Nghiên cứu tách chiết ergosterol từ sinh khối các chủng nấm cordyceps sp. phân lập tại VIỆT NAM

Nấm là nguồn thiên nhiên sản sinh nhiều hợp chất steroid có cấu trúc đa dạng cả về khung carbon và nhóm chức. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng viêm, ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, kháng virus, kháng sinh…. Trong đó, ergosterol là một chất thuộc nhóm steroid, có vai trò quan trọng trong việc hình thành vitamin D dưới tác dụng của tia cực tím, cấu thành màng tế bào của nấm, vi sinh vật và một số loài thực vật…… Ergosterol và dẫn xuất của chúng tách chiết từ một số loại nấm có khả năng kháng ung thư, tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể, giúp điều trị các bệnh nấm kí sinh trên cơ thể động vật.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC -------  ------- ĐOÀN MINH QUÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ERGOSTEROL TỪ SINH KHỐI CÁC CHỦNG NẤM CORDYCEPS SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HÓA Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐINH MINH HIỆP TP.HCM – Tháng năm 2013 LỜI CẢM ƠN -------  ------Lời đầu tiên, xin chân thành gửi đến ba mẹ tạo điều kiện không ngừng động viên cho con, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn: - Các thầy cô Khoa Sinh Học trường Đại Học Khoa học Tự nhiên TP.HCM tận tụy dạy dỗ em suốt tháng năm học tập nghiên cứu trường. - Thầy TS. Đinh Minh Hiệp người tận tình hướng dẫn, tập cho em bước đường nghiên cứu khoa học, cho em lời khuyên, kiến thức, kinh nghiệm quý báo học tập sống. - Cô ThS.DS. Dương Thị Mộng Ngọc tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian công sức để truyền đạt cho em kinh nghiệm, kiến thức quý giá tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này. - Cô Nguyễn Thị Hoa, anh Bùi Thế Vinh, chị Lâm Bích Thảo, chị Nguyễn Thị Ngọc Đan anh chị Trung tâm Sâm Dược liệu TPHCM hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt thời gian em thực khóa luận mình. Đặc biệt chị Nguyễn Thị Ngọc Đan bảo tận tình cho em mặt kỹ thuật trình làm đề tài. - Các thầy cô bạn phòng thí nghiệm Sinh Hóa Trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên, bạn sinh viên trường Đại Học Nông Lâm giúp đỡ, tạo điều kiện chia sẻ kinh nghiệm học tập trình làm khóa luận em trung tâm. Sinh viên thực Đoàn Minh Quân Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT . iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ . Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1. GIỚI THIỆU CORDYCEPS . 1.1.1. Nguồn gốc . 1.1.2. Phân bố 1.2. CÁC HỢP CHẤT CHÍNH TRONG CORDYCEPS 1.2.1. Thành phần hóa học . 1.2.2. Các hợp chất có giá trị dược tính cao 1.3. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TRONG CORDYCEPS 10 1.3.1. Kháng ung thư . 10 1.3.2. Apoptosis . 11 1.3.3. Một số hoạt tính khác 12 1.4. ERGOSTEROL - TỔNG QUAN VÀ SỰ KHÁNG PHÂN BÀO . 13 1.4.1. Ergosterol 13 1.4.2. Cơ sở phân tử cho trình kháng phân bào ergosterol 16 1.4.3. Một số nghiên cứu tác dụng ergosterol 17 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp i Khóa luận tốt nghiệp 2.2. Vật liệu đối tượng nghiên cứu . 20 2.3. Hóa chất thiết bị 21 2.3.1. Hóa chất . 21 2.3.2. Thiết bị . 21 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Quy trình nghiên cứu . 22 2.4.2. Phương pháp nhận danh, phân tách ergosterol 23 2.4.2.3. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột 24 2.4.2.6. Nạp dung môi vào cột sắc ký 27 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 28 2.4.4. Xác định hàm lượng ergosterol cao PE . 28 2.4.5. Thử nghiệm hoạt tính ergosterol tế bào ung thư . 29 2.4.5.1. Thử nghiệm SRB 30 2.4.5.2. Xử lý kết . 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1. Kết định lượng ergosterol 34 3.1.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại ergosterol chuẩn MeOH . 34 3.1.2. Kết dựng đường chuẩn esgosterol 34 3.2. Nhận danh, phân tách ergosterol 38 3.2.1 Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột . 38 3.2.2 Tiến hành sắc ký cột hở 38 3.2.3. Phân tách, tinh chế chất từ phân đoạn (phân đoạn có chứa ergosterol) . 42 3.2.4. Kiểm tra độ tinh chất E9 . 43 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp ii Khóa luận tốt nghiệp 3.4. Khảo sát cấu trúc chất E9 tinh chế 46 3.5. Khảo sát khả gây độc tế bào xác định IC50 . 48 3.5.1. Khảo sát khả gây độc tế bào . 48 3.5.2. Xác định giá trị IC50 49 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1. Kết luận 54 4.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 55 Phụ Lục 1. Biểu đồ Phổ 1H-NMR chất E9 58 Phụ Lục 2. Kết Phổ 1H-NMR dãn rộng chất E9 59 Phụ Lục 3. Kết xác định độc tính tế bào 60 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp iii Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADP adenosine diphotphat DNA deoxiribonucleotide ED50 effective dose (liều tác dụng tối đa 50% đối tượng thử) EtOAc ethyl acetat EtOH ethanol E9 chất ergosterol phân đoạn thứ Rf ratio of flow (hệ số di chuyển) RSD độ lệch chuẩn tương đối IC50 inhibitory concentration ( nồng độ ức chế 50% đối tượng thử) IFN interferon IL interleukine IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry MeOH methanol NMR nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PE ether dầu hỏa SD độ lệch chuẩn SKLM sắc ký lớp mỏng SRB Sulforhodamine B TB trung bình TNF tumor necrosis factor UV ultraviolet (bức xạ tử ngoại) SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp iv Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tỉ lệ (mg/g) chất Cordyceps Bảng 2.1. Các thông số sau nạp mẫu vào cột sắc ký . 27 Bảng 3.1. Kết OD ergosterol chuẩn bước sóng 282 nm 34 Bảng 3.2. Hàm lượng ergosterol cao PE 10 mẫu sinh khối Cordyceps 36 Bảng 3.3. Kết Rf cho hệ dung môi thử nghiệm 38 Bảng 3.4. Kết hệ dung môi cho trình chạy cột. 39 Bảng 3.5. Tổng kết phân đoạn trình tách chiết 41 Bảng 3.6. Kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư MCF-7 mẫu PE06 48 Bảng 3.7. Kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư MCF-7 mẫu PE67 48 Bảng 3.8. Kết IC50 tế bào ung thư vú cao PE06 50 Bảng 3.9. Kết IC50 tế bào ung thư vú cao PE67 50 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp v Khoá luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Quả thể số loài nấm Cordyceps . Hình 1.2. Cấu trúc hóa học số hợp chất phân lập từ Cordyceps Hình 1.3. Cấu trúc mạch C nhóm sterol 13 Hình 1.4. Phân loại nhóm chất steroid 14 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học ergosterol . 14 Hình 1.6. Sơ đồ đường sinh tổng hợp ergosterol 16 Hình 2.1. 10 mẫu cao PE sinh khối nấm Cordyceps . 20 Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu tổng quát . 22 Hình 2.3. Thực nạp cột sắc ký . 25 Hình 2.4. Quy trình nạp mẫu chất hấp thu (silicagel) vào cột sắc ký . 26 Hình 2.5. Cột sắc ký sau chuẩn bị xong 27 Hình 3.1. Độ hấp thu cực đại ergosterol chuẩn MeOH . 34 Hình 3.2. Đường biểu diễn tuyến tính ergosterol chuẩn nồng độ 10-50 g/ml . 35 Hình 3.3. Sắc ký đồ phân đoạn hiển thị đèn UV 254nm . 40 Hình 3.4. Sắc ký đồ phân đoạn hiển thị thuốc thử H2SO4 10%/EtOH 40 Hình 3.5. Tinh thể chất cần phân lập thu phân đoạn thứ . 42 Hình 3.6. Sơ đồ phân lập cao PE qua sắc ký cột hở 42 Hình 3.7. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất E9 với hệ dung môi . 43 Hình 3.8. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất E9 với hệ dung môi 44 Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất E9 với hệ dung môi 45 Hình 3.10. Biểu đồ thể hoạt tính gây độc tế bào mẫu cao dòng tế bào ung thư vú MCF-7 . 49 Hình 3.11. Biểu đồ giá trị IC50 cao PE dòng tế bào ung thư vú MCF-7 . 51 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp vi Khoá luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp Khoá luận tốt nghiệp Nấm nguồn thiên nhiên sản sinh nhiều hợp chất steroid có cấu trúc đa dạng khung carbon nhóm chức. Các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý kháng viêm, ức chế phát triển tế bào ung thư, kháng virus, kháng sinh…. Trong đó, ergosterol chất thuộc nhóm steroid, có vai trò quan trọng việc hình thành vitamin D tác dụng tia cực tím, cấu thành màng tế bào nấm, vi sinh vật số loài thực vật…… Ergosterol dẫn xuất chúng tách chiết từ số loại nấm có khả kháng ung thư, tăng cường hệ miễn dịch cho thể, giúp điều trị bệnh nấm kí sinh thể động vật. Các nghiên cứu cho thấy nấm Cordycpes chứa ergosterol có giá trị dược tính cao, chứng minh qua thí nghiệm lâm sàng dòng tế bào ung thư gan, ung thư vú, ung thư cổ tử cung…. cho kết khả quan. Ở Việt Nam, nấm Cordyceps tìm thấy vài năm trở lại đây, nghiên cứu Việt Nam cấu trúc hoạt tính sinh học ergosterol nấm chưa ý nhiều, loài nấm Cordyceps phân lập Việt Nam. Nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính ergosterol sinh khối nấm Cordyceps, thực đề tài với nội dung sau: - Định lượng ergosterol cao phân đoạn - Nghiên cứu hệ dung môi tách chiết sắc kí cột - Nghiên cứu công đoạn tinh hiệu - Xác định cấu trúc hóa học ergosterol tinh sạch. - Thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp Khoá luận tốt nghiệp 3.4. Khảo sát cấu trúc chất E9 tinh chế - Hợp chất E9 (10 mg), có đặc điểm sau: + Tinh thể màu trắng, hình kim. + Phổ UV, hình 3.1 cho phổ hấp thu cực đại bước sóng 282 nm. + Phổ 1H-NMR (CDCl3), ppm: 3,628 (1H, m, >CH-OH); 5,384 (1H, m, >CH-); 5,571 (1H, m, >CH-); 5,182 (1H, dd, >CH-); 5,219 (1H, dd, >CH-). Các độ dịch chuyển hóa học khác biểu đồ giải phổ trình bày bảng 3.6 phần phụ lục 1, phụ lục 2. Biện luận cấu trúc - Phổ 1H-NMR có diện proton ở: ppm = 3,328 (1H, m) đặc trưng cho H C3, liên kết với nhóm –OH ppm = 5,384 (1H, m) 5,571(1H, m) đặc trưng cho H C6 C7, có liên kết đôi. ppm = 5,182 (1H, dd) 5,219 (1H, dd) đặc trưng cho H C22 C23, có liên kết đôi C22 C23. - Dựa kết phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học H đặc trưng, dự đoán E9 khung triterpen với cấu trúc ergosterol - Chúng tiến hành so sánh với phổ 1H-NMR ergosterol chuẩn theo Dan Q.C cộng (2013). [7]. Từ số liệu trên, đề nghị cấu trúc chất E9 ergosterol. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 46 Khoá luận tốt nghiệp Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR hợp chất E9 Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Loại carbon -CH2-CH2>CH-OH -CH2>C< >CH>CH>C< >CH>C< -CH2-CH2>C< >CH-CH2-CH2>CH-CH3 -CH3 >CH-CH3 >CH>CH-CH2-CH< -CH3 -CH3 -CH3 E9 ᵟ (ppm) 3,628 ( 1H, m) 5,384 (1H, m) 5,571 (1H, m) 0,631 (3H, s) 0,947 (3H, s) 1,043 (3H, d) 5,182 (1H, dd) 5,219 (1H, dd) 0,831 (3H, d) 0,846 (3H, d) 0,920 (3H, d) H SVTH: Đoàn Minh Quân Ergosterol ᵟ (ppm) 3,63 ( 1H, m) 5,39 (1H, m) 5,58 (1H, m) 0,63 (3H, s) 0,95 (3H, s) 1,04 (3H, d) 5,18 (1H, dd) 5,22 (1H, dd) 0,83 (3H, d) 0,84 (3H, d) 0,92 (3H, d) H GVHD: Đinh Minh Hiệp 47 Khoá luận tốt nghiệp 3.5. Khảo sát khả gây độc tế bào xác định IC50 3.5.1. Khảo sát khả gây độc tế bào Tiến hành thử nghiệm SRB để xác định khả gây độc tế bào mẫu cao PE06 PE67 dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Kết sau: Bảng 3.6. Kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư MCF-7 mẫu PE06 Nồng độ Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± SD 100 69,06 61,43 64,64 65,04 ± 3,83 50 64,31 57,97 67,91 63,40 ± 5,03 40 58,94 62,74 66,67 62,78 ± 3,86 30 52,29 53,32 59,48 55,03 ± 3,89 20 27,64 29,24 42,75 33,21 ± 8,30 10 -1,90 -7,13 0,43 -2,87 ± 3,88 Bảng 3.7. Kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư MCF-7 mẫu PE67 Nồng độ Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67 50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 48 Khoá luận tốt nghiệp Phần trăm gây độc tế bào (%) 70 PE 06 PE 67 60 50 40 30 20 10 100 50 40 30 20 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.10. Biểu đồ thể hoạt tính gây độc tế bào mẫu cao dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Nhận xét: Bảng 3.6, 3.7 hình 3.10 cho thấy cao PE06 PE67 nồng độ 100g/ml có khả gây độc cao sau 48 cảm ứng. Khi giảm nồng độ dần xuống mẫu PE06 cho kết tốt mẫu PE67. Ở nồng độ 50g/ml, 40g/ml, khả gây độc tế bào mẫu PE06 60%, mẫu PE67 giảm hoạt tính gây độc. Mặc dù mẫu PE06 giảm nồng độ từ 100g/ml xuống 50g/ml khả gây độc hiệu với phần trăm ức chế 63%. Kết định lượng ergosterol mẫu cao cho thấy mẫu PE06 có hàm lượng ergosterol cao mẫu PE67, kết hợp với khả gây độc tế bào cao PE06 chứng tỏ việc ảnh hưởng ergosterol tế bào ung thư vú MCF-7. 3.5.2. Xác định giá trị IC50 Kết sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào sau 48 xử lý nồng độ cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao. Vì tiếp tục xác định giá trị ức chế 50% tăng trưởng tế bào cao PE để có so sánh nồng độ gây độc cao, từ củng cố thêm giá trị dược tính cao PE06. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 49 Khoá luận tốt nghiệp Để xác định giá trị IC50, xác định phần trăm gây độc tế bào dãy gồm nồng độ. Dựa vào phương pháp nội suy xác định giá trị nồng độ có phần trăm gây độc tế bào 50%. Kết hiển thị bảng 3.8, 3.9 hình 3.11. Bảng 3.8. Kết IC50 tế bào ung thư vú cao PE06 PE06 Nồng độ Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± SD 100 69,06 61,43 64,64 65,04 ± 3,83 50 64,31 57,97 67,91 63,40 ± 5,03 40 58,94 62,74 66,67 62,78 ± 3,86 30 52,29 53,32 59,48 55,03 ± 3,89 20 27,64 29,24 42,75 33,21 ± 8,30 IC50 29,07 28,62 24,33 27,34 ± 2,62 Bảng 3.9. Kết IC50 tế bào ung thư vú cao PE67 PE67 Nồng độ Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) (µg/ml) Lần Lần Lần TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67 60 54,36 55,4 54,4 54,72 ± 0,59 50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74 IC50 56,89 54,73 54,77 55,46 ± 1,24 SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 50 Khoá luận tốt nghiệp Giá trị IC50 (µg/ml) 60 50 40 30 20 10 PE 06 PE 67 Mẫu cao PE Hình 3.11. Biểu đồ giá trị IC50 cao PE dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Nhận xét: Giá trị IC50 nhỏ cho thấy hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao. Kết cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao nhiều so với mẫu PE67. Theo chương trình tầm soát hoạt tính kháng ung thư hợp chất tự nhiên Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, cao chiết có IC50 < 30 μg/ml có hoạt tính gây độc tế bào in vitro mức tốt, mức IC50 > 30 μg/ml khả gây độc tế bào thấp. Như vậy, giá trị IC50 cao PE06 nồng độ 27,34 ± 2,62μg/ml chứng tỏ thành phần hoạt chất cao chiết PE06 có tác dụng lên tế bào ung thư vú MCF-7. Đánh giá chung: Dựa kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào xác định giá trị IC50 cao PE06 (có hàm lượng ergosterol cao nhất) cao PE67 (có hàm lượng ergosterol thấp nhất), cho thấy phân đoạn cao PE có hoạt tính cao dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Cao PE phân đoạn chứa hợp chất có tính phân cực có nguyên liệu, đại diện nhóm phân cực nguyên liệu Cordyceps nhóm sterol, mà điển hình ergosterol, nghiên cứu. Theo kết định lượng ergsoterol, mẫu cao PE06 có lượng ergosterol chiếm khoảng 40%, cao PE67 có khoảng 11%, kết hoạt tính SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 51 Khoá luận tốt nghiệp gây độc tên tế bào cho thấy cao PE06 có hoạt tính cao nhiều so với cao PE67, kết hợp với giá trị IC50 cao PE06 mức thấp. Từ đó, nhận thấy có khả ergosterol tác nhân gây độc tế bào. Điều phù hợp với nghiên cứu Wu J.Y (2007) [21]. Và theo Huber (2003), bề mặt tế bào ung thư vú MCF7 có nhiều estrogen receptor, nội tiết tố estrogen có chức điều hòa trình phiên mã cách gắn với estrogen receptor, nghiên cứu cho thấy khả liên kết với estrogen receptor ergosterol lớn so với estrogen chúng có cấu trúc giống sườn C.[10] SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 52 Khoá luận tốt nghiệp Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 53 Khoá luận tốt nghiệp 4.1. Kết luận Chúng đạt nội dung nghiên cứu đề với kết luận sau: 1. Đã tiến hành định lượng ergosterol mẫu cao PE sinh khối 10 chủng nấm Cordyceps, từ chọn mẫu cao PE06 có hàm lượng ergosterol cao để tiến hành nhận danh tinh chất ergosterol có cao. 2. Đã chọn hệ dung môi thích hợp cho trình chạy cột sắc ký trình phân tách ergosterol cao PE06 hệ PE : EtOAc (8:2) 3. Đã tinh chất mục tiêu cao PE; kiểm tra độ tinh sắc ký lớp mỏng tiến hành giải cấu trúc hóa học phổ 1H-NMR. Từ đó, đề nghị cấu trúc chất mục tiêu ergosterol. 4. Đã khảo sát hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 xác định giá trị IC50 cao PE06 cao PE67 tương ứng 27,34% 55,46%. 4.2. Kiến nghị 1. Phân lập nhóm chất cordycepin; adenosine; acid cordycepic mẫu cao 2. Tiến hành thử nghiệm thêm hoạt tính cao PE06 dòng ung thư khác. 3. Xác định chất cao PE06, từ củng cố thêm vai trò ergosterol dòng tế bào ung thư. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 54 Khoá luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Đình Giậu (2000), Sinh lý học người động vật, NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 64-71 [2] Đặng Văn Hòa cộng (2006-2007), Kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu giảng dạy sinh viên dược 5, Bộ môn Hóa phân tích, kiểm nghiệm, Trường Đại Học Y Dược TPHCM, trang 30 [3] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng phân tích hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 281-288. [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 180-196, trang 244-249. [5] Ca Thị Út (2012), Chiết xuất phân đoạn xác định hoạt chất sinh khối nấm Cordyceps sp phân lập Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp cử nhân, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TPHCM. Tiếng nước [6] Bok J. W., Lermer L., Chilton Je., Klingeman Hans G., Neil G.H. Towers (1998), Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis, Phytochemistry 51 (7), p.891-898. [7] Dan Q.C. (2013), Cloud-Point extraction combined with liquid chromatography for the determination of ergosterol, a natural product with diuretic activity, in rat plasma, urine, and faeces, A Research Acticle Journal of Analytical Methods in Chemistry. [8] Holliday J. C. (2005), On the trail of the yak: ancient Cordyceps in the Modern World, p.623-630. [9] Holliday, John (2008), Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A Review, International Journal of Medicinal Mushrooms (New York: Begell House), 10 (3), p.219-234. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 55 Khoá luận tốt nghiệp [10] Huber V.H(2003), Ergosterol (Major Sterol of Baker’s and Brewer’s Yeast Extracts) inhibits the growth of human breast cancer cells in vitro and the potential role of its oxidation products, International Journal for Vitamin and Nutrition Research, p.19-23 [11] Hsu T.H., Shiao L.H., Hsieh C., Chang D.M. (2002), A comparison of the chemical composition and bioactive ingredients of the Chinese medicinal mushroom DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis, Food Chemistry 78, p.463–469 [12] Fan H., Li S.P., Xiang J.J., Lai C.M., Yang F.Q., Gao J.L., Wang Y.T. (2006), Qualitative and quantitative determination of nucleosides, bases and their analogues in natural and cultured Cordyceps by pressurized liquid extraction and high performance liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC–ESI–MS/MS), Analytica Chimica Acta 567, p.218– 228. [13] Li S.P., Yang F.Q., Tsim Karl W.K. (2006), Quality control of Cordyceps sinensis a valued traditional Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, p1571–1584 [19] Wu F., Yan H., Ma X., Jia J., Zhang G., Guo X. and Gui Z. (2010), Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris, Journal of Ethnopharmacology 96, p.555–561 [14] Masuda M., Urabe E., Honda H., Sakurai A., Sakakibara M. (2007), Enhanced production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris, Biochemical Engineering Journal, p.1199-1205. [15] G.P.Moss(1989), Nomenclature of Steroids, Internaltional Union of Pure and Applied Chemistry, p.1791-1793. [16] Oh J.Y., Cho E.J, Nam S.H., Choi J.W., Yun J.W., (2007), Production of polysaccharide–peptide complexes by submerged mycelial culture of an entomopathogenic fungus Cordyceps sphecocephala, Process Biochemistry 42, p.352–362. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 56 Khoá luận tốt nghiệp [17] Ohmori T., Tamura K., Furuki K., Kawanishi G., Mitsuyama M., Nomoto K. (1989), Isolation of galactosaminoglycan moity (CO-N) from protein-bound polysaccharide of Cordyceps ophioglossoides and its effects against murine tumor, Chemical & Pharmaceutical Bulletin 37, p.1019-1022. [18] Toshiyuki T., Mitsuru Y. (2004), Ergosterol Peroxide, an Apoptosis-Inducing Component Isolated form Sarcodon aspratus (Ber.) S.Ito, Jewish Business Students Association, p.212-215. [19] Wang F., Fang Y., Zhang M., Lin A., Zhu T., Gu Q., Zhu W. (2008), Six new ergosterols from the marine-derived fungus Rhizopus sp., Steroids, p.19-26. [20] Wu F., Yan H., Ma X., Jia J., Zhang G., Guo X. and Gui Z. (2010), Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris, Journal of Ethnopharmacology 96, p.555–561 [21] Wu J. Y., Zhang Q. X., Leung P. H. (2007), Inhibitory effects of ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis mycelium on various cancer cells in culture and B16 melanoma in C57BL/6 mice, Phytomedicine 14, p.43–49. [22] Zhang Q., Wu J., Hua Z., Li D. (2004), Induction of HL-60 apoptosis by ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis fungal mycelium, Life Sciences 75, p.2911–2919. [23] Zhou X, Luo L, Dressel W, Shadier G, Krumbiegel D, Schmidtke P, Zepp F, Meyer CU (2008), Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient of Cordyceps sinensis, The American Journal of Chinese Medicine, 36 (5), p.96780. SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 57 Phụ Lục 1. Biểu đồ Phổ 1H-NMR chất E9 58 Phụ Lục 2. Kết Phổ 1H-NMR dãn rộng chất E9 59 Phụ Lục 3. Kết xác định độc tính tế bào 60 61 [...]... Các chủng của chi Cordyceps đã được tìm thấy trên sáu lục địa và trong nhiều vùng khí hậu và môi trường sống, ký sinh trên nhiều loại vật chủ, bao gồm côn trùng, nhện, và thậm chí cả các loại nấm khác.[8] Năm 2010, một nhóm các nhà nấm học của Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc đã phối hợp nghiên cứu và sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps Theo kết quả nghiên cứu này, toàn bộ các loài thuộc nhóm nấm Cordyceps. .. PHÁP NGHIÊN CỨU SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 19 Khoá luận tốt nghiệp 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 4/2013 – 7/2013 - Địa điểm: Trung tâm Sâm và Dược Liệu TPHCM Số 41 Đinh Tiên Hoàng, quận 1, TPHCM 2.2 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu trên 10 cao PE được chiết bởi Ca Thị Út (2012) Hình 2.1 10 mẫu cao PE của sinh khối nấm Cordyceps. .. 5,6epoxy-24(R)-methylcholesta-7,22-dien-3β-ol từ cao chiết MeOH của Cordyceps sinensis Hai hợp chất trước đây được biết, ergosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid và SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 17 Khoá luận tốt nghiệp 22-dihydroergosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid cũng được phân lập trong các phân đoạn cao chiết MeOH [6] Năm 2007, các nhà khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu ra ergosterol peroxide từ nấm Sarcodon Asparatus... thì ergosterol có ảnh hưởng nhiều về phương pháp miễn dịch trị liệu Các nghiên cứu đã chứng minh ergosterol có ảnh hưởng đến việc hỗ trợ và tăng cường các tế bào T, tế bào giết tự nhiên, đại thực bào… kích thích các IL-2, IL-4 để hỗ trợ trong việc ức chế các tế bào ung thư Đa phần các chất này thuộc dẫn xuất ergosterol là ergosterol peroxide Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Huber (2003) thì ergosterol. .. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Quy trình nghiên cứu Định lượng Ergsoterol trong cao PE của 5 sinh khối nấm Chọn cao PE có hàm lượng ergosterol cao nhất và thấp nhất Thử hoạt tính trên tế bào ung thư vú-MCF-7 Tiến hành chạy sắc ký cột cho cao PE có ergosterol cao nhất So sánh sự tác dụng của 2 loại cao PE Nghiên cứu hệ dung môi tách hiệu quả trên sắc ký bản mỏng Chạy hệ dung môi đã nghiên cứu trên cột... Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 9 Khoá luận tốt nghiệp 1.2.2.5 Các nhóm hoạt chất khác Hai mươi tám loại acid béo bão hòa và không bão hòa và các dẫn xuất của chúng đã được phân lập từ C sinensis Các hợp chất phân cực của các cao chiết từ Cordyceps bao gồm nhiều hợp chất hydrocarbon, rượu và aldehyd Đặc biệt các hydrocacbon thơm đa vòng được tạo ra bởi Cordyceps sinensis là chất chuyển hóa thứ cấp Những hợp... trong các mô khỏe mạnh Sự tăng trưởng khối u được kiểm soát bởi sự cân bằng giữa tăng sinh của tế bào và quá trình apoptosis Hầu hết các loại thuốc hóa trị ung thư tác dụng gây độc tế bào trên các tế bào ác tính bằng cách gây apoptosis Một hợp chất sterol H1-A phân lập từ C.sinensis đã ức chế bệnh tự miễn dịch ở chuột, thúc đẩy quá trình apoptosis để ngăn chặn sự tăng sinh tế bào khối u ở người Nghiên cứu. .. trong Cordyceps Ergosterol tồn tại ở dạng tự do và kết hợp trong Cordyceps Lượng ergosterol tự do cao trong Cordyceps tự nhiên và lượng ergosterol có thể phản ánh chất lượng hệ sợi Cordyceps Các đồng dạng ergosterol có dược tính khá đa dạng như độc tính tế bào, kháng virus và chống loạn tim.[13] 1.2.2.4 Peptid Hơn 20% acid amin có thể có trong Cordyceps Năm 1988, 6 hợp chất cyclodipeptid được chiết. .. chiết xuất từ Cordyceps nuôi cấy và trong đó, cyclo-(L-glycyl-Lprolyl) có hoạt tính chống ung thư và tiềm năng miễn dịch Ngoài ra, nghiên cứu ở chuột cho thấy cordycepeptid A chiết xuất từ C militaris có thể làm tăng khả năng “thực bào” của đại thực bào.[13] Sự khác nhau trong hàm lượng acid amin giữa sâu và thể quả Cordyceps tự nhiên, cũng như trong sinh khối sợi nấm được thể hiện trong nghiên cứu của... bào của sợi nấm C sinensis trên tế bào HL-60, nghiên cứu quá trình apoptosis, sự ngưng tụ nhiễm sắc thể, sự phân mảnh DNA, sự kích hoạt hoạt động của caspase-3 và sự phân cắt của ADP-ribose polymerase của các cao chiết từ sợi nấm Kết quả là cao SVTH: Đoàn Minh Quân GVHD: Đinh Minh Hiệp 11 Khoá luận tốt nghiệp ethyl acetat từ sợi nấm C sinensis gây độc mạnh tế bào HL-60 với ED50 ≤ 25 µg/ml Phân tích hóa . KHOA SINH HỌC    ĐOÀN MINH QUÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ERGOSTEROL TỪ SINH KHỐI CÁC CHỦNG NẤM CORDYCEPS SP. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH SINH. chú ý nhiều, nhất là các loài nấm Cordyceps phân lập tại Việt Nam. Nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của ergosterol trong sinh khối nấm Cordyceps, chúng tôi. kết quả khả quan. Ở Việt Nam, nấm Cordyceps mới được tìm thấy vài năm trở lại đây, và các nghiên cứu tại Việt Nam về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của ergosterol trong nấm chưa được chú