3.5.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào
Tiến hành thử nghiệm SRB để xác định khả năng gây độc tế bào của 2 mẫu cao PE06 và PE67 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Kết quả như sau:
Bảng 3.6. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE06
Bảng 3.7. Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 của mẫu PE67 Nồng độ
(µg/ml)
Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 69,06 61,43 64,64 65,04 ± 3,83 50 64,31 57,97 67,91 63,40 ± 5,03 40 58,94 62,74 66,67 62,78 ± 3,86 30 52,29 53,32 59,48 55,03 ± 3,89 20 27,64 29,24 42,75 33,21 ± 8,30 10 -1,90 -7,13 0,43 -2,87 ± 3,88 Nồng độ (µg/ml)
Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67
50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hoạt tính gây độc tế bào của 2 mẫu cao trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7
Nhận xét:
Bảng 3.6, 3.7 và hình 3.10 cho thấy các cao PE06 và PE67 ở nồng độ 100g/ml đều có khả năng gây độc cao và bằng nhau sau 48 giờ cảm ứng. Khi giảm nồng độ dần xuống thì mẫu PE06 cho kết quả tốt hơn mẫu PE67. Ở các nồng độ 50g/ml, 40g/ml, khả năng gây độc tế bào của mẫu PE06 vẫn trên 60%, trong khi đó mẫu PE67 đã giảm hoạt tính gây độc. Mặc dù ở mẫu PE06 đã giảm nồng độ từ 100g/ml xuống 50g/ml nhưng khả năng gây độc vẫn hiệu quả với phần trăm ức chế 63%. Kết quả định lượng ergosterol trong các mẫu cao cho thấy mẫu PE06 có hàm lượng ergosterol cao hơn mẫu PE67, kết hợp với khả năng gây độc tế bào của cao PE06 đã chứng tỏ về việc ảnh hưởng của ergosterol trên tế bào ung thư vú MCF-7.
3.5.2. Xác định giá trị IC50
Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào sau 48 giờ xử lý ở các nồng độ cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao. Vì vậy chúng tôi tiếp tục xác định giá trị ức chế 50% sự tăng trưởng tế bào trên 2 cao PE để có sự so sánh về nồng độ gây độc ở 2 cao, từ đó củng cố thêm giá trị dược tính của cao PE06.
0 10 20 30 40 50 60 70 100 50 40 30 20 Phầ n t răm gâ y đ ộ c tế b ào ( % ) Nồng độ (µg/ml) PE 06 PE 67
Để xác định giá trị IC50, chúng tôi xác định phần trăm gây độc tế bào trên một dãy gồm 5 nồng độ. Dựa vào phương pháp nội suy xác định giá trị nồng độ có phần trăm gây độc tế bào là 50%. Kết quả được hiển thị ở bảng 3.8, 3.9 và hình 3.11.
Bảng 3.8. Kết quả IC50 trên tế bào ung thư vú của cao PE06
Bảng 3.9. Kết quả IC50 trên tế bào ung thư vú của cao PE67
PE67 Nồng độ
(µg/ml)
Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 65,05 65,89 66,38 65,77 ± 0,67 60 54,36 55,4 54,4 54,72 ± 0,59 50 40,34 45,15 45,99 43,83 ± 3,05 40 18,00 15,56 15,74 16,43 ± 1,36 30 6,77 2,18 7,06 5,34 ± 2,74 IC50 56,89 54,73 54,77 55,46 ± 1,24 PE06 Nồng độ (µg/ml)
Phần trăm ức chế tăng trưởng (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD 100 69,06 61,43 64,64 65,04 ± 3,83 50 64,31 57,97 67,91 63,40 ± 5,03 40 58,94 62,74 66,67 62,78 ± 3,86 30 52,29 53,32 59,48 55,03 ± 3,89 20 27,64 29,24 42,75 33,21 ± 8,30 IC50 29,07 28,62 24,33 27,34 ± 2,62
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị IC50 của 2 cao PE trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Nhận xét:
Giá trị IC50 càng nhỏ cho thấy hoạt tính gây độc tế bào ung thư càng cao. Kết quả cho thấy cao PE06 có hoạt tính gây độc tế bào cao hơn nhiều so với mẫu PE67. Theo chương trình tầm soát các hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất tự nhiên của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, những cao chiết có IC50 < 30 μg/ml có hoạt tính gây độc tế bào in vitro ở mức tốt, mức IC50 > 30 μg/ml thì khả năng gây độc tế bào thấp. Như vậy, giá trị IC50 của cao PE06 tại nồng độ 27,34 ± 2,62μg/ml chứng tỏ thành phần hoạt chất trong cao chiết PE06 đã có tác dụng lên tế bào ung thư vú MCF-7.
Đánh giá chung:
Dựa trên kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và xác định giá trị IC50 trên cao PE06 (có hàm lượng ergosterol cao nhất) và cao PE67 (có hàm lượng ergosterol thấp nhất), cho thấy phân đoạn cao PE có hoạt tính cao trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Cao PE là phân đoạn chứa các hợp chất có tính kém phân cực nhất có trong nguyên liệu, trong đó đại diện của nhóm kém phân cực trong nguyên liệu Cordyceps là nhóm sterol, mà điển hình là ergosterol, đang nghiên cứu.
Theo kết quả định lượng ergsoterol, mẫu cao PE06 có lượng ergosterol chiếm khoảng 40%, trong khi đó cao PE67 chỉ có khoảng 11%, kết quả hoạt tính
0 10 20 30 40 50 60 PE 06 PE 67 Gi á tr ị I C50 (µ g/m l ) Mẫu cao PE
gây độc tên tế bào cho thấy cao PE06 có hoạt tính cao hơn nhiều so với cao PE67, kết hợp với giá trịIC50 của cao PE06 ở mức thấp. Từ đó, chúng tôi nhận thấy có khả năng ergosterol là tác nhân gây độc trên tế bào. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Wu J.Y (2007) [21]. Và theo Huber (2003), trên bề mặt tế bào ung thư vú MCF- 7 có nhiều estrogen receptor, nội tiết tố estrogen có chức năng điều hòa quá trình phiên mã bằng cách gắn với estrogen receptor, nghiên cứu cho thấy khả năng liên kết với estrogen receptor của ergosterol lớn hơn so với estrogen là do chúng có cấu trúc giống nhau về sườn C.[10]
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Chúng tôi đã đạt được các nội dung nghiên cứu đề ra với các kết luận như sau: 1. Đã tiến hành định lượng ergosterol trong các mẫu cao PE của sinh khối 10 chủng nấm Cordyceps, từ đó chọn ra mẫu cao PE06 có hàm lượng ergosterol cao nhất để tiến hành nhận danh và tinh sạch chất ergosterol có trong cao.
2. Đã chọn được hệ dung môi thích hợp cho quá trình chạy cột sắc ký trong quá trình phân tách ergosterol trong cao PE06 là hệ PE : EtOAc (8:2)
3. Đã tinh sạch được chất mục tiêu trong cao PE; kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng và tiến hành giải cấu trúc hóa học bằng phổ 1H-NMR. Từ đó, đề nghị cấu trúc chất mục tiêu là ergosterol.
4. Đã khảo sát hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và xác định giá trị IC50 của cao PE06 và cao PE67 tương ứng là 27,34% và 55,46%.
4.2. Kiến nghị
1. Phân lập các nhóm chất như cordycepin; adenosine; acid cordycepic trong các mẫu cao
2. Tiến hành thử nghiệm thêm hoạt tính của cao PE06 trên các dòng ung thư khác.
3. Xác định các chất trong cao PE06, từ đó củng cố thêm vai trò của ergosterol trên các dòng tế bào ung thư.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] Nguyễn Đình Giậu (2000), Sinh lý học người và động vật, NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 64-71
[2] Đặng Văn Hòa và cộng sự (2006-2007), Kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu giảng dạy sinh viên dược 5, Bộ môn Hóa phân tích, kiểm nghiệm, Trường Đại Học Y Dược TPHCM, trang 30
[3] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 281-288.
[4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, trang 180-196, trang 244-249.
[5] Ca Thị Út (2012), Chiết xuất các phân đoạn và xác định các hoạt chất chính trong sinh khối nấm Cordyceps sp phân lập tại Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp cử nhân, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TPHCM.
Tiếng nước ngoài
[6] Bok J. W., Lermer L., Chilton Je., Klingeman Hans G., Neil G.H. Towers (1998), Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis,
Phytochemistry 51 (7), p.891-898.
[7] Dan Q.C. (2013), Cloud-Point extraction combined with liquid chromatography for the determination of ergosterol, a natural product with diuretic activity, in rat plasma, urine, and faeces, A Research Acticle Journal of Analytical Methods in Chemistry.
[8] Holliday J. C. (2005), On the trail of the yak: ancient Cordyceps in the Modern World, p.623-630.
[9] Holliday, John (2008), Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A Review, International Journal of Medicinal Mushrooms (New York: Begell House), 10 (3), p.219-234.
[10] Huber V.H(2003), Ergosterol (Major Sterol of Baker’s and Brewer’s Yeast Extracts) inhibits the growth of human breast cancer cells in vitro and the potential role of its oxidation products, International Journal for Vitamin and Nutrition Research, p.19-23
[11] Hsu T.H., Shiao L.H., Hsieh C., Chang D.M. (2002), A comparison of the chemical composition and bioactive ingredients of the Chinese medicinal mushroom DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis, Food Chemistry 78, p.463–469
[12] Fan H., Li S.P., Xiang J.J., Lai C.M., Yang F.Q., Gao J.L., Wang Y.T. (2006), Qualitative and quantitative determination of nucleosides, bases and their analogues in natural and cultured Cordyceps by pressurized liquid extraction and high performance liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC–ESI–MS/MS),Analytica Chimica Acta 567, p.218– 228.
[13] Li S.P., Yang F.Q., Tsim Karl W.K. (2006), Quality control of Cordyceps sinensis a valued traditional Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, p1571–1584 [19] Wu F., Yan H., Ma X., Jia J., Zhang G., Guo X. and Gui Z. (2010), Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris, Journal of Ethnopharmacology 96, p.555–561
[14] Masuda M., Urabe E., Honda H., Sakurai A., Sakakibara M. (2007), Enhanced production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom
Cordyceps militaris, Biochemical Engineering Journal, p.1199-1205.
[15] G.P.Moss(1989), Nomenclature of Steroids, Internaltional Union of Pure and Applied Chemistry, p.1791-1793.
[16] Oh J.Y., Cho E.J, Nam S.H., Choi J.W., Yun J.W., (2007), Production of polysaccharide–peptide complexes by submerged mycelial culture of an entomopathogenic fungus Cordyceps sphecocephala, Process Biochemistry
[17] Ohmori T., Tamura K., Furuki K., Kawanishi G., Mitsuyama M., Nomoto K. (1989), Isolation of galactosaminoglycan moity (CO-N) from protein-bound polysaccharide of Cordyceps ophioglossoides and its effects against murine tumor, Chemical & Pharmaceutical Bulletin 37, p.1019-1022.
[18] Toshiyuki T., Mitsuru Y. (2004), Ergosterol Peroxide, an Apoptosis-Inducing Component Isolated form Sarcodon aspratus (Ber.) S.Ito, Jewish Business Students Association, p.212-215.
[19] Wang F., Fang Y., Zhang M., Lin A., Zhu T., Gu Q., Zhu W. (2008), Six new ergosterols from the marine-derived fungus Rhizopus sp., Steroids, p.19-26. [20] Wu F., Yan H., Ma X., Jia J., Zhang G., Guo X. and Gui Z. (2010), Structural
characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris, Journal of Ethnopharmacology 96, p.555–561 [21] Wu J. Y., Zhang Q. X., Leung P. H. (2007), Inhibitory effects of ethyl acetate
extract of Cordyceps sinensis mycelium on various cancer cells in culture and B16 melanoma in C57BL/6 mice, Phytomedicine 14, p.43–49.
[22] Zhang Q., Wu J., Hua Z., Li D. (2004), Induction of HL-60 apoptosis by ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis fungal mycelium, Life Sciences 75,
p.2911–2919.
[23] Zhou X, Luo L, Dressel W, Shadier G, Krumbiegel D, Schmidtke P, Zepp F, Meyer CU (2008), Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient of
Cordyceps sinensis, The American Journal of Chinese Medicine, 36 (5), p.967- 80.