Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB:
1. Giải đông nguồn tế bào ung thư bào quản trong nitơ lỏng nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4).
2. Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70-80%.
3. Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/giếng ban đầu là 104
tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa và MCF-7) và 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào NCI-H460) theo thiết kế (*)
4. Ủ ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
5. Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử ( chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có trong giếng). 6. Ủ ở 37oC, 5% CO2, 48 giờ .
7. Cố định tế bào trong giếng với trichloroacetic acid (TCA) : 8. Nhuộm SRB:
- Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng - Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút
- Loại bỏ dung dịch SRB
- Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ. 9. Đọc kết quả:
- Cho 200µl Tris-base 10mM vào mỗi giếng.
- Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm.
Đối với những dòng tế bào lo lửng: sử dụng dung dịch TCA 80% lạnh vào mỗi giếng, việc cố định tế bào vào giếng tiến hành như sau:
- Đặt đĩa trên vào tủ lạnh (4oC), 1-3 giờ - Loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng.
- Rửa nhẹ nhàng với nước (200µl/giếng) 5 lần. - Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ. (*) Thiết kế khảo sát gồm:
- 1 mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01µg/ml. - 1 mẫu chứng âm: tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%).
- Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc. Trong trường hợp xác định IC50 thì mẫu thử nghiệm sẽ pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:
+ 2 giếng tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát. + 2 giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (2 giếng blank)