2.4.1. Quy trình nghiên cứu
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu tổng quát Định lượng Ergsoterol
trong cao PE của 5 sinh khối nấm
Chọn cao PE có hàm lượng ergosterol cao nhất và thấp nhất
Thử hoạt tính trên tế bào ung thư vú-MCF-7
Tiến hành chạy sắc ký cột cho cao PE có ergosterol cao nhất Nghiên cứu hệ dung môi tách hiệu quả trên sắc ký
bản mỏng Chạy hệ dung môi đã nghiên cứu trên cột sắc
ký hở
Tinh sạch ergosterol trong phân đoạn có
nhiều ergosterol Sử dụng phương pháp phổ NMR để xác định cấu trúc hóa học của
ergodterol tinh sạch So sánh sự tác dụng của
2.4.2. Phương pháp nhận danh, phân tách ergosterol 2.4.2.1. Xác định hệ dung môi tách chiết [4] 2.4.2.1. Xác định hệ dung môi tách chiết [4]
Thử nghiệm trên 4 hệ dung môi : PE : EtOAc (8:2) PE : aceton (9:1) n-hexan : aceton (8:2) n-hexan : EtOAc (8:2)
Tiến hành chấm sắc ký trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm 2x10 cm với 2 chất là ergosterol chuẩn và phân đoạn cao PE của mẫu DL0006. Quan sát dưới đèn UV 254nm và phun hiện màu với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, sấy ở nhiệt độ 1050C và quan sát dưới ánh sáng thường.
Rf là hệ số lưu giữ, là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Khai triển một lần đối với mỗi hệ dung môi trên bản mỏng, trên sắc đồ sắc ký lớp mỏng cho kết quả sau:
- Các vết có di chuyển, có tách nhau, không bị kéo thành vệt dài - Các vết cần tách có Rf khoảng 0,3-0,6.
- Các vết đúng là đối tượng cần nghiên cứu (kiểm tra bằng phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH).
a b
2.4.2.2. Sắc ký cột [4]
Sử dụng sắc ký cột hở, được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp silicagel che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi phân ly được đặt phía trên cao. Dung môi phân ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những chai thủy tinh đặt ngay ống dẫn ra khỏi cột. Hệ thống này kém hiệu quả so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, có thể triển khai với một lượng lớn chất mẫu.
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được ly giải khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.
2.4.2.3. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột [4]
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký. Tuy nhiên, với chất cần tách trong trường hợp này là ergosterol trong cao PE là chất dễ tách nên cần lượng chất hấp thu ít hơn.
Cân khoảng 150g silicagel hòa với dung môi PE và đổ từ từ vào cột, đáy cột lót một miếng bông nhỏ để silicagel khỏi chảy ra khỏi cột. Dùng ống bóp cao su gõ vào thành cột để tiến hành nén silicagel vào cột sắc ký. Tiến hành nén cho đến khi nào silicagel không nén chặt được nữa.
Một số lưu ý trong quá trình nạp chất hấp thu vào cột :
- Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và không quá lỏng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng ống bóp cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột ở dạng đồng nhất.
- Trong quá trình nạp cột, không được để đầu cột bị khô, luôn phải có dung môi ở trên đầu cột.
2.4.2.4. Đặt mẫu chất lên đầu cột sắc ký [4]
Khối lượng cao PE dạng sệt được trộn với sllicagel để đồng nhất mẫu, sau đó đặt lên bếp cách thủy để mẫu và silicagel trở thành dạng bột khô. Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi PE (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột) để thấm ướt bột silicagel và cho vào cột . Sau đó, cho một lớp silicagel dày khoảng 0,5 cm đổ nhẹ lên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình phân ly.
Hình 2.3. Thực hiện sự nạp cột sắc ký Rót dung dịch sệt
(silicagel và dung môi PE) vào đầu cột ngang
Thanh cao su hoặc ống bóp cao su khỏ nhẹ lên thành cột
Chất hấp thu đang lắng xuống đáy cột Dung môi PE chảy liên
2.4.2.5. Quy trình nạp mẫu và chất hấp thu (silicagel) vào cột sắc ký
Hình 2.4. Quy trình nạp mẫu và chất hấp thu (silicagel) vào cột sắc ký Mẫu trộn với silicagel
Silicagel hòa với dung môi PE
Cột sắc ký lót miếng bông ở đáy
Bóp cao su khỏ nhẹ Sấy thành dạng bột khô Cột sắc ký chứa silicagel đã đồng nhất Cột chứa mẫu và silicagel
Dung môi ban đầu
Dung môi ban đầu
Đổ một lớp silicagel dày 0,5 cm lên trên đầu cột
Bảng 2.1. Các thông số sau khi nạp mẫu vào cột sắc ký
Hình 2.5. Cột sắc ký sau khi chuẩn bị xong - Lượng silicagel cho vào cột ban đầu : 85g
- Đường kính cột : 3 cm
- Thông số chất hấp thu : Silicagel 250-400 mesh
2.4.2.6. Nạp dung môi vào cột sắc ký
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột. Dung môi để giải ly cho cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thử nghiệm bằng sắc ký bản mỏng, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn.
2.4.2.7. Phương pháp kết tinh và tinh sạch
Sau khi xác định phân đoạn chứa ergosterol, tiến hành thu phân đoạn, cô quay giảm áp và thu kết tinh, sau đó cho MeOH : CHCl3 (4:1) vào chất kết tinh và
Chai hứng dịch chảy ra a b c d Thông số Kí hiệu Độ dài (cm) Chiều cao cột sắc ký a 50 Chiều cao cột silicagel b 35 Chiều cao cột mẫu c 3 Chiều dày lớp silicagel d 0,5
để ở 0-50C, quá trình này tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần cho tới khi thu được chất kết tinh màu trắng.
2.4.2.8. Kiểm tra độ tinh khiết của ergosterol sau khi tinh sạch [4]
Sản phẩm ergosterol được xác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM, chạy với 3 hệ dung môi ( n-hexan : EtOAc (8:2), PE : EtOAC (7:3), n-hexan : aceton (8:2)), soi dưới đèn UV 254nm và hiện màu với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, sấy ở nhiệt độ 1050C, quan sát dưới ánh sáng thường. Giá trị Rf của chất chuẩn và chất tinh sạch phải giống nhau ở cả 3 hệ dung môi.
2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học [3] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Chất cần bắn phổ được hòa trong dung môi CDCl3 và bắn phổ 1H-NMR. Quá trình đo phổ được tiến hành tại Phòng phổ NMR, Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TPHCM
2.4.4. Xác định hàm lượng ergosterol trong cao PE 2.4.4.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại của ergosterol [2] 2.4.4.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại của ergosterol [2]
Đo phổ tử ngoại – khả kiến của mẫu chuẩn ở bước sóng 275 – 290 nm. Chọn bước sóng làm bước sóng đo độ hấp thu (OD) cho ergosterol để định lượng.
2.4.4.2. Dựng đường chuẩn
Cân chính xác 1 mg ergosterol chuẩn hòa vào MeOH và định mức chính xác 10 ml. Ta được dung dịch chuẩn trong MeOH với nồng độ chất chuẩn là 100 μg/ml. Từ dung dịch mẫu chuẩn ban đầu tiến hành khảo sát trên 7 ống nghiệm với nồng độ ergosterol chuẩn từ 10–50 μg/ml.
Quy trình xây dựng đường chuẩn.
Thứ tự ống 1 2 3 4 5 6 7
Dung dịch chuẩn 100 μg/ml (ml) 1 2 2,5 3 3,5 4 5 Hòa với MeOH định mức thành 10 ml
Nồng độ chuẩn (μg/ml) 10 20 25 30 35 40 50 Lắc đều, khảo sát bước sóng hấp thụ của ergosterol.
2.4.4.2. Xác định hàm lượng ergosterol trong mẫu
Dung dịch thử: Cân khoảng 100 - 200 mg mẫu cần phân tích, sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi, hòa trong MeOH, pha loãng mẫu sao cho mẫu có nồng độ từ 10 - 50 μg/ml. Đem đo OD tại bước sóng đã khảo sát ở chất chuẩn.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan 250 g ergosterol trong 10 ml MeOH được dung dịch chuẩn có nồng độ 25 g/ml.
Đo độ hấp thu các mẫu ở bước sóng hấp thu cực đại trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến.
Công thức tính hàm lượng ergosterol trong cao:
c c t C m d OD OD C% 104
Với m: khối lượng mẫu cao đem thử (g) OD t: độ hấp thu của mẫu thử. ODc: độ hấp thu của mẫu chuẩn. Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml).
d: độ pha loãng
2.4.5. Thử nghiệm hoạt tính của ergosterol trên tế bào ung thư
Từ kết quả định lượng ergosterol trong 10 mẫu cao PE của sinh khối nấm
Cordyceps, tiến hành chọn 2 cao PE có hàm lượng ergosterol cao nhất và thấp nhất để thử nghiệm hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư vú MCF-7.
2.4.5.1. Thử nghiệm SRB
Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB:
1. Giải đông nguồn tế bào ung thư bào quản trong nitơ lỏng nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4).
2. Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70-80%.
3. Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào/giếng ban đầu là 104
tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa và MCF-7) và 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào NCI-H460) theo thiết kế (*)
4. Ủ ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
5. Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử ( chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có trong giếng). 6. Ủ ở 37oC, 5% CO2, 48 giờ . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Cố định tế bào trong giếng với trichloroacetic acid (TCA) : 8. Nhuộm SRB:
- Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng - Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút
- Loại bỏ dung dịch SRB
- Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ. 9. Đọc kết quả:
- Cho 200µl Tris-base 10mM vào mỗi giếng.
- Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm.
Đối với những dòng tế bào lo lửng: sử dụng dung dịch TCA 80% lạnh vào mỗi giếng, việc cố định tế bào vào giếng tiến hành như sau:
- Đặt đĩa trên vào tủ lạnh (4oC), 1-3 giờ - Loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng.
- Rửa nhẹ nhàng với nước (200µl/giếng) 5 lần. - Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ. (*) Thiết kế khảo sát gồm:
- 1 mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01µg/ml. - 1 mẫu chứng âm: tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%).
- Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc. Trong trường hợp xác định IC50 thì mẫu thử nghiệm sẽ pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:
+ 2 giếng tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát. + 2 giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (2 giếng blank)
2.4.5.2. Xử lý kết quả
Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm (ký hiệu OD492 và OD620):
Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1)
Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtế bào - ODblank (2) Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức :
Với:
- ODtế bào: giá trị OD của giếng có chứ tế bào - ODblank: giá trị OD của giếng blank
- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)
- ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)
2.4.5.3. Xác định IC50
Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỉ lệ gây độc tế bào 50% bằng cách:
+ Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm co tỉ lệ gây độc gần 50% nhất (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỉ lệ gây độc tế bào lớn hơn 50%).
+ Từ phương trình trên ( có dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, ta suy ra được giá trị nồng độ x chính là IC50
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả định lượng ergosterol
Xác định hàm lượng ergosterol trong 10 mẫu cao PE chiết xuất từ sinh khối nấm Cordyceps. Tiến hành phương pháp định lương ergosterol theo mục 2.4.4.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1. Khảo sát độ hấp thu cực đại của ergosterol chuẩn trong MeOH
Đo phổ tử ngoại khả kiến của chất chuẩn ergosterol ở bước sóng từ 275 – 290. Kết quả được biểu thị trong hình 3.1
Hình 3.1. Độ hấp thu cực đại của ergosterol chuẩn trong MeOH
Nhận xét: Đỉnh hấp thu cực đại của ergosterol chuẩn trong MeOH trên máy quang phổ tử ngoại khả tại bước sóng 282 nm.
3.1.2. Kết quả dựng đường chuẩn esgosterol
Tiến hành thực hiện như mục 2.4.4.2. Kết quả thu được biểu diễn trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả OD của ergosterol chuẩn ở bước sóng 282 nm
Ống 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ
ergosterol (µg/ml) 10 20 25 30 35 40 50 OD 0,153 0,269 0,33 0,418 0,502 0,56 0,725
Hình 3.2. Đường biểu diễn tuyến tính của ergosterol chuẩn ở nồng độ 10-50 g/ml Nhận xét:
Có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu ở bước sóng 282 nm của chất chuẩn ergosterol theo phương trình y = 0,014x - 0,006 , R2 = 0,996 trong khoảng nồng độ 10 đến 50 g/ml.
Tiến hành đo OD các mẫu tại bước sóng 282nm, mỗi mẫu đo OD lặp lại 3 lần, giá trị OD của ergosterol chuẩn là 0,33
y = 0.0144x - 0.0053 R² = 0.9967 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 10 20 30 40 50 60 OD µg/ml
Mẫu Khối lượng (g) Độ pha loãng Giá trị OD282 OD trung bình Nồng độ (µg/ml) Hàm lượng ergosterol trung bình trong cao PE (%) SD RSD (%) DL0006 0,1112 2500 1 0,236 0,236 17,214 40,195 0,261 0,649 2 0,235 3 0,238 DL0038A 0,0803 600 1 0,297 0,294 21,357 16,642 0,199 1,195 2 0,290 3 0,294 DL0050 0,0650 500 1 0,266 0,267 19,428 15,559 0,067 0,431 2 0,268 3 0,266 DL0075 0,0525 500 1 0,277 0,277 20,143 19,985 0,144 0,721 2 0,275 3 0,279 DL0077 0,1215 500 1 0,488 0,489 35,286 15,245 0,017 0,111 2 0,489
Mẫu Khối lượng (g)
Độ pha
loãng Giá trị OD282
OD trung bình Nồng độ (µg/ml) Hàm lượng ergosterol trung bình trong cao PE (%) SD RSD