định hùm lượng phospholipid tạo liposom 28 2.2.9 riníoniỊ pliáp nạhiên cứu khả nâng bọc llutòc ỉiposom 28 2.2.ỈO.riìii'f)'nf> pháp llm dồ mức (lộ an tồn ( till lipòsom Irên chuột 28 thực Iì'.’lìiệ iìi 2.2.11 riiiKỉìiiị pháp thứ tác (lụiiỉ> dược ly liposom học dược chút C> trẽ n ch u ộ t 2.2.12 Xử lý sô' liệu 2l) 1*11 ẤN 3: KKT Q U Ả NGIIIKN ( ' l í l ỉ 3.1 Kết lách chiết linh ché phospholipid từ gan, thận, phổi, Um vĩì 30 niĩo lợn I ch ( lii(ú p h o s p h o lip id b ằ n \ị cồn M) 3.1.2 Tách chiết phospholipid hằììỊ> hệ clniỉịì mòi CHCI.ị : C I 1^)11 31 3.1.3 Định línli phospholipid 35 3.1.4 Định lượng phospholipid 36 3.2 Két xác định múc dộ tinh khiết phospholipid sau tinh chê 40 3.3 Két chế tạo dánh giá tiêu chuiỉn liposom 41 3.3.1 í)it’ll ch ế liposom (lộ phospholipid khác nhan 4! 3.3.2 Đánh iịiá liêu chuẩn Uposom 42 3.3.3 th in lì ỉ>i(í bọc thuốc (líu liposom A2 3.4 Kél qua tham dò tác 0,05 9,71± 0,44 8,02 ±0,40 p < 0,05 11,98 ±0,36 9,47 ±0,45 p < 0,05 13,48 ±0,39 11,86 ±0,43 p< 12,07 ±0,36 13,27 ±0,44 p < 0,05 Ị 1,42 ±0,39 12,90 ±0,39 p < 0,05 8,71 ±0,37 12,27 ±0,35 p< , 0 6,53 ±0,42 ‘10,94 ±0,41 p< , 0 6,28 ±0,38 9,45 ±0,36 p< , 0 6,27 ±0,43 8,67 ±0,38 p< , 0 10 6,28 ±0,39 7,46 ±0,34 p < 0,05 11 6,24 + 0,36 6,67 ±0,33 p > 0,05 6,25 ±0,31 , 1 , 0 ( p > 0,05 khác biệt k lỏng có ý nghĩa ihống kê so sánh Ihời gian nhóm chứng nhóm thử ) m m ol / Hình 3.3 Sự biến đổi đườììg huyết chuột sau tiêm ịtính llieo ỉìồỉìg độ mmoUl) 50 N hận xét: Từ kết cho Ihấy Lô chứng: Sau liêm hydrocorlison với liều 20m g/kg nồng độ glucose huyết chuột tăng dần lừ Ogiờ đến đạt đỉnh cao lúc (13.48 ± 0,36 tăng 115,68% so với ban đầu Sau giảm dần thứ tư, thứ năm trở trạng thái ban đầu thứ tám trở Lô thử liposom bọc hydrocortion với liều 20m g/kg nồng độ glucose huyết chuột tăng chậm sau (p < 0,05), (p < 0,05), giò (p < 0,001) so với lơ chứng Thời gian đạt nồng độ glucose huyết cao sau Sau nồng độ glucose huyết chuột giảm chậm so với lô chứng thứ năm (p < 0,05), thứ sáu (p < 0,001) tiếp lục giảm thứ lám, thứ chín trở trạng thái bình thường thứ mười m ột ( p > 0,05) Như lô tiêm liposom m ang hydrocortison nồng độ glucose huyết chuột tăng chậm so với lô chứng đạt đỉnh tác dụng chậm (lô chứng đạt đỉnh lúc giờ, lô thử đạt đỉnh lúc giờ) sau tiêm sau nồng độ glucose giảm từ từ chậm Chứng tỏ hydrocortison bọc liposom kéo dài tác dụng thuốc lên đến Q ua nghiên cứu khảo sát biến đổi nồng độ glucose huyết chuột (tính m m ol/ ) với dược chấl hydrocortison dạng liposom m ang hydrocortison lăng lên so với dưực chất không bao Thời gian tác dụng dạng liposom kéo dài (lừ lên 10 giờ) Tuy chưa kéo dài thời gian tác dụng thuốc nhiều chứng tỏ điều ch ế dạng liposom làm lăng tính thấm kéo dài tác dụng thuốc 3.4.3 Thử tác dụng dược lý liposom bọc insulin Điều chế liposom m ang insulin có hàm lượng 1,5 U l/m l hỗn địch cách lạo liposom bọc insulin phương pháp nêu trơn Sau thử tác dụng liposom m ang insulin với nhóm chứng dung dịch insulin với liều 3U I/kg chuột cống trắng (mỗi lô chuột) Kết tác dụng ức chế trình tăng glucose huyết cho chuôi uống glucose với liều 3g/kg đồng thời tiêm thuốc kết thu bảng 3.18 11 B ả n g l8 : Khảo sát sụ biến đổi đường huyết chuột ( tính bắng inmol/l) sau tiêm lỉposoin mang insulin insulin vói liều 3UI/kg đồng thòi cho chuột uống glucose 3g/kg trẽn chuột cống trắng (mỗi lô con) Thời gian (giờ) Lơ thử (tiêm liposom • mang insulin) Lố chứng (tiêm insulin) 5,97 ±0,35 6,04 ±0,38 7,83 ±0,39 9,25 ±0,36 5,12 ± 0,41 8,46 + 0,39 Giá trị p Ghi p > 0,05 Tiêm thuốc cho chuôt uống glucose lần i p < 0,05 p< , 0 Cho chuột uống glucose lần 10,05 ±0,40 8,22 ±0,42 7,16 ±0,45 8,25± 0,47 6,01 ±0,38 5,96+0,45 10,85 ±0,46 8,84 ±0,46 9,63 ±0,51 6,21 ±0,42 7,82 ±0,49 6,09 ±0,37 p< , p < 0,05 p > 0,05 p< p< Cho chuột uống glucose lần , , 0 p< , (p > 0,05 khác biệl khổng có ý nghĩa Ihống kổ so sánh thời gian nhóm chứng nhóm Ihử) N hận xét : Kết cho ihấy : sau lô liêm insulin đồng thời cho uống glucose đường huyết chuộl lăng chậm so với lô tiêm lipơsơm m ang insulin (lô chứng tăng 31,16% so với ban đẩu, lô tiêm liposom tăng 53,15 % so với ban đầu) với p s p p - 122 21 G reg o ry G re g o ria d is (1995), " engineering liposomes lor drug delivery: progress and problemcs", Trend in Biotechnology, Vol 13 No 12 Elscvicw Science Ltd - UK, pp 527 - 536 22 I la r r y J D euel (1951), Lipid: their chem istry and biochem istry Vol I - New Yok, lntcrsci, PP.405 - 472 23 H iro fu m i A i, S a to sh iin o h ri (1997), tìioscience, Biotechnology and biochem istry, Vol 61, N o l.p p 191 - 193 24 J a n tz e n a n d R o b iso n (1996), M odern Pharm aceutical, third ecldilion, M arcel dekkcr NewYork, p p - 598 25 J o h n M G h a m a n d J o a n A H iggins (1997), M em brane analysis pp - 10 26 L aurence D M ayer (1996), Analytical Biochemistry, Vol238, N ol, pp 29 - 33 27 L ehninger.A L , Nelson, D.L cox (1993), Principles o f Biochemistry, Worth publisher, New York, pp.55-58 28 M in o ch a R , W all.A et al (1987), "Phospholipid dependence o f rat brain m icrosom al glucose - phosphal phosphohydrolase", Biocheui - lilt \ OÌ 14 No3, PP 483 - 490 29 N icovan poo jen , J e ro e n B a k k e r (1997), T rend ill Biotechnology, \ 015, N o 5, pp - 30 II O k a in o to et al (1988), Lessons fro m anim al diabetes, London publish house, pp 313 - 334 31 P h ilip K B ondy, L eon - E R o se n b e rg (1980), M etabolic control and diseases, W B S a u n d e rs p re ss CO, pp - 56 32 P o ssm ay e r s H w a, M W eb e r (1984), "Pulm onary Surfactant" Biochcm Cellbiol Vol 62, pp.l 122 - 124 33 R ic h a rd L A u ten et al (1990), "Surfactant treatm ent o f l'ulllenn new borns with respiratory failure", Pediatrics, Vol 84, No 1, pp 101 107 R o d e ru H p h ib s et al (1991), "Initial clinical trial o f Exosurf, a protein free synthetic surfactant lor the prophylaxis and early treatm ent of Hyaline m em brane disease", P ediatrics, Vol 8 , N o.l , pp - 35 R o n ald E Ilo e k s lra el al (1991), "Improved neonatal survival following m ultiple dose ol‘ bovine surlaclanl in very prem ature neonates at risk lor respiratory distress syndrom e", Pediatrics, Vol 88, N o l, pp 10 - 18 36 Stephen L E C K and Jam es M W ilson (1996), Good mail and Gihnan's the pharmacological basic o f iherapciiiics, Niìilỉì Edition , Qiaplcr 5, pp 89 - 90 37 N guyen X u ân T h n g (1980) "ElTecl OĨ phospholipid on the activity of A denylate cyclase solubilized from rabbit heart m em brane", Agressoỉgic /, pp - 38 N guyễn X u â n T h ắ n g , A B o rso d i a n d M W o llein an n (1980), "Effects o f phospholipid on llic binding OỈ' [' Hj dihydroalpreiiolol to the [3adrenergic - receptor or rabbit heart m em branes", Biochcm icai pharm acology Vol 29, pp 2791 - 2797 39 T h o m a s R T rillo n , S a n d A m a n plicrcc a n d A hm c - S arto rcIIo (1997); B io ch em ica l pltai Vol 26, |>p 2319 - 2322 40 V a n c a n t V R a n a d e liia iifrcd A - Ilo lin g c r (1996) N ovel - Drug delivery system , Marcel dckker, NcwYork, pp - 17 TIẾNG PHẤP 41 N guven X uan T h an g (1983), "Une method des preparation de liposome au la b o to ire ", R evue p h a m a ceu ú iỊu c - lùlilioììs mcdiculcs ĩỉa n o i, p.62 - fi.'v ... ý để nghiên cứu tách chiết phospholipid làm nguyên liệu điều chế liposom cho m ột dạng thuốc tác dụng đích 12 1.3.5 C ác phương ph p chê tạo Kposom [7], [41] Có nhiều phương pháp chế tạo liposom. .. kill hci, cho pliíiìm dang giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng Ở V iệt N am dạng thuốc liposom chưa nghiên cứu áp dụng vào điều trị, thố giới nhấ nghiên cứu lại đặc biệt quan tâm đến hệ điều... thấm vào lế bào, người ta nghiên cứu đưa enzym vào liposom đổ khắc phục hạn chế nói Cho đến nay, lất nhiều enzym nghiên cứu ch ế tạo dạng liposom lysozym e, hexokinase, am inoglycosidase Q ua nghiên