Nghiên cứu tách chiết và định lượng Chlorophyll từ sinh khối tảo Spirulina là cơ sở để giúp đánh giá hàm lượng Chlorophyll cũng như chất lượng tảo trước khi đưa vào quy trình tách chiết, điều chế các dẫn xuất Chlorophyll. Có rất nhiều phương pháp tách chiết Chlorophyll đã được công bố. Một số tác giả (Karsten, Schumann, Haubner, & Klausch, 2005) đã dùng acetone 90% để ly trích Chlorophyll trên tảo. Các tác giả này đã dùng hạt micro-bead trong qua trình đồng hóa để tăng khả năng phá vách tế bào lên gấp 3 lần các phương pháp khác. Hiệu suất thu hồi Chlorophyll trong nghiên cứu này đạt 39 – 85%. Trong một nghiên cứu khác (Ronen & Galun, 1984), các tác giả đã dùng dimethyl sulfoxide (DMSO) để tách chiết Chlorophyll từ địa y (Ramalina duriaei). Ronen và các cộng sự cũng sử dụng aceton 90% có bổ sung MgCO3 để tách Chlorophyll ở nhiệt độ lạnh và ánh sáng mờ. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu Nhật bản (Irijama, Shiraki, & Yoshiura, 2011) cũng tiến hành nghiên cứu tách chiết Chlorophyll từ rau chân vịt (spinach) bằng aceton, methanol trong điều kiện lạnh và tối.
Trong khuôn khổ nghiên cứu của chúng tôi, một số dung môi khác nhau và các điều kiện tách chiết khác nhau được đưa vào thử nghiệm. Thông qua kết quả thực nghiệm, ảnh hưởng của điều kiện tách chiết khác nhau sẽ được đánh giá và so sánh từ đó rút ra điều kiện phù hợp nhất được sử dụng để tách chiết Chlorophyll từ tảo Spirulina.
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi và nồng độ dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina
Vì tính chất vật lý của Chlorophyll là không tan trong nước, tan trong cồn, acetone, DMSO nên chúng tôi lựa chọn 3 loại dung môi cho nghiên cứu này là aceton, methanol và ethanol.
Bảng 3.1. Hàm lượng Chlorophyll thu được khi chiết với các dung môi và nồng độ dung môi khác nhau (24h chiết)
Dung môi Nồng độ dung môi
Hàm lượng Chlorophyll a (mg/g)
Hàm lượng Chlorophyll tổng (mg/g)
Acetone 60% 2,130 4,013
70% 2,191 4,367
80% 2,184 4,176
90% 2,155 4,182
Methanol 60% 2,062 3,806
70% 2,044 3,912
80% 2,136 4,129
90% 2,142 4,154
Ethanol 60% 2,052 3,899
70% 1,954 3,861
80% 2,036 4,098
90% 2,028 4,075
Theo bảng 3.1, hàm lượng Chlorophyll a tăng cùng với việc tăng nồng độ acetone và đạt giá trị cao nhất ở 70% acetone (2.130, 2.191, 2.184 và 2.155mg/g theo thứ tự). Khi nồng độ acetone tăng lên 90%, hàm lượng Chlorophyll a thu được giảm còn 2,155mg/g. Đối với dung môi methanol, nồng độ Chlorophyll a tăng tỉ lệ thuận với việc tăng nồng độ của dung môi và đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 90% methanol là 2.142 mg/g. So với dung môi methanol, khi dùng dung môi ethanol, nồng độ Chlorophyll a luôn đạt giá trị thấp hơn, hàm lượng Chlorophyll a cao nhất thu được ở tỷ lệ 60%
ethanol là 2.052 mg/g, thấp hơn hẳn so với hàm lượng Chlorophyll a thu được khi sử đụng dung môi aceton.
Như vậy, căn cứ theo kết quả thu nhận được, hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll tổng số cũng như tỉ lệ của chúng thay đổi theo loại dung môi và nồng độ dung môi sử dụng. Acetone là dung môi cho tổng lượng Chlorophyll thu nhận được cao nhất với hàm lượng Chlorophyll a khá cao.
Ethanol là dung môi cho hàm lượng Chlorophyll a thấp nhất. Theo một số nghiên cứu trước đây (Barrett & Jeffrey, 1964), enzyme Chlorophyllase vẫn còn giữ một phần hoạt tính ở các nồng độ dung môi khác nhau làm cho Chlorophyll bị chuyển sang các dạng đồng phân khác. Mặt khác, sự hoạt động của Chlorophyll b reductase cũng tạo phản ứng chuyển Chlorophyll b thành Chlorophyll a. Có thể chính hoạt động của hai enzme này trong quá trình tách chiết (giai đoạn phá vỡ tế bào, lưu trữ trong các loại dung môi ở các nồng độ khác nhau) đã dẫn đến sự khác biệt về hàm lượng Chlorophyll a thu nhận được. Các nghiên cứu về cấu tạo của Chlorophyll cho thấy sự khác nhau giữa Chlorophyll a và Chlorophyll b là tại vị trí C7 ở Chlorophyll a là nhóm methyl (-CH3) còn ở Chlorophyll b là nhóm formyl (-CHO) (Woodward RB, 1960). Như đã biết, acetone có công thức phân tử là (CH3)2CO; trong khi đó, methanol (CH3OH) và ethanol (C2H5OH) là hai dung môi có chứa nhóm methyl, ethyl (-CH2) và nhóm hydroxyl (-OH) rất dễ dàng chuyển sang nhóm
formyl. Mặt khác, khả năng hòa tan của Chlorophyll khác nhau dựa trên loại và tỉ lệ dung môi khác nhau cũng dẫn đến sự khác biệt trong kết quả thí nghiệm (Bảng 3.1). Từ kết quả nghiên cứu trên, dung môi acetone với nồng độ 70% được lựa chọn làm dung môi tách chiết Chlorophyll a cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất/dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
Tiếp tục tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina, sử dụng dung môi acetone 80% với tỉ lệ cơ chất/dung môi là 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (w/v). Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Hàm lượng Chlorophyll khi thay đổi tỷ lệ cơ chất/dung môi
Hàm lượng Chlorophyll (mg/g)
Tỷ lệ cơ chất/dung môi (w/v)
1/5 1/10 1/15 1/20
Chlorophyll a 1.987 2,193 2,137 2,079
Chlorophyll tổng 3,875 4,254 4,219 4,016
Từ kết quả bảng 3.2, có thể khi thay đổi tỉ lệ cơ chất/dung môi thì hàm lượng Chlorophyll a và hàm lượng Chlorophyll tổng tương ứng cũng thay đổi, thấp nhât ở tỷ lệ 1/5 (1.987 mg/g và 3.375 mg/g) và cao nhất với tỷ lệ 1/10 (2.193 mg/gvà 4.254 mg/g). Đối với tỷ lệ cơ chất/dung môi là 1/20 và 1/25, lượng Chlorophyll a và hàm lượng Chlorophyll tổng tương ứng thu được giảm dần từ tỉ lệ 1/20 (2.137 mg/g và 4.219 mg/g ) và 1/25 (2.079 mg/g và 4.016 mg/g). Nguyên nhân của sự thay đổi trên là do với cùng một khối lượng nguyên liệu, khi tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly
tăng do tăng sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi. Tuy nhiên, nếu sử dụng lượng dung môi quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích. Khi đó, nếu muốn thu nhận sản phẩm trích ly ta phải thực hiện quá trình cô đặc hay sử dụng các phương pháp để tách bớt dung môi. Vì thế, với mỗi quá trình trích ly, cần xác định tỉ lệ phù hợp giữa nguyên liệu và dung môi để thu được hiệu suất trích ly cao nhất và tiết kiệm chi phí.
Như vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn tỉ lệ dung môi/cơ chất là 1/10 (w/v) để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll a từ tảo bột Spirulina
Bảng 3.3. Hàm lượng Chlorophyll tại các thời gian chiết khác nhau
Hàm lượng Chlorophyll (mg/g)
Thời gian chiết
12 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
Chlorophyll a 0,933 2,192 2,089 1,895
Chlorophyll tổng 2,018 4,287 4,159 3,864 Kết quả bảng 3.3 cho thấy thời gian trích ly ảnh hưởng đến lượng Chlorophyll thu nhận được. Thời gian chiết càng lâu thì lượng Chlorophyll sẽ càng tăng, song thời gian chiết quá lâu sẽ không mang lại hiệu quả. Trong các khoảng thời gian thử nghiệm, lượng Chlorophyll a và Chlorophyll tổng thu được cao nhất trong 24 giờ trích ly (2,192 mg/g và 4,287 mg/g). Trên lý thuyết, khi kéo dài thời gian trích ly sẽ làm tăng thời gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, do đó làm tăng quá trình khuếch tán của các phân tử chất trích từ trong nguyên liệu vào trong dung dịch và làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, quá trình trích ly sẽ chậm dần cho đến khi sự chênh lệch nồng độ của chất trích trong nguyên liệu và trong dung dịch đạt trạng thái cân
bằng. Khi đó, việc kéo dài thời gian trích ly cũng sẽ không làm tăng lượng chất trích ly được.
Trong thí nghiệm này, do sử dụng phương pháp ngâm chiết để trích ly nên trong thời gian ngắn sẽ không trích ly hầu hết Chlorophyll có trong tế bào mẫu, nhưng trong thời gian trích ly dài thì lượng dung môi sẽ bay hơi một phần, đồng thời xảy ra sự chuyển hóa Chlorophyll thành pheophytin và các đồng phân khác, dẫn đến thời gian càng lâu thì lượng Chlorophyll thu được không tăng mà có xu hướng giảm. Với mục tiêu thu lượng Chlorophyll cao nhất, thời gian trích ly 24 giờ được chọn là thời gian trích ly thích hợp nhất.