2.4.2.1. Xác định hệ dung môi tách chiết [4]
Thử nghiệm trên 4 hệ dung môi : PE : EtOAc (8:2) PE : aceton (9:1) n-hexan : aceton (8:2) n-hexan : EtOAc (8:2)
Tiến hành chấm sắc ký trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm 2x10 cm với 2 chất là ergosterol chuẩn và phân đoạn cao PE của mẫu DL0006. Quan sát dưới đèn UV 254nm và phun hiện màu với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, sấy ở nhiệt độ 1050C và quan sát dưới ánh sáng thường.
Rf là hệ số lưu giữ, là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Khai triển một lần đối với mỗi hệ dung môi trên bản mỏng, trên sắc đồ sắc ký lớp mỏng cho kết quả sau:
- Các vết có di chuyển, có tách nhau, không bị kéo thành vệt dài - Các vết cần tách có Rf khoảng 0,3-0,6.
- Các vết đúng là đối tượng cần nghiên cứu (kiểm tra bằng phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH).
a b
2.4.2.2. Sắc ký cột [4]
Sử dụng sắc ký cột hở, được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp silicagel che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi phân ly được đặt phía trên cao. Dung môi phân ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những chai thủy tinh đặt ngay ống dẫn ra khỏi cột. Hệ thống này kém hiệu quả so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, có thể triển khai với một lượng lớn chất mẫu.
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được ly giải khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.