Nghiên cứu tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn spirulina và chuyển hóa thành methyl pheophorbide a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành : 60420201 Đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHLOROPHYLL TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA VÀ CHUYỂN HÓA THÀNH METHYL PHEOPHORBIDE A HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN CHIẾN THẮNG HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BÙI THỊ HẢI HÒA Hà Nội - 11/2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố tạp chí chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./ Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019 Tác giả LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: TS Bùi Thị Hải Hịa, Khoa Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Hà Nội – người định hướng, bảo kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ động viên tơi vượt qua trở ngại khó khan suốt thời gian thực luận văn Ban Lãnh đạo Thầy cô Khoa Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thời gian, sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè – người ln bên cạnh, khuyến khích ủng hộ tơi suốt trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019 Tác giả MỤC LỤC MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu tổng quát Mục tiêu nghiên cứu cụ thể Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Tổng quan tảo Spirulina platensis 10 1.1.1 Cấu tạo, hình thái phân loại học 10 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng tảo Spirulina 11 1.1.3 Vai trò ứng dụng Spirulina 11 1.1.3.1 Spirulina, thực phẩm bổ sung hoàn hảo an toàn 11 1.1.3.2 Vai trò tảo Spirulina với sức khỏe người 13 1.2 Chlorophyll q trình chuyển hóa dẫn xuất Chlorophyll 16 1.2.1 Chlorophyll 16 1.2.2 Các phản ứng chuyển hóa số dẫn xuất từ Chlorophyll a 19 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 23 1.3.1 Ngoài nước 23 1.3.2 Trong nước 25 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng 27 2.1.2 Hóa chất thiết bị 27 2.1.2.1 Thiết bị 27 2.1.2.2 Hóa chất 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi nồng độ dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina 30 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất/dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina 30 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hiệu tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina 30 2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ Chlorophyll 31 2.2.5 Phương pháp xử lý tảo Spirulina trước chiết Chlorophyll chiết Sohxlet 31 2.2.6 Phương pháp chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina hệ thống chiết Sohxlet 32 2.2.7 Phương pháp tinh chế lượng nhỏ Chlorophyll a 32 2.2.8 Phương pháp điều chế Methyl Pheophorbide a từ Chlorophyll a 33 2.2.9 Phương pháp tinh methyl pheophorbide a 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nghiên cứu tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a sinh khối tảo Spirulina qui mô PTN 35 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng loại dung môi nồng độ dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina 36 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất/dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina 38 3.3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hiệu tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina 39 3.2 Kết tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối tảo Spirulina hệ thống chiết Sohxlet 40 3.3 Kết định tính tinh hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối tảo Spirulina phương pháp sắc ký mỏng sắc ký cột 42 3.4 Kết chuyển hóa hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo Spirulina thành Methyl phephorbide a xác định cấu trúc methyl pheophorbide a 44 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Các thiết bị…………………………………………………28 Bảng 2: Hóa chất……………………………………………………29 Bảng 3.1: Hàm lượng Chlorophyll thu chiết với dung môi nồng độ dung môi khác (24h chiết) ……………………….37 Bảng 3.2: Hàm lượng Chlorophyll thay đổi tỷ lệ chất/dung môi………………………………………………….……………….39 Bảng 3.3: Hàm lượng Chlorophyll thời gian chiết khác nhau………………………………………………………………….40 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Vịng đời tảo Spirulina…………………………………… 12 Hình 2: Cấu tạo Chlorophyll a Chlorophyll b……………… 19 Hình 3: Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành pheophytin a……21 Hình 4: Phản ứng chuyển hóa Chlorophyll a thành methyl pheophorbide a loại dẫn xuất Chlorin……………………………22 Hình 5: Phản ứng chuyển hóa methyl pheophorbide a thành Chlorin e6 trimethylester…………………………………………………………23 Hình 6: Phản ứng chuyển hóa Chlorin e6 trimethylester thành Chlorin e6 monomethylester(C1) …………………………………………….24 Hình 7: Ống lọc chứa Spirulina bột khơ hệ thống chiết Sohxlet……………………………………………………………….42 Hình 8: Ống lọc Sohxlet trước sau chiết (màu xanh khơng cịn).……………………………………………………………… 42 Hình 9: Tảo bột Spirulina trước phần bã sau chiết Sohxlet… 42 10 Hình 10: Các mẫu dịch chiết Spirulina………………………………43 11 Hình 11: Kết TLC dịch chiết Spirulina [SiO2, (n-hexane: EtOAc: Acetone: MeOH = 7,6:1:1:0,4), Rf = 0,4] phổ UV-VIS acetone……………………………………………………………… …44 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT FDA: Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ SFDA: Cơ quan Dược phẩm Thực phẩm quốc gia Trung Quốc PDT: Liệu pháp quang động - Photodynamic theraphy DMSO: Dimethyl sulfoxit UV/VIS: Quang phổ tử ngoại khả kiến MỞ ĐẦU Ung thư nhiều bệnh lý khác có đặc điểm chung hậu tương tác 03 yếu tố sau: (1) tác nhân gây bệnh, (2) yếu tố môi trường (3) vật chủ (vật chủ người) Hiện nay, phát triến Y học đạt nhiều thành tựu to lớn số liệu nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tử vong ung thư từ năm 1980 đến 2007 có xu giảm rõ rệt, ung thư vấn đề Y tế lớn nhân loại đồng thời thách thức Y học Mục tiêu điều trị bệnh lý ung thư loại bỏ tổ chức ung thư, có nhiều phương pháp điều trị khác phát triển áp dụng thực tiễn điều trị bệnh nhân ung thư như: phẫu thuật (bao gồm ghép tạng), tia xạ (xạ trị liệu), phẫu thuật tia gamma, điều trị hóa chất (hóa trị liệu), nút mạch thơng thường nút mạch có kết họp với hóa chất hay kết hợp với chất đồng vị phóng xạ, đốt điện, tiêm cồn, điều trị phương pháp phân tử (tế bào gốc, gen trị liệu) Liệu pháp quang động (Photodynamic theraphy - PDT) phương pháp điều trị ung thư Đây phương pháp sử dụng tia laze chất cảm quang, tiêu diệt hiệu tế bào ung thư, liệu pháp không xâm lấn Được FDA Mỹ phê chuẩn ứng dụng lâm sàng năm 1996 SFDA Trung Quốc phê chuấn ứng dụng lâm sàng năm 2003 Khi tiêm chất cảm quang qua đường tĩnh mạch, tổ chức ung thư hấp thụ lượng lớn chất Dùng tia lazer chuyên biệt chiếu vào khối u, tác động ánh sáng, chất cảm quang phản ứng tê bào ung thư khiến tế bào bị trúng độc hoại tử Khối u bị tan biến Quá trình điều trị bao gồm tiêm chất cảm quang cho bệnh nhân, sau thời gian chiếu tia lazer vào khối u, tiêu diệt tế bào ung thư Đây phương pháp điều trị tiên tiến với nhiều ưu diêm khơng phẫu thuật, đau đớn, hiệu nhanh tiêu diệt mầm bệnh nhỏ, giảm tỷ lệ tái phát ung thư Đông thời biến chứng , có độc tính thấp, phù hợp với bệnh nhân giai đoạn cuối trạng già yếu Phương pháp đươc ứng dụng điều trị bệnh như: ung thư khoang miệng thời kỳ sớm, ung thư vòm họng (hiệu 75%), ung thư thực quản, bệnh Barrett thực quản, ung thư phê quản: ung thư phế quản giai đoạn sớm, hiệu điều trị đạt 90%, đôi với khôi u phế quản phát triền gây tắc nghẽn, hiệu cải thiện 85%, ung thư dày: Ung thư dày giai đoạn sớm, hiệu điêu trị 85%; có hiệu cải thiện biến chứng ung thư dày, ung thư bàng quang, ung thư trực tràng, ung thư ống mật, đặc biệt thích hợp sử dụng cho ung thư ống mật gan, ung thư tuyến tụy, u bóng vante, ung thư phúc mạng, ung thư gan, u não Chất cảm quang có nhiều loại nhiều hệ, với tên gọi khác Photofrin®, RadarChlorin (Nga) Chủ yếu thành phần chất cảm quang có 95% Chlorin e6, thuộc nhóm Chlorin, thuốc nhạy quang hệ 2, tương tự m-THPC (meso- tetrahydroxyphenyl Chlorin), phép sử dụng lâm sàng châu Ậu Mỹ Chlorin e6 (Ce6) chất cảm quang hệ thứ hai với hấp thụ mạnh mẽ quang phổ màu đỏ ánh sáng, tổng hợp từ Chlorophyll Những lợi ích lâm sàng đáng ý thu với PDT qua trung gian C6 (Ce6-PDT) điều trị loại ung thư khác nhau, bao gồm u ác tính, ung thư bàng quang ung thư biểu mơ vịm họng Hiện nay, số PS cấu trúc porphyrin non-porphyrin nghiên cứu tổng hợp Trong số đó, Chlorin chất có tiềm cho PDT khả hấp thụ phát xạ dải phồ hồng ngoại (khoảng 660 nm) Nhờ ánh sáng thâm nhập sâu vào mô, gây độc quang cao hồ trợ cho trình điêu trị Người bệnh sử dụng liều lượng thuốc thấp nhẹ, loại bỏ nhanh khối u rút ngắn thời gian tiếp xúc với da Có nhiêu loại thuốc cảm quang Chlorin điều trị lâm sàng ngày - Temoporfin (Foscan, mTHPC, 5,10,15,20-Tetra (m-hydroxyphenyl) Chlorin), Talaporfin (LS11, MACE, N- aspartyl Chlorin e6, NPe6), RadaChlorin (hỗn hợp ba = 1:1), tiến hành chạy cột dung dịch rửa giải khơng cịn màu vàng (tổng thể tích hệ dung mơi sử dụng khoảng 06 lit, quay vịng hệ dung mơi cất quay chân khơng để tiết kiệm) Sau chuyển dung môi rửa giải sang dichloromethane, tiếp tục tiến hành chạy cột, bỏ phân đoạn màu vàng đậm khỏi cột, sau đến phân đoạn màu xanh đen chứa sản phẩm Methyl pheophorbide a Lấy phần dung dịch rửa giải (khoảng 250 ml/l làn) vào bình cầu 500 ml (1/2 bình), đánh số thứ tự Kiểm tra sắc ký mỏng so sánh với chất mẫu methyl pheophorbide a Gom phân đoạn có sản phẩm tương đối sạch, cất loại dung môi dichloromethane, thu sản phẩm methyl pheophorbide a dạng rắn Kết tinh lại hệ dung môi (dichloromethane: methanol 1,5: 10) thu khoảng g methyl pheophorbide a (hiệu suất khoảng 0,43% theo khối lượng sinh khối tảo 34 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a sinh khối tảo Spirulina qui mô PTN Nghiên cứu tách chiết định lượng Chlorophyll từ sinh khối tảo Spirulina sở để giúp đánh giá hàm lượng Chlorophyll chất lượng tảo trước đưa vào quy trình tách chiết, điều chế dẫn xuất Chlorophyll Có nhiều phương pháp tách chiết Chlorophyll công bố Một số tác giả (Karsten, Schumann, Haubner, & Klausch, 2005) dùng acetone 90% để ly trích Chlorophyll tảo Các tác giả dùng hạt micro-bead qua trình đồng hóa để tăng khả phá vách tế bào lên gấp lần phương pháp khác Hiệu suất thu hồi Chlorophyll nghiên cứu đạt 39 – 85% Trong nghiên cứu khác (Ronen & Galun, 1984), tác giả dùng dimethyl sulfoxide (DMSO) để tách chiết Chlorophyll từ địa y (Ramalina duriaei) Ronen cộng sử dụng aceton 90% có bổ sung MgCO3 để tách Chlorophyll nhiệt độ lạnh ánh sáng mờ Bên cạnh đó, nhà nghiên cứu Nhật (Irijama, Shiraki, & Yoshiura, 2011) tiến hành nghiên cứu tách chiết Chlorophyll từ rau chân vịt (spinach) aceton, methanol điều kiện lạnh tối Trong khuôn khổ nghiên cứu chúng tôi, số dung môi khác điều kiện tách chiết khác đưa vào thử nghiệm Thông qua kết thực nghiệm, ảnh hưởng điều kiện tách chiết khác đánh giá so sánh từ rút điều kiện phù hợp sử dụng để tách chiết Chlorophyll từ tảo Spirulina 35 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng loại dung môi nồng độ dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina Vì tính chất vật lý Chlorophyll không tan nước, tan cồn, acetone, DMSO nên lựa chọn loại dung môi cho nghiên cứu aceton, methanol ethanol Bảng 3.1 Hàm lượng Chlorophyll thu chiết với dung môi nồng độ dung môi khác (24h chiết) Dung môi Acetone Methanol Ethanol Nồng độ Hàm lượng Hàm lượng Chlorophyll dung môi Chlorophyll a (mg/g) tổng (mg/g) 60% 2,130 4,013 70% 2,191 4,367 80% 2,184 4,176 90% 2,155 4,182 60% 2,062 3,806 70% 2,044 3,912 80% 2,136 4,129 90% 2,142 4,154 60% 2,052 3,899 70% 1,954 3,861 80% 2,036 4,098 90% 2,028 4,075 36 Theo bảng 3.1, hàm lượng Chlorophyll a tăng với việc tăng nồng độ acetone đạt giá trị cao 70% acetone (2.130, 2.191, 2.184 2.155mg/g theo thứ tự) Khi nồng độ acetone tăng lên 90%, hàm lượng Chlorophyll a thu giảm cịn 2,155mg/g Đối với dung mơi methanol, nồng độ Chlorophyll a tăng tỉ lệ thuận với việc tăng nồng độ dung môi đạt giá trị cao nồng độ 90% methanol 2.142 mg/g So với dung môi methanol, dùng dung môi ethanol, nồng độ Chlorophyll a đạt giá trị thấp hơn, hàm lượng Chlorophyll a cao thu tỷ lệ 60% ethanol 2.052 mg/g, thấp hẳn so với hàm lượng Chlorophyll a thu sử đụng dung môi aceton Như vậy, theo kết thu nhận được, hàm lượng Chlorophyll a Chlorophyll tổng số tỉ lệ chúng thay đổi theo loại dung môi nồng độ dung môi sử dụng Acetone dung môi cho tổng lượng Chlorophyll thu nhận cao với hàm lượng Chlorophyll a cao Ethanol dung môi cho hàm lượng Chlorophyll a thấp Theo số nghiên cứu trước (Barrett & Jeffrey, 1964), enzyme Chlorophyllase giữ phần hoạt tính nồng độ dung mơi khác làm cho Chlorophyll bị chuyển sang dạng đồng phân khác Mặt khác, hoạt động Chlorophyll b reductase tạo phản ứng chuyển Chlorophyll b thành Chlorophyll a Có thể hoạt động hai enzme trình tách chiết (giai đoạn phá vỡ tế bào, lưu trữ loại dung môi nồng độ khác nhau) dẫn đến khác biệt hàm lượng Chlorophyll a thu nhận Các nghiên cứu cấu tạo Chlorophyll cho thấy khác Chlorophyll a Chlorophyll b vị trí C7 Chlorophyll a nhóm methyl (-CH3) cịn Chlorophyll b nhóm formyl (-CHO) (Woodward RB, 1960) Như biết, acetone có cơng thức phân tử (CH3)2CO; đó, methanol (CH3OH) ethanol (C2H5OH) hai dung mơi có chứa nhóm methyl, ethyl (-CH2) nhóm hydroxyl (-OH) dễ dàng chuyển sang nhóm 37 formyl Mặt khác, khả hòa tan Chlorophyll khác dựa loại tỉ lệ dung môi khác dẫn đến khác biệt kết thí nghiệm (Bảng 3.1) Từ kết nghiên cứu trên, dung môi acetone với nồng độ 70% lựa chọn làm dung môi tách chiết Chlorophyll a cho nghiên cứu 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất/dung môi đến hiệu tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina Tiếp tục tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina, sử dụng dung môi acetone 80% với tỉ lệ chất/dung môi 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (w/v) Kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Hàm lượng Chlorophyll thay đổi tỷ lệ chất/dung môi Tỷ lệ chất/dung môi (w/v) Hàm lượng 1/5 1/10 1/15 1/20 Chlorophyll a 1.987 2,193 2,137 2,079 Chlorophyll tổng 3,875 4,254 4,219 4,016 Chlorophyll (mg/g) Từ kết bảng 3.2, thay đổi tỉ lệ chất/dung mơi hàm lượng Chlorophyll a hàm lượng Chlorophyll tổng tương ứng thay đổi, thấp nhât tỷ lệ 1/5 (1.987 mg/g 3.375 mg/g) cao với tỷ lệ 1/10 (2.193 mg/gvà 4.254 mg/g) Đối với tỷ lệ chất/dung môi 1/20 1/25, lượng Chlorophyll a hàm lượng Chlorophyll tổng tương ứng thu giảm dần từ tỉ lệ 1/20 (2.137 mg/g 4.219 mg/g ) 1/25 (2.079 mg/g 4.016 mg/g) Nguyên nhân thay đổi với khối lượng nguyên liệu, tăng lượng dung mơi sử dụng hiệu suất trích ly 38 tăng tăng chênh lệch gradient nồng độ cấu tử cần trích ly nguyên liệu dung môi Tuy nhiên, sử dụng lượng dung môi q lớn làm lỗng dịch trích Khi đó, muốn thu nhận sản phẩm trích ly ta phải thực q trình đặc hay sử dụng phương pháp để tách bớt dung mơi Vì thế, với q trình trích ly, cần xác định tỉ lệ phù hợp nguyên liệu dung môi để thu hiệu suất trích ly cao tiết kiệm chi phí Như vậy, thí nghiệm này, chúng tơi chọn tỉ lệ dung môi/cơ chất 1/10 (w/v) để sử dụng cho thí nghiệm 3.3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hiệu tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina Bảng 3.3 Hàm lượng Chlorophyll thời gian chiết khác Thời gian chiết Hàm lượng 12 24 48 72 Chlorophyll a 0,933 2,192 2,089 1,895 Chlorophyll tổng 2,018 4,287 4,159 3,864 Chlorophyll (mg/g) Kết bảng 3.3 cho thấy thời gian trích ly ảnh hưởng đến lượng Chlorophyll thu nhận Thời gian chiết lâu lượng Chlorophyll tăng, song thời gian chiết lâu không mang lại hiệu Trong khoảng thời gian thử nghiệm, lượng Chlorophyll a Chlorophyll tổng thu cao 24 trích ly (2,192 mg/g 4,287 mg/g) Trên lý thuyết, kéo dài thời gian trích ly làm tăng thời gian tiếp xúc nguyên liệu dung mơi, làm tăng q trình khuếch tán phân tử chất trích từ nguyên liệu vào dung dịch làm tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên, q trình trích ly chậm dần chênh lệch nồng độ chất trích nguyên liệu dung dịch đạt trạng thái cân 39 Khi đó, việc kéo dài thời gian trích ly khơng làm tăng lượng chất trích ly Trong thí nghiệm này, sử dụng phương pháp ngâm chiết để trích ly nên thời gian ngắn khơng trích ly hầu hết Chlorophyll có tế bào mẫu, thời gian trích ly dài lượng dung mơi bay phần, đồng thời xảy chuyển hóa Chlorophyll thành pheophytin đồng phân khác, dẫn đến thời gian lâu lượng Chlorophyll thu khơng tăng mà có xu hướng giảm Với mục tiêu thu lượng Chlorophyll cao nhất, thời gian trích ly 24 chọn thời gian trích ly thích hợp 3.2 Kết tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối tảo Spirulina hệ thống chiết Sohxlet Trước tiến hành tách chiết lượng lớn hệ thống chiết Sohxlet, tảo bột Spirulina xử lý cách ngâm aceton ủ với nito lỏng 15 phút Sau tảo bột Spirulina xử lý chiết hệ thống Sohxlet sau 24h acetone, môi trường khí nito, hạn chế ánh sáng Dịch chiết acetone lọc qua loại aceton, loại nước, loại dầu có hỗn hợp cất quay chân khơng áp suất thấp, sản phẩm thu khoảng 15 - 17g/1 lần tách chiết Sohxlet hỗn hợp Chlorophyll đặc dạng dầu sệt 40 Hình Ống lọc chứa Spirulina bột khô hệ thống chiết Sohxlet Hình Ống lọc Sohxlet trước sau chiết (màu xanh khơng cịn) Hình Tảo bột Spirulina trước phần bã sau chiết Sohxlet 41 Hình 10 Các mẫu dịch chiết Spirulina Quá trình tách Chlorophyll tử Spirulina hệ thống Sohxlet cho thấy hiệu tách chiết tương đối triệt để Màu sắc dịch chiết màu xanh đặc trưng Chlorophyll, phần bã sau chiết màu vàng nhạt, thể hiệu chiết Chlorophyll từ tảo Spirulina hệ thống Sohxlet cao 3.3 Kết định tính tinh hợp chất màu Chlorophyll a từ sinh khối tảo Spirulina phương pháp sắc ký mỏng sắc ký cột Để kiểm tra xác khả tách chiết Chlorophyll a, dịch chiết Chlorophyll thu nhận được tiến hành kiểm tra cách tinh chế lượng nhỏ Chlorophyll a (1g) qua cột sắc ký Alox (100 g, mesh 100 – 300), dung mơi n-hexane, sau thu nhận phân đoạn dung dịch rửa giải kiểm tra sắc ký mỏng (SiO2, n-hexane: EtOAc: Acetone:methanol = 7,6:1:1:0,4) Kết thu trình bày hình 11 42 Hình 11 Kết TLC dịch chiết Spirulina [SiO2, (n-hexane: EtOAc: Acetone: MeOH = 7,6:1:1:0,4), Rf = 0,4] phổ UV-VIS acetone Dịch chiết Chlorophyll trước tinh kiểm tra thành phần Chlorophyll a sắc ký mỏng, kết cho thấy mẫu dịch chiết với nồng đô tăng dần theo thứ tự J, 1, thể băng sản phẩm Chlorophyll a đậm màu dần tương ứng với đường chạy Rf Chlorophyll a mẫu đối chứng H Sau tinh qua cột Alox, sắc ký đồ phổ UV-VIS aceton cho thấy dịch chiết Chlorophyll a tinh xuất đỉnh, tương ứng với bước sóng UV-VIS 412, 430 662 nm Gộp phân đoạn màu xanh, làm bay dung mơi cách thổi khí N2 nhiệt độ phòng thu Chlorophyll a (15 – 20 mg) Bình chứa Chlorophyll a hạn chế ánh sáng cách bọc kín giấy nhơm bảo quản tủ lạnh Như vậy, phương pháp tách chiết Chlorophyll a acetone tinh qua cột sắc ký Alox cho sản phẩm Chlorophyll a tinh sử dụng cho nghiên cứu 43 3.4 Kết chuyển hóa hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo Spirulina thành Methyl phephorbide a xác định cấu trúc methyl pheophorbide a Methyl pheophorbide a điều chế từ 30 g Chlorophyll cô đặc, khuấy 500 ml methanol khan bình cầu dung tích 1000 ml, vừa khuấy hỗn hợp vừa nhỏ từ từ 25 ml axit sulfuric đặc qua phễu nhỏ giọt vào hỗn hợp phản ứng cho nhiệt độ bình phản ứng khơng q 40 oC Hỗn hợp khuấy qua đêm nhiệt độ phịng mơi trường khí nito Hỗn hợp phản ứng sau chuyển sang phễu chiết dung tích 2L có chứa dichloromethane (400 mL), nước (800ml) Tiếp tục chiết 02-03 lần dichloromethane (3x200ml) Pha hữu gộp lại lọc qua bơng vào bình cầu Cất quay chân khơng để loại dung môi, thu hỗn hợp sản phẩm methyl pheophorbide a thô màu đen (khoảng 25 g) Sản phẩm methyl pheophorbide a tinh phương pháp sắc ký, thu phân đoạn màu xanh đen chứa sản phẩm Methyl pheophorbide a Lấy phần dung dịch rửa giải (khoảng 250 ml/l lần) vào bình cầu 500 ml (1/2 bình), đánh số thứ tự Kiểm tra sắc ký mỏng so sánh với chất mẫu methyl pheophorbide a Gom phân đoạn có sản phẩm tương đối sạch, cất loại dung môi dichloromethane, thu sản phẩm methyl pheophorbide a dạng rắn Kết tinh lại hệ dung môi (dichloromethane: methanol 1,5: 10) thu khoảng g methyl pheophorbide a (hiệu suất khoảng 0,43% theo khối lượng sinh khối tảo) 44 Hình 3.6 Phổ UV-VIS Methyl pheophobide a MeOH Cấu trúc cùa Methyl pheophorbide a dược xác định phương pháp phổ UV-VIS cho kết sau: TLC (Alox, CH2Cl2/Acetone:10/0.4) Rf = 0.58 IR (KBr): v = 3377 cm-1 (w, N-H), 2958 (w), 1734 (s, C-=O, ester), 1701 (s, C=O, ester), 1619 (m, C=C, aromatic), 1556(w), 1498 (w), 1432 (w), 1365 (w), 1345 (w), 1297 (w), 1213 (s, C-O-C, ester), 1164 (s,br, C-O-C, ester), 1122(w), 1035 (w), 990 (w), 909 (w), 895 (w), 829 (w), 752 (w), 671(w) UV/VIS (THF): λmax (Ɛx10-3) = 321 (21.64), 411 (109.05), 505 (10.39), 535 (9.98), 610 (8.72), 670 (45.55) MS: (EI, 70 eV, direct, T = 200oC): m/z (% rel intensity) = 606 (100) [M+], 548 (28), 459 (16), 236 (10), 44 (39), 28 (100) [C2H4] + MS: (ESI, positive, CH2Cl2/MeOH 1:10): 607.3 [M + H] +, 629.2 [M + Na] +, 645.2 [M + K] + MS: (ESI, negative, CH2Cl2/MeOH 1:10): 605.2 [M – H]Trên phổ UV-V1S (hình 3.6) xuất hai dải hấp thụ cường độ cao đặc trưng cho hợp chất Chlorin soret-band 410 nm (ɛ =106050) Qband 667 nm (ɛ = 48860) So với hợp chất màu khác, methyl pheophorbide a hấp thụ mạnh ánh sáng khả kiến 410 nm 667 nm tồn hệ thơm bao gồm 18 electron dẫn xuất dùng làm chất nhạy sáng sử dụng cho quang trị liệu pin mặt trời 45 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã khảo sát hệ dung môi điều kiện tách chiết Chlorophyll a từ tảo Spirulina Chọn hệ dung môi tách chiết acetone nồng độ 70%, tỷ lệ chất dung môi 1/10, thời gian tách chiết 24 - Đã xây dựng quy trình tách chiết Chlorophyll a từ tảo Spirulina hệ thống tách chiết Sohxlet - Đã thực chuyển hóa thành công Chlorophyll a thành Methyl Pheophorbide a bước đầu xác định cấu trúc phổ UV/VIS + Khối phổ MS Hiệu suất tách chiết, điều chế Methyl pheophorbide a trung bình đạt 0,45% tính theo khối lượng: từ 600 g tảo Spirulina, sau tách chiết, chuyển hóa, tinh chế thu trung bình 2,7 g Methyl pheophorbide a 4.2 Kiến nghị Chlorin e6 dẫn xuất hydrophilic khơng chứa kim loại Chlorophyll chất có khả cảm quang ứng dụng điều trị ung thư Chlorin e6 điều chế từ methyl phenophorbide a cách thủy phân với H2O – aceton NaOH Qua kết đạt kiến nghị tiếp tục nghiên cứu chuyển hóa Methyl pheophorbide a thành Chlorine e6 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Trần Thị Hiền (2013) Tách chiết Chlorophyll a chuyển hóa thành Chlorin- E6 trimetyl este để làm hoạt chất chữa trị ung thư liệu pháp quang, Luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Kim Lệ Chân, Trần Sương Ngọc, Huỳnh Thị Ngọc Hiền Trương Quốc Phú (2018) Ảnh hưởng màu sắc ánh sáng lên phát triển tảo Spirulina platensis Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54, 75-81 Nguyễn Thị Bông (2012) Nghiên cứu tách chiết Chlorophyll Carotenoid từ tảo Chlorella, Khóa luận tốt nghiệp cơng nghệ hóa học, Trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh Gijsens A, De Witte P (1998) Photocytotoxic action of EGF-PVA-Sn(IV) Chlorin e6 and EGF-dextran-Sn(IV)Chlorin e6 internalizable conjugates on A431 cells Int J Oncol 13: 1171-1177 Hamblin MR, Miller JL, Rizvi I, Ortel B, Maytin EV, et al (2001) Pegylation of a Chlorin(e6) polymer conjugate increases tumor targeting of photosensitizer Cancer Res 61: 7155-7162 Hendry, G.A.F., 1996 Chlorophylls and Chlorophyll derivates In: Hendry, G.A.F., Houghton, J.D.(Eds.), Natural Food Colorants Blackil Academic Professional, London, pp 131–155 Jensen, S., Knutsen, G., 1993 Influence of light and temperature on photoinibition of photosynthesis in Spirulina platensis J Appl Phycol 5, 495–504 Noorjahan C.M., Sharief D.S., Dawood N 2005 Biodegradation of dairy effluent, Pollution Research, Vol 24, pp 101-104 47 O'Connor AE, Gallagher WM, Byrne AT (2009) Porphyrin and nonporphyrin photosensitizers in oncology: preclinical and clinical advances in photodynamic therapy Photochem Photobiol 85: 1053-1074 10 Olguin J, Sonia Galicia, Ofelia Angulo Guerrero and Elizabeth Hernandez (2001) The effect of low light and nitrogen deficiency on the chemical composition of Spirulina sp (Arothrospira) grown on digested pig waste, Bioresource Technology, 77: 19-24 11 Zarrouk, C., 1966 Contribution l’étude d’une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima (Setch el Gardner) Geitler PhD Thesis University of Paris 12 Youngman, R.E., 1978 Measurement of Chlorophyll-a Water research center, Tech Rap Tr 82 13 Vonshak A, Richmond A Mass production of blue–green alga Spirulinaan overview Biomass 1982; 15: 233–47 14 Mohanty, P., Srivastava, M and Krishina, K.B., 1997 The photosynthetic apparatus of Spirulina: electron transport and energy transfer, in Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology, Vonshak, A (ed) (Taylor and Francis, London), pp 17–42 (Taylor and Francis, London) 15 Vonshak, A., 1997, Spirulina: growth, physiology and biochemistry, in Spirulina platensis (Arthrospira), Vonshak, A (ed) (Taylor & Francis, London), pp 43–65 (Taylor & Francis, London) 48 ... Spirulina - Chuyển h? ?a hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo xoắn Spirullina thành metyl pheophorbide a - Xác định cấu trúc methyl pheophorbide a Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tách chiết thu... màu Chlorophyll a sinh khối tảo Spirulina - Chuyển h? ?a hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo Spirulina thành Methyl phephorbide a - Xác định cấu trúc methyl pheophorbide a CHƯƠNG I TỔNG QUAN... tách chiết Chlorophyll a acetone tinh qua cột sắc ký Alox cho sản phẩm Chlorophyll a tinh sử dụng cho nghiên cứu 43 3.4 Kết chuyển h? ?a hỗn hợp Chlorophyll a tách chiết từ tảo Spirulina thành Methyl