1.3.1. Ngoài nước
Chlorophyll là chất có màu xanh lá cây trong thực vật bao gồm cây xanh và tảo, được tạo thành trong quá trình quang hợp, nó cho phép cây xanh hấp thụ ánh sáng mặt trời và chuyển phần ánh sáng đó sang dạng năng lượng sử dụng được. Giáo sư Richard W. Statter đã có công trình nghiên cứu và phát hiện ra rằng: Cấu tạo tế bào hồng cầu gần như đồng nhất với cấu tạo tế bào diệp lục, giúp tăng lượng hồng cầu trong cơ thể, công trình này đã đoạt được giải thưởng Nobel vào năm 1915. Chlorophyll chỉ khác với hemoglobin trong máu người ở nhân Mg2+ trong vòng Chlorin (thay vì Fe2+).
nghiên cứu cũng về diệp lục với tên gọi: Chlorophyll giúp cơ thể loại thải các chất độc tố một cách hiệu quả nhất. Một số nghiên cứu cho thấy Chlorophyll
có tác dụng tẩy độc ở gan, chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa huyết áp… Chlorophyll là một sắc tố tự nhiên và cũng là một chất màu thực phẩm (E 140). Chlorophyll có 2 loại: diệp lục a (Chlorophyll a) và diệp lục b (Chlorophyll b) được tìm thấy ở thực vật. Chất diệp lục a và diệp lục b là các chất tự nhiên tan trong chất béo, được tìm thấy trong thực vật. Chất diệp lục a và b chỉ khác nhau nhóm định chức, cho phép từng loại chất diệp lục hấp thụ ánh sáng ở những bước sóng khác nhau.
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó hấp thụ ánh sáng có bước sóng khoảng 650 nm nên ánh sáng dễ dàng xuyên qua các tể bào mô. Khi được chiếu xạ, các dẫn xuất chất này chuyển lên trạng thái kích thích triplet (năng lượng kích thích với Chlorophyll a. E = 29 kcal/mol) sau đó năng lượng này được chuyển sang cho oxy để sản xuất oxy ở trạng thái kích thích singlet (E = 22.5 kcal/ mol). Oxy ở trạng thái singlet là một chất oxy hoá hiệu quả dẫn đến sự hình thành các thành tố rất hoạt động như anion gốc, gốc hydroxyl và
hydroperoxide. Các gốc hoạt động này sẽ đi vào phán ứng trực tiếp với các phân tử hữu cơ của các tế bào ung thư. Các gốc tự do phản ứng dây chuyền để phân huỷ màng lipit cùa các tế bào dẫn đên phá hủy các tế bào ung thư. Một sổ Chlorin rất quan trọng được sử dụng cho quang trị liệu bao gồm
Chlorin-e6 và các muối natri, monoaspartylChlorin-e6 và photoChlorin. Liệu pháp quang đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính của da. tuyến vú, màng nhày của các khoang miệng, lưỡi, môi dưới, thanh quàn, dạ dày, phổi, ruột non, bàng quang và trực tràng.
Quang trị liệu các bệnh ung thư là một ứng dụng quan trọng của các dẫn xuất Chlorophyll dựa trên sự khu trú có chọn lọc trên khối u và sản sinh ra oxy ở trạng thái singlet để phá hủv các tế bào ung thư. Phác đồ xạ trị PDT thông thường của khối u sau khi tiêm chất cảm quang (Photosensitizer - PS)
nhằm tích tụ PS một cách ưu tiên trong mô ung thư. Dưới ánh sáng tiếp xúc và trong sự hiện diện của oxy, PS tạo ra phản ứng oxy hóa phá huỷ khối u. Để ứng dụng lâm sàng thành công, PS phải đáp ứng một số yêu cầu chung như có khả năng hòa tan trong nước để tiêm tĩnh mạch, hấp thụ mạnh ở vùng hồng ngoại hoặc gần hồng ngoại để thâm nhập sâu hơn vào mô, có năng suất lượng tử oxy singlet cao (SOG) và độc tính tế bào thấp, được tích luỹ chọn lọc trong khối u và tác dụng yếu ở da, có thể được loại bỏ nhanh chóng khỏi cơ thể.
1.3.2. Trong nước
Ở nước ta, tảo Spirulina được di thực nhập giống lưu giữ tại Viện Pateur Paris Cộng Hoà Pháp, về nghiên cứu từ năm 1972 ở Viện Sinh Vật (Viện Khoa Học Việt Nam). Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi trồng do Viện này chủ trì, cùng với sự tham gia nghiên cứu về hoá học và giá trị dinh dưỡng trị bệnh của Viện y học quân sự, về tác dụng lâm sàng của Viện quân y 108 Hà Nội. Đề tài này ở mức độ phòng thí nghiệm, đã cho một kết quả tiên lượng tốt về khả năng nuôi trồng này ở nước ta theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí carbonic (CO2), đồng thời khẳng định giá trị dinh dưỡng và chữa bệnh của Spirulina, mở hướng tiên phong cho các nghiên cứu về Spirulina. Tới năm 1977, Viện sinh vật – nơi tiên phong của kỹ nghệ tảo
Spirulina ở Việt Nam, lại triển khai kết quả trên ở mức độ lớn hơn, khi đề tài này được sự đầu tư của nhà nước và các bộ có liên quan, và đặc biệt nơi đón nhận đó là xí nghiệp nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận). Tại đây đã sử dụng nguồn nước suối khoáng giàu bicarbonat, natricarbonat thiên nhiên, một lợi thế của địa phương. Ngoài ra, còn sử dụng năng lượng sức gió để vận hành hệ thống máy khuấy trộn môi trường nuôi tảo. Tham gia nghiên cứu có trường Đại học Bách Khoa Hà Nội (chế tạo các thiết bị nuôi tảo), Viện y học quân sự, xí ngiệp dược phẩm TW 24 – Mekophar (bào chế các dược phẩm), bệnh viện Thống Nhất TP.HCM, bệnh viện phụ sản Từ Dũ TP.HCM (nghiên cứu lâm sàng các dạng thuốc...). Ngoài ra một số nghiên cứu khác về ứng dụng
của Spirulina trong chăn nuôi gia cầm và thuỷ sản, tằm tơ cũng được triển khai tại trường Đại học tổng hợp Hà Nội, Ủy ban khoa học kỹ thuật nhà nước và Sở nông nghiệp Hà Nội, Hà Bắc, Thái Bình, Lâm Đồng, TP.HCM...Nhóm tác giả trên do cố giáo sư Nguyễn Hữu Thước (Ủy ban khoa học kỹ thuật nhà nước) và các cộng sự Trần Văn Tựa, Phan Phương Lan, Đặng Đình Kim (Viện sinh vật) còn nghiên cứu sử dụng nguồn dinh dưỡng khác để nuôi tảo như nước thải ươm tơ tằm tại Đan Hoài (Hà Tây), Bảo Lộc (Lâm Đồng), nước suối khoáng Đắcmin (Buôn Ma Thuột). Như vậy với đề tài cấp nhà nước (Mã số 48.01.02.03) tổng kết tháng 4 năm 1986, đã đánh dấu bước tiến bộ đưa kết quả nghiên cứu từ phòng thí nghiệm ra ứng dụng ở quy mô công nghiệp, hứa hẹn nhiều triển vọng của giống tảo quý này ở nước ta.
Năm 2013, PGS. TS Trần Thạch Văn và cộng sự đã bước đầu nghiên cứu định hướng chiết xuất Chlorophyll a từ vi khuẩn Cyanobacteria và chuyển hóa thành Chlorin e6 nhằm ứng dụng làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang, tuy nhiên đề tài mới chỉ dừng ở bước chuyển hóa và thu hồi thành công chế phẩm Chlorin e6 trimethylester. Trên cơ sở đó, mục đích thu hồi chế phẩm Chlorin e6 trimethylester và Chlorin e6
monomethylester từ một nguồn nguyên liệu dồi dào, giá thành phù hợp và an toàn là tảo Spirulina, sau đó kiểm tra đánh giá khả năng chống tế bào ung thư trong thực tế là hướng nghiên cứu có ý nghĩa lớn về mặt khoa học cũng như cuộc sống.
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
- Đối tượng nghiên cứu: Chlorophyll a chiết tách từ tảo Spirulina từ Quỳnh Lưu, Nghệ An 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị Bảng 1. Các thiết bị Tên thiết bị Tủ lạnh Nồi hấp vô trùng Cân điện tử Máy lắc Gyromax 737R Bộ điện di AND Máy vortex Máy li tâm Máy khuấy từ Bộ giá đỡ hệ thống phản ứng
Bô chiết Sohxlet lớn (gồm cả bình câu, sohxlet, sinh hàn) Bình cầu 1 cổ 1L nhám 29
Bình khí Nitơ Bể điều nhiệt
Giá thí nghiệm cho hệ chiết tách Bình đựng Nitơ lỏng Giá thí nghiệm có đế Bộ noa-kẹp Cân kỹ thuật Tủ sấy dụng cụ Bể điều nhiệt Cột sắc ký 2.1.2.2. Hóa chất Bảng 2. Hóa chất Tên hóa chất Nitơ lỏng Acetone Dichloromethane Giấy lọc Bông y tế Methanol
n-hexan Tetrahydrofuran (THF) Chloroform H2SO4 đặc HCl 35 – 38% KOH NaOH Na2CO3 NaCl CaO
Silicagel cho sắc ký (60Ao, 230-300 mesh) CH3OK
Giấy lọc
Hộp sắc ký bản mỏng TLC Silicagel 60 F254
Nito lỏng Giấy pH
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi và nồng độ dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
10g tảo bột Spirulina được đổ ra 1 cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng và bổ sung dung môi (acetone, methanol, ethanol) với nồng độ (60, 70%, 80%, 90%), tỉ lệ cơ chất/dung môi là 1/10 (w/v) và thể tích cuối cùng đạt 100 ml. Cốc thủy tinh được bọc kín, được giữ trong điều kiện tối và thời gian 24 giờ. Sau đó, mẫu được ly tâm 6000 rpm trong 10 phút. Dịch nổi được thu hồi để xác định hàm lượng Chlorophyll a, từ đó chọn được loại dung môi và nồng độ dung môi thích hợp sử dụng cho các bước thí nghiệm sau.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất/dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
Cân 10g tảo bột Spirulina vào cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng, bổ sung dung môi (dung môi và nồng độ chọn được từ thí nghiệm 2.2.2), tỉ lệ cơ chất/dung môi là 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (w/v). Sau đó mẫu được ủ trích ly ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng trong 24 giờ, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 6000 vòng trong 10 phút và thu phần dịch nổi để xác định lượng Chlorophyll
bằng phương pháp quang phổ, từ đó chọn được tỉ lệ cơ chất/dung môi thích hợp.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả tách chiết
Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
Cân 10g tảo bột Spirulina vào cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng, bổ sung dung môi (dung môi và nồng độ chọn được từ thí nghiệm 2.2.2), tỉ lệ cơ chất/dung môi (chọn được từ thí nghiệm 2.2.3). Sau đó mẫu được ủ trích ly trong các khoảng thời gian khảo sát (12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tối. Sau đó, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi để xác định lượng Chlorophyll, từ đó chọn được thời gian trích ly thích hợp.
2.2.4. Phương pháp xác định nồng độ Chlorophyll
Đối với dung môi acetone, mẫu được đo độ hấp thu ở các bước sóng 664 và 646 nm (Robert J. Porra, 2006). Mẫu trắng (blank) là mẫu chỉ chứa dung môi nồng độ tương ứng. Nồng độ Chlorophyll a (Chl-a) và nồng độ
Chlorophyll b (Chl-b) được tính theo công thức: [Chl-a] = 0,0127 x A664 – 0,00269 x A646
[Chl-b] = 0,0229 x A646 – 0,00468 x A664
Đối với dung môi methanol và ethanol, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 665 và 652 nm (Zapata, Garrido, & Jeffrey, 2006). Mẫu trắng (blank) là mẫu chỉ chứa dung môi nồng độ tương ứng. Nồng độ Chlorophyll a (Chl-a) và nồng độ Chlorophyll b (Chl-b) được tính theo công thức:
[Chl-a] = 16,29 x A665 – 8,54 x A652
[Chl-b] = 30,66 x A652 – 13,58 x A665
[Chl-ab] = 22,12 x A652 + 2,71 x A665
2.2.5. Phương pháp xử lý tảo Spirulina trước khi chiết Chlorophyll bằng bộ chiết Sohxlet bộ chiết Sohxlet
Lấy 300 tảo bột Spirulina vào trong mỗi ống lọc giấy cùa bộ chiết Sohxlet (ϕ8 cm X cao 32,5 cm). Đặt ống trong cốc 250 ml, thêm acetone vào đáy cốc và phần trên của bộ lọc Sohxlet cho đến khi acetone thấm toàn bộ bột
Spirulina bên trong ống (hết khoảng 500 ml acetone). Ngâm ống lọc chứa
Spirulina vào trong ống chứa Nito lỏng, đồng thời tiếp tục thêm nito lỏng sao cho lượng nito lỏng ngập toàn bộ ống lọc (lượng Nito lỏng khoáng 2,5L.). Sau 15 phút, ống lọc đã sẵn sàng cho giai đoạn tiếp theo.
2.2.6. Phương pháp chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina bằng hệ thống chiết Sohxlet chiết Sohxlet
Đặt ống lọc trên vào trong hệ thống chiết Sohxlet, để yên cho ống lọc trở về nhiệt độ 10-20oC. Thêm acetone (2L) vào bình cầu ở dưới. Hệ thống được khởi động và tảo bột Spirulina được chiết 24h bằng acetone trong môi trường khí nito, hạn chế ánh sáng (khoảng 20-25 phút/1 vòng tách chiết, tổng số khoảng 75 vòng tách chiết). Sau khi để nguội, dịch chiết acetone được lọc qua bông dần dần vào bình cầu dung tích 1L. Cất quay chân không để thu hồi dung môi acetone. Sau khi không còn acetone ngưng tụ, thêm 2 lần Dichloromethane (2x100 ml) vào bình chứa dịch chiết cô đặc và tiếp tục cất quay chân không để loại bỏ nước còn lẫn trong hỗn hợp. Hỗn hợp được tiếp tục cất quay ở áp suất thấp để loại bỏ phần dầu có trong hỗn hợp, sản phẩm được gọi là hỗn hợp Chlorophyll cô đặc ở dạng dầu sệt (khoảng 30-35g/1 lần tách chiết Sohxlet). Hỗn hợp này được tiếp tục chuyển hóa thành Methyl pheophorbide a ở bước sau.
2.2.7. Phương pháp tinh chế lượng nhỏ Chlorophyll a
Lấy 1 g hỗn hợp sản phẩm thô, hòa tan trong 3ml CH2Cl2. Chuẩn bị cột sắc ký Alox (100 g, mesh 100 – 300), dung môi n-hexane. Bọc kín cột bằng màng nhôm tránh ánh sáng. Chuyển hỗn hợp 1g sản phẩm thô trong CH2Cl2 lên đầu cột, dùng dung môi n-hexane để chạy cột đến khi thu được dung dịch trong suốt. Thay đổi tỷ lệ n-hexane: acetone để tăng tính phân cực và chạy đến khi phần màu xanh trên cột dịch chuyển dần ra khỏi cột. Lấy các phân đoạn của dung dịch rửa giải và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (SiO2, n- hexane: EtOAc: Acetone: methanol = 7,6:1:1:0,4). Gộp các phân đoạn màu xanh có kết quả sắc ký bản mỏng tốt, làm bay hơi dung môi bằng cách thổi khí N2 ở nhiệt độ phòng thu được Chlorophyll a sạch (15 – 20 mg). Hạn chế ánh sáng bằng cách bọc kín bình chứa Chlorophyll a bằng giấy nhôm và bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.8. Phương pháp điều chế Methyl Pheophorbide a từ Chlorophyll a
Thêm methanol khan (500 mL) vào bình cầu dung tích 1L chứa hỗn hợp Chlorophyll cô đặc (30-35g) ở trên và con từ. Vừa khuấy hỗn hợp vừa nhỏ từ từ axit sulfuric đặc (25 mL) qua 1 phễu nhỏ giọt vào hỗn hợp phản ứng sao cho nhiệt độ bình phản ứng không quá 40oC. Hỗn hợp được khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí nito.
Hỗn hợp phản ứng sau đó được chuyển sang phễu chiết dung tích 2L có chứa dichloromethane (400 mL), nước (800ml). Tiếp tục chiết 02-03 lần bằng dichloromethane (3x200ml). Pha hữu cơ được gộp lại và lọc qua bông vào một bình cầu. Cất quay chân không để loại dung môi, thu hỗn hợp sản phẩm methyl pheophorbide a thô màu đen (khoảng 25-30g).
2.2.9. Phương pháp tinh sạch methyl pheophorbide a
Quy trình tách cột
Quy trình này được thực hiện cho sản phẩm tách chiết và chuyển hóa từ 1 lần chiết Sohxlet (700g/l mẻ/l Sohxlet):
Chuẩn bị cột sắc ký: cho vào cột sắc ký thủy tinh (ϕ65 mm, khóa Teflon), một miếng bông nhỏ phía trên phần khóa, thêm một ít cát sạch (50- 70 mesh) phía trẻn phần bông, sau đó thêm từ từ 400g Silica gel (60Ǻ, 230- 400 mesh) vào trong cột, gõ nhẹ cột dể bột Silica gel ồn định. Từ từ thêm vào từ phía trên cột dung môi n-hexane, đồng thời mở khóa cột để dung môi chảy qua hết phần Silica gel trong cột và đi ra phía đầu cột. Gõ cột và để cột ổn định trong khoảng 15 phút.
Hòa tan hỗn hợp methyl pheophorbide a thô (25-30g) trong dichloromethane, sau dó dùng pipet pasteur hút và từ từ chuyển lên dầu cột, chú ý không làm bề mặt silica gel bị tác động, phân tán. Mở khóa cột để phần dung dịch chứa hỗn hợp methyl pheophorbide a chạy vào đầu cột.
= 1:1), tiến hành chạy cột cho đến khi dung dịch rửa giải không còn màu vàng đó (tổng thể tích hệ dung môi sử dụng khoảng 06 lit, có thể quay vòng hệ dung môi bằng cất quay chân không để tiết kiệm).
Sau đó chuyển dung môi rửa giải sang dichloromethane, tiếp tục tiến hành chạy cột, bỏ phân đoạn màu vàng đậm đi ra khỏi cột, sau đó đến phân đoạn màu xanh đen chứa sản phẩm Methyl pheophorbide a. Lấy phần dung dịch rửa giải này (khoảng 250 ml/l làn) vào các bình cầu 500 ml (1/2 bình), đánh số thứ tự. Kiểm tra sắc ký bản mỏng so sánh với chất mẫu methyl pheophorbide a. Gom các phân đoạn có sản phẩm tương đối sạch, cất loại dung môi dichloromethane, thu sản phẩm methyl pheophorbide a ở dạng rắn. Kết tinh lại trong hệ dung môi (dichloromethane: methanol 1,5: 10) thu được khoảng 3 g methyl pheophorbide a sạch (hiệu suất khoảng 0,43% theo khối lượng sinh khối tảo.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tách chiết thu nhận hợp chất màu Chlorophyll a sinh khối tảo Spirulina ở qui mô PTN khối tảo Spirulina ở qui mô PTN
Nghiên cứu tách chiết và định lượng Chlorophyll từ sinh khối tảo
Spirulina là cơ sở để giúp đánh giá hàm lượng Chlorophyll cũng như chất lượng tảo trước khi đưa vào quy trình tách chiết, điều chế các dẫn xuất
Chlorophyll. Có rất nhiều phương pháp tách chiết Chlorophyll đã được công bố. Một số tác giả (Karsten, Schumann, Haubner, & Klausch, 2005) đã dùng