Nghiên cứu tách chiết catechin từ lá chè shan camellia sinensis var shan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Somedeth INTHAVONG Nghiên cứu tách chiết catechin từ chè Shan Camellia sinensis var Shan LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Somedeth INTHAVONG Nghiên cứu tách chiết catechin từ chè Shan Camellia sinensis var Shan Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Vũ Hồng Sơn Hà Nội – 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc -BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Somedeth INTHAVONG Đề tài luận văn: Nghiên cứu tách chiết Catechin từ chè Shan (Camellia sinensis var Shan) Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số SV: CB 170328 Tác giả, người hướng dẫn khoa học hội động chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp hội động ngày 30/05/2019 với nội dung sau: - Đã sửa lại toàn lỗi tả sửa lại phần văn phong chưa đạt - Đã bổ sung thêm thảo luận phần kết nghiên cứu - Đã viết lại phần kết luận ngắn gọn, súc tích trọng tâm - Đã bổ sung phần phương pháp nghiên cứu ghi rõ nguồn nguyên liệu đánh giá chất lượng chè Ngày tháng năm 2019 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS Vũ Hồng Sơn Tác giả luận văn Somedeth INTHAVONG CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ( Ký ghĩ rõ tên ) Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập Việt Nam, với cố gắng nỗ lực phấn đấu tiến hành triển khai theo kế hoạch thí nghiệm, với giúp đỡ thầy cô, anh chị, bạn bè em sinh viên khoá làm nghiên cứu phịng thí nghiệm C4-204 Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm trường ĐH Bách Khoa Hà Nội… tơi hồn thành luận văn Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới TS Vũ Hồng Sơn tận tình truyền đạt kiến thức trực tiếp hướng dẫn Tôi xin cảm ơn thầy cô đại sứ quán Lào Việt Nam tạo điều kiện cho học thạc sỹ; thầy cô Bộ môn Quản lý chất lượng tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin bày tỏ biết ơn đến bố mẹ, chồng trai tơi, người thân gia đình động viên chia sẻ, giúp tơi có đủ nghị lực vượt qua khó khăn sống để tơi học tập hoàn thành luận văn Học viên Somedeth INTHAVONG HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn luận văn kết nghiên cứu thân em sinh viên hệ Đại học thực hướng dẫn thầy TS Vũ Hồng Sơn Những số liệu đưa hồn tồn trung thực, khơng vi phạm quyền tác giả Học viên Somedeth INTHAVONG HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục, chữ hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị ……………………………………………………… Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt……………………………………………… Mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét giới thiệu chè Shan 1.1.1 Đặc điểm 1.1.2 Nguồn gốc chè Shan 1.1.3 Phân loại chè Shan 1.1.4 Tác dụng chè Shan 1.2 Thành phần hóa học chè Shan[6] 1.2.1 Nước 1.2.2 Các sắc tố 1.2.3 Nhóm hợp chất phenol 1.2.3.1 Các hợp chất polyphenol chè 1.2.3.2 Flavonoid 1.2.3.3 Các hợp chất Catechin 12 1.2.3.4 Các hợp chất Anthoxanthin 17 1.2.3.5 Các hợp chất Anthocyanin 19 1.2.4 Enzyme 21 1.2.5 Protein 22 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 22 1.3.1 Phương pháp trích ly thu dịch chè 22 HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn 1.3.1.1 Lựa chọn phương pháp trích ly thu dịch chè 22 1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly 23 1.3.2 Công nghệ tách tinh chế polyphenol-catechin từ chè [13], [14] 25 1.3.2.1 Chiết tách chlorophyl, cafein chất khác 25 1.3.2.2 Chiết tổng hợp polyphenol-catechin 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Hóa chất 26 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu .26 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp phân tích 28 2.3.1.1 Xác định độ ẩm ( TCVN 5613-2015 )[5] 28 2.3.1.2 Xác định hàm lượng chất hòa tan ( TCVN 5610-1991 ) [4] 28 2.3.1.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Trong nghên liệu TCVN… 29 2.3.1.4 Xác định hàm lượng anthocyanin( TCVN 11028 - 2015) .31 2.3.1.5 Xác định hàm lượng polyphenol tổng Trong dịch chè TCVN 974532 2.3.1.6 Xác định hàm lượng cafein theo phương pháp BERTRAND [9] .35 2.3.2.1 Tiến hành thí nghiệm 36 2.3.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly dịch chè 37 a Khảo sát yếu tố nhiệt độ 37 b Khảo sát yếu tố thời gian .38 c Khảo sát yếu tố pH 39 d Khảo sát yếu tố tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu 39 2.3.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách, tinh chế pp-catechin 40 a Khảo sát dung môi clorofooc diclometan .40 c Khảo sát yếu tố tỷ lệ clorofooc/dịch chè .42 d Khảo sát yếu tố tỷ lệ etyl acetat/dịch chè .42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………… 45 HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn 3.1 Kết khảo sát nguyên liệu 45 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly dịch chè 46 3.1.1 Khảo sát yếu tố nhiệt độ 46 3.1.2 Khảo sát yếu tố pH 47 3.1.3 Khảo sát yếu tố thời gian 47 3.1.4 Khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/nguyên liệu .48 3.2 Tối ưu trình trích ly polyphenol anthocyanin phương pháp quy hoạch thực nghiệm 49 3.2.1 Xây dựng mô hình 49 3.2.2 Tối ưu hóa .56 3.3 Khảo sát dịch chè 57 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách, tinh chế pp-catechin 58 3.4.1 Khảo sát dung môi số lần chiết clorofooc/diclometan 58 3.4.2 Khảo sát số lần chiết etyl acetat 59 3.4.2 Tỷ lệ dung môi clorofooc/dịch chè 60 3.4.3 Tỷ lệ dung môi etyl acetat/dịch chè 60 3.4.4 Nồng độ dịch chè 61 3.5 Tối ưu hóa trình tách, tinh chế pp-catechin phương pháp quy hoạch thực nghiệm 62 3.5.1 Xây dựng mơ hình 62 3.5.2 Ảnh hưởng yếu tố tới trình tách chiết pp-catechin 65 3.5.3 Tối ưu hóa .68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .69 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC .72 HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT C (+) – Catechin EC (-) – Epicatechin ECG (-) – Epicatechin gallate EGC (-) – Epigallocatechin EGCG (-) –Epigallocatechin gallate GC (+) – Gallocatechin GCG (+) – Gallocatechin gallate UAE Phương pháp hỗ trợ siêu âm PP Polyphenol OXH ơxi hố HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 - Các pp-catechin chính có chè xanh 12 Bảng 2.1 - Dung dịch chuẩn axit gallic pha loãng 33 Bảng 2.2 - Khảo sát yếu tố nhiệt độ trình trích ly 37 Bảng 2.3 - Khảo sát yếu tố thời gian trình trích ly 38 Bảng 2.4 - Khảo sát yếu tố pH trình trích ly……………………………….39 Bảng 2.5 - Khảo sát yếu tố dung môi/nguyên liệu q trình trích ly 40 Bảng 2.6 - Khảo sát yếu tố tỷ lệ clorofooc /dịch chè 42 Bảng 2.7 - Khảo sát yếu tố tỉ lệ etyl/dịch chè 43 Bảng 2.8 - Khảo sát yếu nồng độ 43 Bảng 3.1 - Kết khảo sát nguyên liệu chè khô 45 Bảng 3.2 - Giá trị mã hóa thực nghiệm yếu tố thực nghiệm q trình trích ly .50 Bảng 3.3 - Các thí nghiệm tiến hành kết 51 Bảng 3.4 - Kết phân tích hồi quy hiệu suất trích ly polyphenol (Y1) 52 Bảng 3.5 - Kết phân tích hồi quy hiệu suất trích ly anthocyanin (Y1) 53 Bảng 3.6 - Độ hấp thụ màu axit gallic λ = 765nm .57 Bảng 3.7 - Khảo sát dịch chè 57 Bảng 3.8 - Khảo sát hiệu tách cafein dung môi Clorofooc Diclometan .59 Bảng 3.9 - Giá trị mã hóa thực nghiệm yếu tố thực nghiệm 63 Bảng 3.10 - Các thí nghiệm tiến hành kết 63 Bảng 3.11 - Kết phân tích hồi quy hiệu suất tách, tinh chế Cafein (Y1) 64 Bảng 3.12 - Kết phân tích hồi quy hiệu suất tách, tinh chế pp-catechin (Y2) 64 HV: Somedeth INTHAVONG – CB170328 Luận văn Thạc Sĩ Anthocyanin GVHD: TS Vũ Hồng Sơn = -1352.58 * Nhiet 11.18653 540.9971 * pH 8.74385 * Thoi gian -27.1944 * Dmoi/Nlieu -3.50967 * pH * Thoi gian 6.43834 * pH * Dmoi/Nlieu 0.22039 * Thoi gian * Dmoi/Nlieu -0.07038 * Nhiet do^2 -64.0935 * pH^2 -0.24766 * Dmoi/Nlieu^2 The Diagnostics Case Statistics Report has been moved to the Diagnostics Node In the Diagnostics Node, Select Case Statistics from the View Menu Proceed to Diagnostic Plots (the next icon in progression) Be sure to look at the: 1) Normal probability plot of the studentized residuals to check for normality of residuals 2) Studentized residuals versus predicted values to check for constant error 3) Externally Studentized Residuals to look for outliers, i.e., influential values 4) Box-Cox plot for power transformations If all the model statistics and diagnostic plots are OK, finish up with the Model Graphs icon Phụ lục 3: Constraints Lower Upper Lower Upper Name Goal Limit Limit Weight Weight Importance A:Nhiet 60 90 1 1 is target = 75.00 B:pH is in range HV: Somedeth Inthavong – CB17023 79 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn C:Thoi gian is in range D:Dmoi/Nlieu Polyphenol 40 60 is target = 15.00 1 10 20 1 maximize 19.6551 64.2906 1 Anthocyanin maximize 11.0193 72.2321 Solutions Number Nhiet pH Thoi gian Dmoi/Nlieu pp-catechin Anthocyanin Desirability 75.00 4.00 40.00 15.00 56.0329 72.0922 0.933 Selected 75.00 4.00 40.10 15.00 55.9858 71.8911 0.932 75.00 4.00 40.00 15.09 56.2639 72.0849 0.932 74.87 4.00 40.00 15.00 56.0151 72.0073 0.932 75.23 4.00 40.00 15.05 56.18172.2315 75.00 3.99 40.00 15.00 55.7213 72.2122 75.00 4.00 40.00 15.16 56.4216 72.0770.931 75.00 4.00 40.25 15.01 55.9373 71.6031 74.61 4.00 40.00 15.00 55.9807 71.8360.928 10 75.80 4.00 40.11 15.00 56.0698 72.3249 0.928 11 75.00 3.99 40.00 15.26 56.1512 72.2317 0.925 12 75.00 3.97 40.00 15.00 54.9984 72.4644 0.925 13 75.00 4.00 40.63 15.00 55.7406 70.8436 0.924 14 75.00 4.00 40.00 15.51 57.2706 71.9991 0.923 15 76.33 4.00 40.21 15.00 56.0673 72.3749 0.923 0.932 0.931 0.930 Phụ lục 4: Phân tích hồi quy với mơ hình tối ưu hiệu suất tách Cafein ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Source Squares df Square Value Prob > F Model 1613.37 179.26 32.23 0.0007 A-Do Bx 195.63 195.63 35.17 0.0019 B-Clorofooc/DC 272.66 272.66 49.01 0.0009 HV: Somedeth Inthavong – CB17023 significant 80 Luận văn Thạc Sĩ C-Etyl axetat/DC GVHD: TS Vũ Hồng Sơn 167.55 167.55 30.12 0.0027 AB 0.000 0.000 0.000 1.0000 AC 10.93 10.93 1.97 0.2199 BC 563.71 563.71 101.34 0.0002 A2 397.36 397.36 71.43 0.0004 B2 14.98 14.98 2.69 0.1617 C2 2.38 2.38 0.43 0.5419 27.81 5.56 Lack of Fit 9.38 3.13 0.34 0.8040not significant Pure Error 18.43 9.21 1641.18 14 Residual Cor Total The Model F-value of 32.23 implies the model is significant There is only a 0.07% chance that a "Model F-Value" this large could occur due to noise Values of "Prob > F" less than 0.0500 indicate model terms are significant In this case A, B, C, BC, A2 are significant model terms Values greater than 0.1000 indicate the model terms are not significant If there are many insignificant model terms (not counting those required to support hierarchy), model reduction may improve your model The "Lack of Fit F-value" of 0.34 implies the Lack of Fit is not significant relative to the pure error There is a 80.40% chance that a "Lack of Fit F-value" this large could occur due to noise Non-significant lack of fit is good we want the model to fit Std Dev 2.36 R-Squared 0.9831 Mean 20.11 Adj R-Squared 0.9525 C.V % 11.73 Pred R-Squared 0.8832 PRESS 191.62 Adeq Precision 22.142 The "Pred R-Squared" of 0.8832 is in reasonable agreement with the "Adj R-Squared" of 0.9525 "Adeq Precision" measures the signal to noise ratio A ratio greater than is desirable Your ratio of 22.142 indicates an adequate signal This model can be used to navigate the design space HV: Somedeth Inthavong – CB17023 81 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn Coefficient Standard 95% CI 95% CI Factor Estimate df Error Intercept 27.15 1.36 23.64 30.65 A-Do Bx -4.95 0.83 -7.09 -2.80 1.00 B-Clorofooc/dich che 5.84 0.83 3.69 7.98 1.00 C-Etyl axetat/dich che -4.58 0.83 -6.72 -2.43 1.00 AB 0.000 1.18 -3.03 3.03 1.00 AC -1.65 1.18 -4.68 1.38 1.00 BC -11.87 1.18 -14.90 -8.84 1.00 A2 -10.37 1.23 -13.53 -7.22 1.01 Low High VIF B2 -2.01 1.23 -5.17 1.14 1.01 C2 -0.80 1.23 -3.96 2.35 1.01 Final Equation in Terms of Coded Factors: Hs tach cafein = +27.15 -4.95 *A +5.84 *B -4.58 *C +0.000 *A*B -1.65 *A*C -11.87 *B*C -10.37 * A2 -2.01 * B2 -0.80 * C2 Final Equation in Terms of Actual Factors: Hs tach cafein = -166.74112 +6.99734 * Do Bx +65.40919 * Clorofooc/dich che +39.69813 * Etyl axetat/dich che +5.74704E-015 * Do Bx * Clorofooc/dich che HV: Somedeth Inthavong – CB17023 82 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn -0.38900 * Do Bx * Etyl axetat/dich che -11.87132 * Clorofooc/dich che * Etyl axetat/dich che -0.57434 * Do Bx2 -2.01432 * Clorofooc/dich che2 -0.80298 * Etyl axetat/dich che2 The Diagnostics Case Statistics Report has been moved to the Diagnostics Node In the Diagnostics Node, Select Case Statistics from the View Menu Proceed to Diagnostic Plots (the next icon in progression) Be sure to look at the: 1) Normal probability plot of the studentized residuals to check for normality of residuals 2) Studentized residuals versus predicted values to check for constant error 3) Externally Studentized Residuals to look for outliers, i.e., influential values 4) Box-Cox plot for power transformations If all the model statistics and diagnostic plots are OK, finish up with the Model Graphs icon Phụ lục 5: Phân tích hồi quy với mơ hình tối ưu hiệu suất tách Cafein (sau đã loại hệ số vô nghĩa) ANOVA for Response Surface Reduced Quadratic Model Analysis of variance table Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Source Square df Square Value Model 1602.43 228.92 41.36 A-Do Bx 195.63 195.63 35.34 0.0006 B-Clorofooc/DC 272.66 272.66 49.26 0.0002 C-Etyl axetat/DC 167.55 167.55 30.27 0.0009 BC 563.71 563.71 101.84 F 584.84 181.3 < 0.0001 390.02 390.02 1088.16 < 0.0001 significant B-Clorofooc/dich che 23.54 23.54 65.68 0.0005 121.8 121.8 AB 0.041 0.041 0.11 0.7494 AC 0.14 0.14 0.4 0.5532 BC 0.78 0.78 2.17 0.2011 A^2 15.16 15.16 42.29 0.0013 B^2 7.54 7.54 21.03 0.0059 C^2 32.2 32.2 89.83 0.0002 1.79 0.36 C-Etyl axetat/dich che Residual 339.83 < 0.0001 not Lack of Fit 0.68 0.23 Pure Error 1.11 0.56 586.63 14 Cor Total 0.41 0.7666 significant The Model F-value of 181.30 implies the model is significant There is only a 0.01% chance that a "Model F-Value" this large could occur due to noise Values of "Prob > F" less than 0.0500 indicate model terms are significant In this case A, B, C, A2, B2, C2 are significant model terms Values greater than 0.1000 indicate the model terms are not significant If there are many insignificant model terms (not counting those required to support hierarchy), model reduction may improve your model The "Lack of Fit F-value" of 0.41 implies the Lack of Fit is not significant relative to HV: Somedeth Inthavong – CB17023 86 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn the pure error There is a 76.66% chance that a "Lack of Fit F-value" this large could occurdue to noise Non-significant lack of fit is good we want the model to fit Std Dev R-Squared 0.9969 72.99 Adj R-Squared 0.9914 C.V % 0.82 Pred R-Squared 0.9772 PRESS 13.37 Adeq Precision 44.533 Mean 0.60 The "Pred R-Squared" of 0.9772 is in reasonable agreement with the "Adj R-Squared" of 0.9914 "Adeq Precision" measures the signal to noise ratio A ratio greater than is desirable Your ratio of 44.533 indicates an adequate signal This model can be used to navigate the design space 95% 95% Coefficient Standard CI CI Factor Estimate df Error Low High VIF Intercept 76.4 0.35 75.51 77.29 A-Do Bx -6.98 0.21 -7.53 -6.44 B-Clorofooc/dich che 1.72 0.21 1.17 2.26 C-Etyl axetat/dich che 3.9 0.21 3.36 4.45 AB -0.1 0.3 -0.87 0.67 AC -0.19 0.3 -0.96 0.58 BC -0.44 0.3 -1.21 0.33 A^2 -2.03 0.31 -2.83 -1.23 1.01 B^2 -1.43 0.31 -2.23 -0.63 1.01 C^2 -2.95 0.31 -3.75 -2.15 1.01 Final Equation in Terms of Coded Factors: Hs chiet PP = +76.40 -6.98 *A +1.72 *B HV: Somedeth Inthavong – CB17023 87 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn +3.90 *C -0.10 *A*B -0.19 *A*C -0.44 *B*C -2.03 * A2 -1.43 * B2 -2.95 * C2 Final Equation in Terms of Actual Factors: Hs chiet PP = -5.44713 -0.10264 * Do Bx +12.18797 * Clorofooc/dich che +29.10458 * Etyl axetat/dich che -0.023778 * Do Bx * Clorofooc/dich che -0.044747 * Do Bx * Etyl axetat/dich che -0.44055 * Clorofooc/dich che * Etyl axetat/dich che -0.11217 * Do Bx2 -1.42894 * Clorofooc/dich che2 -2.95296 * Etyl axetat/dich che2 The Diagnostics Case Statistics Report has been moved to the Diagnostics Node In the Diagnostics Node, Select Case Statistics from the View Menu Proceed to Diagnostic Plots (the next icon in progression) Be sure to look at the: 1) Normal probability plot of the studentized residuals to check for normality of residuals 2) Studentized residuals versus predicted values to check for constant error 3) Externally Studentized Residuals to look for outliers, i.e., influential values 4) Box-Cox plot for power transformations If all the model statistics and diagnostic plots are OK, finish up with the Model Graphs icon Phụ lục 7: Phân tích hồi quy với mơ hình tối ưu hiệu suất tách pp-catechin (sau loại hệ số vô nghĩa HV: Somedeth Inthavong – CB17023 88 Luận văn Thạc Sĩ GVHD: TS Vũ Hồng Sơn ANOVA for Response Surface Reduced Quadratic Model Analysis of variance table Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of F p-value Square Value Prob > F 97.31 282.68 Source Squares Model 583.886 A-Do Bx 390.03 390.03 1132.95