Nhận danh, phân tách ergosterol

3.2.1 Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột

Sau khi tiến hành thử nghiệm hệ dung môi theo mục 2.4.2.1, kết quả được hiển thị ở bảng 3.3. Từ đó, chúng tôi chọn được hệ dung môi PE : EtOAc có tỉ lệ 8:2 để tiến hành cho quá trình chạy sắc ký cột. Với lý do:

1. Hệ số Rf phải nằm trong khoảng từ 0,3-0,6. [4]

2. Cao PE là cao dùng để phân tích và nhận danh ergosterol, nên dung môi PE dược ưu tiên dùng.

3. Tỉ lệ dung môi aceton trong hệ dung môi thấp, cộng với tốc độ bay hơi của aceton rất cao nên có thể làm sai lệch tỉ lệ trong quá trình tiến hành thí nghiệm.

Bảng 3.3. Kết quả Rf cho các hệ dung môi thử nghiệm

3.2.2 Tiến hành sắc ký cột hở

Cao PE toàn phần có khối lượng 9,8992g được sắc ký cột với điều kiện:

- Khối lượng mẫu được trộn với khoảng 12g silicagel hạt mịn, sấy khô nhẹ trên bếp cách thủy cho đến khi thu được bột đồng thể, tơi mịn màu vàng nâu. Sau đó mẫu được đem nạp vào cột.

- Cột 3x50cm, rửa sạch, sấy khô, chứa 85g silicagel hạt mịn Tên hệ dung môi Hệ số Rf

PE : EtOAc (8:2) 0,5

PE : aceton (9:1) 0,43

n-hexan : aceton (8:2) 0,72 n-hexan : EtOAc (8:2) 0,6

- Pha động: hệ PE (100)  PE-EtOAc (95:5)  PE-EtOAc (9:1)  PE-EtOAc (85:5)  PE-EtOAc (8:2)  PE-EtOAc (5:5)

Bảng 3.4. Kết quả hệ dung môi cho quá trình chạy cột.

Tên hệ dung môi Tỉ lệ

Tốc độ dòng (giọt/phút) Thể tích hứng (ml) Tổng thể tích hứng (ml) PE 100 55 200 4400 PE - EtOAc 95:5 65 700 9:1 60 1000 85:5 62 500 8:2 60 1000 5:5 96 1000

Theo dõi quá trình tách bằng SKLM, khai triển với hệ PE-EtOAc (8:2), phát hiện bằng đèn UV 254nm và phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH. Gộp các phân đoạn chứa các vết có độ phân cực tương tự nhau.

Tiến hành chấm sắc ký cho từng chai hứng dịch chảy ra từ cột sắc ký, các chai nào có vết giống nhau trên bản sắc ký được dồn chung lại thành một phân đoạn chung. Kết thúc quá trình chạy cột thu được kết quả như sau:

Thành phần các phân đoạn của cột sắc ký được trình bày ở hình 3.3 và 3.4

Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn hiển thị dưới đèn UV 254nm

Hình 3.4. Sắc ký đồ các phân đoạn hiển thị dưới thuốc thử H2SO4 10%/EtOH Nhận xét: Vệt màu tím xuất hiện ở phân đoạn thứ 9 và trong cao PE06 trùng với vệt của ergosterol chuẩn (mũi tên màu đỏ).

Bảng 3.5. Tổng kết các phân đoạn trong quá trình tách chiết

Nhận xét:

Vết ergsoterol xuất hiện ở phân đoạn thứ 9 (từ chai số 28 tới chai số 33), khối lượng phân đoạn này thu được nhiều hơn các phân đoạn khác. Phân đoạn có nhiều ergosterol ở khoảng giữa của các phân đoạn, phù hợp với giá trị Rf của dung

Số thứ tự lọ Tên phân đoạn (F)

Dung môi giải ly

cột Cao (g) Sắc ký lớp mỏng 1-4 1 PE (100) 0 Không có vết 5 2 PE-EtOAc (95:5) PE-EtOAc (9:1) 0,113 Có 2 vết màu nâu và xanh 6-7 3 1,942 8-10 4 0,689

11-12 5 0,142 Có nhiều vết màu nâu

13-21 6 0,692 Có nhiều vết màu nâu

22-24 7 PE-EtOAc (9:1) 0,136 Có vết màu vàng 25-27 8 0,211 Có nhiều vết 28-33 9 3,503 Có vết màu tím giống như chất chuẩn 34-45 10 PE-EtOAc (85:5) 0,368 Có nhiều vết, có vết màu xanh 46-52 11 PE-EtOAc (8:2) 0,096 Có nhiều vết, có vết màu xanh 53-55 12 0,876 Có nhiều vết, có vết màu xanh đậm 56 13 0,118 Có vết kéo dài 57 14 0,164 Có vết kéo dài 58-71 15 PE-EtOAc (8:2) PE-EtOAc (5:5) 1,184 Có vết kéo dài 72-94 16 0,341 Có vết kéo dài

môi chạy cột đã thử nghiệm lúc đầu, chứng tỏ việc lựa chọn hệ dung môi cho chạy cột sắc ký là phù hợp.

3.2.3. Phân tách, tinh chế chất từ phân đoạn 9 (phân đoạn có chứa ergosterol)

Hình 3.5. Tinh thể chất cần phân lập thu ở phân đoạn thứ 9

Chúng tôi nhận thấy phân đoạn thứ 9 có chất quan tâm ở dạng tinh thể hình kim, tiến hành thu tinh thể để tinh sạch theo mục 2.4.2.7, tinh thể được đặt tên là E9

Hình 3.6. Sơ đồ phân lập cao PE bằng qua sắc ký cột hở

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 Cao PE06

Silicagel; PE : EtOAc

3.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch của chất E9

Tiến hành: SKLM với cả 3 hệ dung môi khác nhau, bao gồm : (1) n-hexan : EtOAc (8:2); (2) PE : EtOAc (8:2); (3) n-hexan : aceton (8:2); phát hiện bằng đèn UV 254nm, hiện màu với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, sấy ở 1050C trong 10 phút và quan sát dưới ánh sáng thường.

Hình 3.7, 3.8, 3.9 cho thấy chất E9 cùng vi trí với mẫu chuẩn trên SKLM; chất E9 hiện màu tím (mũi tên màu vàng), cùng màu với chất ergosterol chuẩn (mũi tên màu đỏ).

Hình 3.7. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi n-hexan : EtOAc (8:2)

Hệ (1) - n-hexan : EtOAc (8:2)

Soi dưới đèn UV 254nm

Thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, sấy 1050C trong 10phút và

Hình 3.8. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi PE : EtOAc (7:3)

Hệ (2) - PE : EtOAc (7:3)

Soi dưới đèn UV 254nm

Thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, sấy 1050C trong 10phút và

Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất E9 với hệ dung môi n-hexan : aceton (8:2)

Hệ (3) – n-hexan : aceton (8:2)

Soi dưới đèn UV 254nm

Thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, sấy 1050C trong 10phút và

3.4. Khảo sát cấu trúc của chất E9 đã tinh chế

- Hợp chất E9 (10 mg), có những đặc điểm như sau: + Tinh thể màu trắng, hình kim.

+ Phổ UV, hình 3.1 cho phổ hấp thu cực đại ở bước sóng 282 nm. + Phổ 1H-NMR (CDCl3), ppm: 3,628 (1H, m, >CH-OH); 5,384 (1H, m, >CH-); 5,571 (1H, m, >CH-); 5,182 (1H, dd, >CH-); 5,219 (1H, dd, >CH-). Các độ dịch chuyển hóa học khác và biểu đồ giải phổ được trình bày trong bảng 3.6 và phần phụ lục 1, phụ lục 2.

Biện luận cấu trúc

- Phổ 1H-NMR có sự hiện diện proton ở:

ppm = 3,328 (1H, m) đặc trưng cho H tại C3, liên kết với nhóm –OH

ppm = 5,384 (1H, m) và 5,571(1H, m) đặc trưng cho H tại C6 và C7, có liên kết đôi.

ppm = 5,182 (1H, dd) và 5,219 (1H, dd) đặc trưng cho H tại C22 và C23, có 1 liên kết đôi giữa C22 và C23.

- Dựa trên kết quả phổ 1H-NMR về các độ dịch chuyển hóa học của các H đặc trưng, dự đoán E9 là khung triterpen với cấu trúc là ergosterol

- Chúng tôi tiến hành so sánh với phổ 1H-NMR ergosterol chuẩn theo Dan Q.C và cộng sự (2013). [7]. Từ những số liệu trên, chúng tôi đề nghị cấu trúc của chất E9 là ergosterol.

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất E9 Số thứ tự Loại carbon E9 Ergosterol ᵟ H (ppm) ᵟ H (ppm) 1 -CH2- - - 2 -CH2- - - 3 >CH-OH 3,628 ( 1H, m) 3,63 ( 1H, m) 4 -CH2- - - 5 >C< - - 6 >CH- 5,384 (1H, m) 5,39 (1H, m) 7 >CH- 5,571 (1H, m) 5,58 (1H, m) 8 >C< - - 9 >CH- - - 10 >C< - - 11 -CH2- - - 12 -CH2- - - 13 >C< - - 14 >CH- - - 15 -CH2- - - 16 -CH2- - - 17 >CH- - - 18 -CH3 0,631 (3H, s) 0,63 (3H, s) 19 -CH3 0,947 (3H, s) 0,95 (3H, s) 20 >CH- - - 21 -CH3 1,043 (3H, d) 1,04 (3H, d) 22 >CH- 5,182 (1H, dd) 5,18 (1H, dd) 23 >CH- 5,219 (1H, dd) 5,22 (1H, dd) 24 -CH2- - - 25 -CH< - - 26 -CH3 0,831 (3H, d) 0,83 (3H, d) 27 -CH3 0,846 (3H, d) 0,84 (3H, d) 28 -CH3 0,920 (3H, d) 0,92 (3H, d)

3.5. Khảo sát khả năng gây độc tế bào và xác định IC503.5.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào 3.5.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào

Tiến hành thử nghiệm SRB để xác định khả năng gây độc tế bào của 2 mẫu cao PE06 và PE67 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Kết quả như sau:

Bảng 3.6. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE06

Bảng 3.7. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE67 Nồng độ

(µg/ml)

Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 69,06 61,43 64,64 65,04 ± 3,83 50 64,31 57,97 67,91 63,40 ± 5,03 40 58,94 62,74 66,67 62,78 ± 3,86 30 52,29 53,32 59,48 55,03 ± 3,89 20 27,64 29,24 42,75 33,21 ± 8,30 10 -1,90 -7,13 0,43 -2,87 ± 3,88 Nồng độ (µg/ml)

Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67

50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74

Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hoạt tính gây độc tế bào của 2 mẫu cao trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7

Nhận xét:

Bảng 3.6, 3.7 và hình 3.10 cho thấy các cao PE06 và PE67 ở nồng độ 100g/ml đều có khả năng gây độc cao và bằng nhau sau 48 giờ cảm ứng. Khi giảm nồng độ dần xuống thì mẫu PE06 cho kết quả tốt hơn mẫu PE67. Ở các nồng độ 50g/ml, 40g/ml, khả năng gây độc tế bào của mẫu PE06 vẫn trên 60%, trong khi đó mẫu PE67 đã giảm hoạt tính gây độc. Mặc dù ở mẫu PE06 đã giảm nồng độ từ 100g/ml xuống 50g/ml nhưng khả năng gây độc vẫn hiệu quả với phần trăm ức chế 63%. Kết quả định lượng ergosterol trong các mẫu cao cho thấy mẫu PE06 có hàm lượng ergosterol cao hơn mẫu PE67, kết hợp với khả năng gây độc tế bào của cao PE06 đã chứng tỏ về việc ảnh hưởng của ergosterol trên tế bào ung thư vú MCF-7.

3.5.2. Xác định giá trị IC50

Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào sau 48 giờ xử lý ở các nồng độ cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao. Vì vậy chúng tôi tiếp tục xác định giá trị ức chế 50% sự tăng trưởng tế bào trên 2 cao PE để có sự so sánh về nồng độ gây độc ở 2 cao, từ đó củng cố thêm giá trị dược tính của cao PE06.

0 10 20 30 40 50 60 70 100 50 40 30 20 Phầ n t răm gâ y đ ộ c tế b ào ( % ) Nồng độ (µg/ml) PE 06 PE 67

Để xác định giá trị IC50, chúng tôi xác định phần trăm gây độc tế bào trên một dãy gồm 5 nồng độ. Dựa vào phương pháp nội suy xác định giá trị nồng độ có phần trăm gây độc tế bào là 50%. Kết quả được hiển thị ở bảng 3.8, 3.9 và hình 3.11.

Bảng 3.8. Kết quả IC50 trên tế bào ung thư vú của cao PE06

Bảng 3.9. Kết quả IC50 trên tế bào ung thư vú của cao PE67

PE67 Nồng độ

(µg/ml)

Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67 60 54,36 55,4 54,4 54,72 ± 0,59 50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74 IC50 56,89 54,73 54,77 55,46 ± 1,24 PE06 Nồng độ (µg/ml)

Hình 3.11. Biểu đồ giá trị IC50 của 2 cao PE trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Nhận xét:

Giá trị IC50 càng nhỏ cho thấy hoạt tính gây độc tế bào ung thư càng cao. Kết quả cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao hơn nhiều so với mẫu PE67. Theo chương trình tầm soát các hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất tự nhiên của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, những cao chiết có IC50 < 30 μg/ml có hoạt tính gây độc tế bào in vitro ở mức tốt, mức IC50 > 30 μg/ml thì khả năng gây độc tế bào thấp. Như vậy, giá trị IC50 của cao PE06 tại nồng độ 27,34 ± 2,62μg/ml chứng tỏ thành phần hoạt chất trong cao chiết PE06 đã có tác dụng lên tế bào ung thư vú MCF-7.

Đánh giá chung:

Dựa trên kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và xác định giá trị IC50 trên cao PE06 (có hàm lượng ergosterol cao nhất) và cao PE67 (có hàm lượng ergosterol thấp nhất), cho thấy phân đoạn cao PE có hoạt tính cao trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Cao PE là phân đoạn chứa các hợp chất có tính kém phân cực nhất có trong nguyên liệu, trong đó đại diện của nhóm kém phân cực trong nguyên liệu Cordyceps là nhóm sterol, mà điển hình là ergosterol, đang nghiên cứu.

Theo kết quả định lượng ergsoterol, mẫu cao PE06 có lượng ergosterol chiếm khoảng 40%, trong khi đó cao PE67 chỉ có khoảng 11%, kết quả hoạt tính

0 10 20 30 40 50 60 PE 06 PE 67 Gi á tr ị I C50 (µ g/m l ) Mẫu cao PE

gây độc tên tế bào cho thấy cao PE06 có hoạt tính cao hơn nhiều so với cao PE67, kết hợp với giá trịIC50 của cao PE06 ở mức thấp. Từ đó, chúng tôi nhận thấy có khả năng ergosterol là tác nhân gây độc trên tế bào. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Wu J.Y (2007) [21]. Và theo Huber (2003), trên bề mặt tế bào ung thư vú MCF- 7 có nhiều estrogen receptor, nội tiết tố estrogen có chức năng điều hòa quá trình phiên mã bằng cách gắn với estrogen receptor, nghiên cứu cho thấy khả năng liên kết với estrogen receptor của ergosterol lớn hơn so với estrogen là do chúng có cấu trúc giống nhau về sườn C.[10]

Chương 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Chúng tôi đã đạt được các nội dung nghiên cứu đề ra với các kết luận như sau: 1. Đã tiến hành định lượng ergosterol trong các mẫu cao PE của sinh khối 10 chủng nấm Cordyceps, từ đó chọn ra mẫu cao PE06 có hàm lượng ergosterol cao nhất để tiến hành nhận danh và tinh sạch chất ergosterol có trong cao.

2. Đã chọn được hệ dung môi thích hợp cho quá trình chạy cột sắc ký trong quá trình phân tách ergosterol trong cao PE06 là hệ PE : EtOAc (8:2)

3. Đã tinh sạch được chất mục tiêu trong cao PE; kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng và tiến hành giải cấu trúc hóa học bằng phổ 1H-NMR. Từ đó, đề nghị cấu trúc chất mục tiêu là ergosterol.

4. Đã khảo sát hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và xác định giá trị IC50 của cao PE06 và cao PE67 tương ứng là 27,34% và 55,46%.

4.2. Kiến nghị

1. Phân lập các nhóm chất như cordycepin; adenosine; acid cordycepic trong các mẫu cao

2. Tiến hành thử nghiệm thêm hoạt tính của cao PE06 trên các dòng ung thư khác.

3. Xác định các chất trong cao PE06, từ đó củng cố thêm vai trò của ergosterol trên các dòng tế bào ung thư.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

[1] Nguyễn Đình Giậu (2000), Sinh lý học người và động vật, NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 64-71

[2] Đặng Văn Hòa và cộng sự (2006-2007), Kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu giảng dạy sinh viên dược 5, Bộ môn Hóa phân tích, kiểm nghiệm, Trường Đại Học Y Dược TPHCM, trang 30

[3] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 281-288.

[4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 180-196, trang 244-249.

[5] Ca Thị Út (2012), Chiết xuất các phân đoạn và xác định các hoạt chất chính trong sinh khối nấm Cordyceps sp phân lập tại Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp cử nhân, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TPHCM.

Tiếng nước ngoài

[6] Bok J. W., Lermer L., Chilton Je., Klingeman Hans G., Neil G.H. Towers (1998), Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis,

Phytochemistry 51 (7), p.891-898.

[7] Dan Q.C. (2013), Cloud-Point extraction combined with liquid chromatography for the determination of ergosterol, a natural product with diuretic activity, in rat plasma, urine, and faeces, A Research Acticle Journal of Analytical Methods in Chemistry.

[8] Holliday J. C. (2005), On the trail of the yak: ancient Cordyceps in the Modern World, p.623-630.

Phương pháp nhận danh, phân tách ergosterol

Xác định hàm lượng ergosterol trong cao PE