Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A H5N1 phân lập tại Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNCÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ BÍCH NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỊT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ng-êi BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NĂM 2012 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu thực số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa công bố công trình khác Ngày tháng năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Bích Nga v MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu , chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình i ii iii vi vii viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÖM 1.1.1 Virus cúm phân loại virus cúm 1.1.2 Đặc điểm tiến hóa tạo nên phân dòng có độc lực cao virus cúm A/H5N1 1.1.3 Sự hình thành genotype virus cúm A/H5N1 giới Việt Nam 1.1.4 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) virus cúm A/H5N1 1.2 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VIRUS CÚM A 1.2.1 Đặc tính cấu trúc chung 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 1.2.3 Chức phân đoạn hệ gen 1.3 CẤU TRÖC, CHỨC NĂNG CỦA HEMAGGLUTININ VÀ NEURAMINIDASE 1.3.1 1.3.2 1.4 1.5 1.5.1 Protein hemagglutinin (HA) Protein neuraminidase (NA) CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC CÁC PHƢƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN Hiện tƣợng «lệch kháng nguyên» 1.5.2 Hiện tƣợng «trộn kháng nguyên» 1.5.3 Hiện tƣợng glycosyl hoá 1.6 BỆNH CÖM GIA CẦM 1.6.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.6.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 giới 1.6.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 Việt Nam 1.6.4 Đặc điểm bệnh cúm gia cầm 1.6.4.1 Triệu chứng - bệnh tích cúm gia cầm 4 11 11 13 14 15 15 19 21 22 22 24 24 25 25 27 28 28 28 v 1.6.4.2 Triệu chứng bệnh cúm gia cầm người 1.6.5 Tính thích ứng đa vật chủ virus cúm A/H5N1 1.6.6 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào 29 29 31 1.6.7 Phƣơng thức lây truyền virus cúm gia cầm 1.6.8 Sức đề kháng virus 32 33 1.7 1.8 CÁC LOẠI VACXIN PHÕNG BỆNH CHO GIA CẦM MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VIRUS CÖM GIA CẦM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 36 39 2.1 2.2 ĐỐI TƢỢNG 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 VẬT LIỆU 2.5 QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ NGHIÊN CỨU GEN VIRUS CÚM A/H5N1 40 Phƣơng pháp tách chiết ARN tổng số 41 Phƣơng pháp RT-PCR Phƣơng pháp điện di kiểm tra tinh sản phẩm RT-PCR 42 42 43 43 44 45 45 45 47 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.4 2.8 2.9 2.9.1 2.9.2 2.9.3 2.9.4 2.9.5 2.9.6 NỘI DUNG DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU Dụng cụ, trang thiết bị Hóa chất PHƢƠNG PHÁP DÕNG HÓA Nối sản phẩm RT-PCR/PCR vào vector tách dòng Chuyển nạp sản phẩm dòng hóa vào tế bào khả biến Chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc tách chiết ADN tái tổ hợp Kiểm tra ADN tái tổ hợp PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Xử lý chuỗi chƣơng trình Chromas Chƣơng trình biên tập chuỗi nucleotide SeqEd Hệ chƣơng trình MacVector Chƣơng trình so sánh phân tích chuỗi gen GeneDoc Chƣơng trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA) Xử lý số liệu nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 THU NHẬN VÀ LƢU GIỮ GEN H5 CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 39 39 39 40 40 40 41 47 48 48 48 49 49 50 50 v TRONG VECTOR TÁCH DÒNG 3.1.1 Tách ARN tổng số thực RT-PCR 3.1.2 Dòng hoá sản phẩm lƣu gen H5 vector tách dòng 3.1.3 Giải trình tự phân tích thành phần amino acid HA (H5) so sánh thành phần nucleotide amino acid với chuỗi đăng ký Ngân hàng gen 3.1.4 Phân tích vị trí điểm cắt protease, bám dính thụ thể, epitope glycosyl hoá polypeptide H5 sở trình tự amino acid suy diễn 3.1.5 Phân tích tƣơng đồng nucleotide amino acid H5 3.1.6 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc chủng Việt Nam giới XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN NHÁNH NHÓM KHÁNG NGUYÊN (CLADE) 3.2 50 52 54 65 67 69 73 XUẤT HIỆN MỚI TẠI VIỆT NAM 3.2.1 3.2.2 3.3 Kết hình thành phân nhóm kháng nguyên 1.1 clade Kết hình thành phân nhóm kháng nguyên clade 2.3.2 2.3.4 74 76 THU NHẬN, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ LƢU GIỮ GEN N1 CÁC CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRONG VECTOR TÁCH DÒNG 79 3.3.1 Thực RT-PCR thu nhận gen N1 79 3.3.2 Dòng hoá sản phẩm gen N1 vector tách dòng 3.3.3 Phân tích thành phần nucleotide amino acid gen N1 3.3.3.1 Phân tích thành phần nucleotide gen N1 3.3.3.2 Phân tích thành phần amino aicd gen N1 3.3.4 Phân tích đột biến trƣợt-xoá gen N1 qua thời gian tiến hoá 3.3.5 Phân tích mối quan hệ phả hệ gen N1 chủng virus cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2011 81 83 83 85 89 92 KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ PHỤ LỤC 98 99 100 114 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu bp Ck Tiếng Anh base pair Chicken Tiếng Việt Cặp bazơ Gà dNTP ddNTP Dk Deoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate Duck Deoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate Vịt DNA FAO Acid deoxyribonucleic Food and Agricultural Organization Axit deoxyribonucleic Tổ chức nông lương giới Gs Goose Ngỗng HA HI HPAI kb kDa Hemagglutinin Hemagglutination Inhibition Highly Pathogenic Avian Influenza Kilo base Kilodalton Kháng nguyên HA Phản ứng ngưng kết hồng cầu Cúm gia cầm thể độc lực cao Kilo base Đơn vị khối lượng kilodalton LB LPAI M Luria-Bertani medium Low Pathogenic Avian Influenza Matrix protein Môi trường LB Cúm gia cầm thể độc lực thấp Protein đệm M Md Muscovy duck Ngan MEGA NA NEP NP NS OIE PA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Neuraminidase Nuclear Export Protein Nucleoprotein Non-structural protein Office International des Epizooties Polymerase acidic protein Phân tích di truyền tiến hoá phân tử Kháng nguyên NA Nuclear Export Protein Nucleoprotein Protein không cấu trúc Tổ chức dịch tễ giới Protein PA PB1 PB2 RNA RNP RT-PCR Polymerase basic protein Polymerase basic protein Ribonucleic acid Ribonucleoprotein Revertranscription Polymerase Chain Reaction Specific Pathogen Free World Health Organization Protein PB1 Protein PB2 Axit ribonucleic Ribonucleoprotein Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR ngược Không tác nhân mầm bệnh Tổ chức Y thế giới SPF WHO vi ix DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm chết cúm gia cầm qua năm 26 Bảng 2.1 Danh sách chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn 2004 – 2011 39 Bảng 2.2 Danh sách cặp mồi sử dụng thu nhận gen kháng 42 nguyên H5 N1 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR chu trình nhiệt 42 Bảng 2.4 Danh sách cặp mồi sử dụng giải trình tự gen kháng nguyên H5 N1 47 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt giải trình tự 47 Bảng 3.1 Danh sách chủng virus cúm A/H5N1 Việt Nam giới sử dụng chuỗi H5 phân tích so sánh thành phần gen mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 54 Bảng 3.2 Các vị trí nucleotide sai khác chuỗi H5 chủng so sánh 56 Bảng 3.3 Kết tổng hợp phát 41 vị trí sai khác amino acid chuỗi H5 so sánh 32 chủng phân lập Việt Nam từ năm 2004 - 2011 64 Bảng 3.4 Các vị trí amino acid quan trọng chuỗi polypeptide H5 65 Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) tương đồng nuleotide (trên đường chéo) amino acid (dưới đường chéo) gen H5 68 Bảng 3.6 Kết thống kê 14 chủng virus cúm AH5N1 xác định gen H5 nhóm kháng nguyên giai đoạn 2004 – 2011 nghiên cứu 78 Bảng 3.7 Danh sách chủng cúm A/H5N1 thu thập qua năm 2004- 83 2011 giải trình tự cung cấp chuỗi gen N1 sử dụng để so sánh nucleotide amino acid Bảng 3.8 Kết thống kê 14 chủng virus cúm A/H5N1 giai đoạn 20042011 giải trình tự đăng ký gen N1 97 data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÖM 1.1.1 Virus cúm phân loại virus cúm 1.1.2 Đặc điểm tiến h a tạo nên phân dòng có độc lực cao virus cúm A/ H 5N1 1.1.3 Sự hình thành genotype virus cúm A/ H 5N1. .. read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data... !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't