Spirulina thành Methyl phephorbide a và xác định cấu trúc methyl pheophorbide a
Methyl pheophorbide a được điều chế từ 30 g Chlorophyll cô đặc, khuấy đều trong 500 ml methanol khan ở bình cầu dung tích 1000 ml, vừa khuấy hỗn hợp vừa nhỏ từ từ 25 ml axit sulfuric đặc qua 1 phễu nhỏ giọt vào hỗn hợp phản ứng sao cho nhiệt độ bình phản ứng không quá 40oC. Hỗn hợp được khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí nito. Hỗn hợp phản ứng sau đó được chuyển sang phễu chiết dung tích 2L có chứa dichloromethane (400 mL), nước (800ml). Tiếp tục chiết 02-03 lần bằng dichloromethane (3x200ml). Pha hữu cơ được gộp lại và lọc qua bông vào một bình cầu. Cất quay chân không để loại dung môi, thu hỗn hợp sản phẩm methyl pheophorbide a thô màu đen (khoảng 25 g).
Sản phẩm methyl pheophorbide a được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký, thu phân đoạn màu xanh đen chứa sản phẩm Methyl pheophorbide a. Lấy phần dung dịch rửa giải này (khoảng 250 ml/l lần) vào các bình cầu 500 ml (1/2 bình), đánh số thứ tự. Kiểm tra sắc ký bản mỏng so sánh với chất mẫu
methyl pheophorbide a. Gom các phân đoạn có sản phẩm tương đối sạch, cất loại dung môi dichloromethane, thu sản phẩm methyl pheophorbide a ở dạng rắn. Kết tinh lại trong hệ dung môi (dichloromethane: methanol 1,5: 10) thu được khoảng 3 g methyl pheophorbide a sạch (hiệu suất khoảng 0,43% theo khối lượng sinh khối tảo).
Hình 3.6. Phổ UV-VIS của Methyl pheophobide a trong MeOH
Cấu trúc cùa Methyl pheophorbide a dược xác định bằng phương pháp phổ UV-VIS cho kết quả như sau: TLC (Alox, CH2Cl2/Acetone:10/0.4) Rf = 0.58. IR (KBr): v = 3377 cm-1 (w, N-H), 2958 (w), 1734 (s, C-=O, ester), 1701 (s, C=O, ester), 1619 (m, C=C, aromatic), 1556(w), 1498 (w), 1432 (w), 1365 (w), 1345 (w), 1297 (w), 1213 (s, C-O-C, ester), 1164 (s,br, C-O-C, ester), 1122(w), 1035 (w), 990 (w), 909 (w), 895 (w), 829 (w), 752 (w), 671(w). UV/VIS (THF): λmax (Ɛx10-3) = 321 (21.64), 411 (109.05), 505 (10.39), 535 (9.98), 610 (8.72), 670 (45.55). MS: (EI, 70 eV, direct, T = 200oC): m/z (% rel. intensity) = 606 (100) [M+], 548 (28), 459 (16), 236 (10), 44 (39), 28 (100) [C2H4] +. MS: (ESI, positive, CH2Cl2/MeOH 1:10): 607.3 [M + H] +, 629.2 [M + Na] +, 645.2 [M + K] +. MS: (ESI, negative, CH2Cl2/MeOH 1:10): 605.2 [M – H]-
Trên phổ UV-V1S (hình 3.6) xuất hiện hai dải hấp thụ cường độ cao rất đặc trưng cho các hợp chất Chlorin là soret-band ở 410 nm (ɛ =106050) và Q- band ở 667 nm (ɛ = 48860). So với các hợp chất màu khác, methyl pheophorbide a hấp thụ rất mạnh ánh sáng khả kiến ở 410 nm và 667 nm do tồn tại hệ thơm bao gồm 18 electron vì vậy nó và các dẫn xuất được dùng làm chất nhạy sáng sử dụng cho quang trị liệu và pin mặt trời.
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Đã khảo sát được hệ dung môi và điều kiện tách chiết Chlorophyll a từ tảo
Spirulina. Chọn được hệ dung môi tách chiết là acetone nồng độ 70%, tỷ lệ cơ chất dung môi 1/10, thời gian tách chiết 24 giờ.
- Đã xây dựng được quy trình tách chiết Chlorophyll a từ tảo Spirulina trên hệ thống tách chiết Sohxlet
- Đã thực hiện chuyển hóa thành công Chlorophyll a thành Methyl Pheophorbide a và bước đầu xác định cấu trúc bằng phổ UV/VIS + Khối phổ MS. Hiệu suất tách chiết, điều chế Methyl pheophorbide a trung bình đạt 0,45% tính theo khối lượng: từ 600 g tảo Spirulina, sau khi tách chiết, chuyển hóa, tinh chế thu được trung bình 2,7 g Methyl pheophorbide a.
4.2. Kiến nghị
Chlorin e6 là dẫn xuất hydrophilic không chứa kim loại của
Chlorophyll và là chất có khả năng cảm quang ứng dụng trong điều trị ung thư. Chlorin e6 được điều chế từ methyl phenophorbide a bằng cách thủy phân với H2O – aceton và NaOH. Qua những kết quả đã đạt được ở trên kiến nghị tiếp tục nghiên cứu chuyển hóa Methyl pheophorbide a thành Chlorine
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Trần Thị Hiền (2013). Tách chiết Chlorophyll a và chuyển hóa thành Chlorin- E6 trimetyl este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang, Luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Kim Lệ Chân, Trần Sương Ngọc, Huỳnh Thị Ngọc Hiền và Trương Quốc Phú (2018). Ảnh hưởng của màu sắc ánh sáng lên sự phát triển của tảo Spirulina platensis. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54, 75-81. 3. Nguyễn Thị Bông (2012). Nghiên cứu tách chiết Chlorophyll và Carotenoid từ tảo Chlorella, Khóa luận tốt nghiệp công nghệ hóa học, Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh.
4. Gijsens A, De Witte P (1998) Photocytotoxic action of EGF-PVA-Sn(IV)
Chlorin e6 and EGF-dextran-Sn(IV)Chlorin e6 internalizable conjugates on A431 cells. Int J Oncol 13: 1171-1177.
5. Hamblin MR, Miller JL, Rizvi I, Ortel B, Maytin EV, et al. (2001) Pegylation of a Chlorin(e6) polymer conjugate increases tumor targeting of photosensitizer. Cancer Res 61: 7155-7162.
6. Hendry, G.A.F., 1996. Chlorophylls and Chlorophyll derivates. In: Hendry, G.A.F., Houghton, J.D.(Eds.), Natural Food Colorants. Blackil Academic Professional, London, pp. 131–155.
7. Jensen, S., Knutsen, G., 1993. Influence of light and temperature on photoinibition of photosynthesis in Spirulina platensis. J. Appl. Phycol. 5, 495–504.
8. Noorjahan C.M., Sharief D.S., Dawood N. 2005. Biodegradation of dairy effluent, Pollution Research, Vol. 24, pp. 101-104.
9. O'Connor AE, Gallagher WM, Byrne AT (2009) Porphyrin and nonporphyrin photosensitizers in oncology: preclinical and clinical advances in photodynamic therapy. Photochem Photobiol 85: 1053-1074.
10. Olguin. J, Sonia Galicia, Ofelia Angulo Guerrero and Elizabeth Hernandez (2001). The effect of low light and nitrogen deficiency on the chemical composition of Spirulina sp. (Arothrospira) grown on digested pig waste, Bioresource Technology, 77: 19-24.
11. Zarrouk, C., 1966. Contribution à l’étude d’une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima (Setch el Gardner) Geitler. PhD Thesis. University of Paris.
12. Youngman, R.E., 1978. Measurement of Chlorophyll-a. Water research center, Tech. Rap. Tr. 82.
13. Vonshak A, Richmond A. Mass production of blue–green alga Spirulina- an overview. Biomass 1982; 15: 233–47.
14. Mohanty, P., Srivastava, M. and Krishina, K.B., 1997. The photosynthetic apparatus of Spirulina: electron transport and energy transfer, in Spirulina
platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology, Vonshak, A. (ed) (Taylor and Francis, London), pp. 17–42. (Taylor and Francis, London).
15. Vonshak, A., 1997, Spirulina: growth, physiology and biochemistry, in
Spirulina platensis (Arthrospira), Vonshak, A. (ed) (Taylor & Francis, London), pp. 43–65. (Taylor & Francis, London).