Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MẠNH KIÊN NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 ĐƢƠNG NHIỄM TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC Mã số : 62 72 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HÒA PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án mình, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy (Cô): - PGS.TS Lê Thanh Hòa – Viện Cơng nghệ sinh học, - PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận án - Thầy Chủ tịch Hội đồng Thầy (Cô) Hội đồng chấm luận án, nhà khoa học nƣớc, có nhiều ý kiến q báu, giúp tơi hồn thiện luận án Trong q trình thực đề tài nghiên cứu hồn thành luận án mình, tơi nhận đƣợc giúp đỡ q báu Nhà trƣờng, đơn vị cơng tác, tập thể, nhà khoa học, gia đình bè bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y 7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu trƣờng - Thầy, cô anh, chị Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, Trung tâm Gen Protein – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học, tạo điều kiện giúp đỡ bảo tơi suốt q trình thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận án - Cơ quan thú y vùng nƣớc hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh phẩm thông tin dịch bệnh giúp thực đề tài nghiên cứu - Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 Việt Nam Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đốn vắc-xin phòng chống”, khn khổ Nhiệm vụ “Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, giúp đỡ hỗ trợ tơi kinh phí thực đề tài nghiên cứu - Cuối cùng, tơi xin đƣợc cảm ơn gia đình ngƣời thân, hỗ trợ động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày …tháng năm 2014 NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Mạnh Kiên LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan số liệu luận án phần số liệu đề tài nghiên cứu Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 Việt Nam Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán vắc - xin phòng chống” Phần kết đề tài luận án thành nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên Tơi đƣợc đồng ý Chủ nhiệm đề tài tồn thành viên nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu vào luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ - Các số liệu kết trình bày luận án hoàn toàn trung thực Một phần số liệu kết nghiên cứu luận án đƣợc cơng bố Tạp chí khoa học chun ngành, với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014 TÁC GIẢ Nguyễn Mạnh Kiên i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục hình sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 1.1.1 Cấu tạo chung virus cúm A 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen virus cúm A 1.1.3 Cấu tạo chức phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 1.1.4 Đặc điểm cấu tạo chức gen PB2, PB1 PA 1.1.5 Phức hợp enzym polymerase virus cúm A 1.1.6 Đặc tính biến đổi di truyền gen hệ gen virus cúm A 1.2 ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƢỜI 1.2.1 Các đại dịch cúm A ngƣời lịch sử 1.2.2 Đặc điểm biến đổi gen PB2, PB1 PA virus cúm A gây đại dịch cúm ngƣời ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 1.3.1 Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 1.3.2 Đặc điểm sinh học virus cúm A/H5N1 1.4 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƢỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Tại Việt Nam Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 2.1.3 Các kit sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 2.1.4 Mơi trƣờng sử dụng dòng hóa 2.1.5 Các hóa chất sử dụng điện di gel agarose i iv v vii 3 12 14 16 16 17 22 22 26 28 28 30 33 33 33 35 36 36 36 ii 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 2.2.2 Thiết kế trình tự mồi nucleotide sử dụng nghiên cứu 2.2.3 Kỹ thuật RT-PCR 2.2.4 Tinh DNA sản phẩm PCR 2.2.5 Kỹ thuật điện di nucleic acid gel agarose 2.2.6 Kỹ thuật dòng hóa DNA 2.2.7 Giải trình tự DNA 2.2.8 Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide amino acid gen nghiên cứu 2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số chuyển đổi cDNA hệ gen virus 3.1.2 Kết PCR thu nhận dòng hóa DNA gen PB2, PB1 PA 3.1.3 Kết giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA 3.2 KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI 3.2.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB2 3.2.1.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB2 3.2.1.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PB2 3.2.2 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.3 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1-F2 3.2.2.4 Kết xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 3.2.3 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PA 3.2.3.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PA 3.2.3.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PA 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 3.3.1 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 3.3.2 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 3.3.3 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 37 38 38 41 44 45 45 48 50 52 53 53 53 54 60 61 61 61 65 67 67 69 69 73 73 73 77 79 79 82 85 iii Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 4.1.1 Về kết thu nhận gen PB2, PB1 PA 4.1.2 Về qui trình nghiên cứu thu nhận gen PB2, PB1 PA 4.2 VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.2.1 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB2 4.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB1 4.2.2.1 Về kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB1-F2 4.2.2.3 Về kết xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 4.2.3 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PA 4.3 VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.3.1 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 4.3.2 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 4.3.3 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 4.4 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.3.1 Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học dịch tễ học lây truyền sang ngƣời virus cúm A/H5N1 4.3.2 Về nguồn gốc tổ hợp gen PB2, PB1 PA polymerase KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 88 88 88 88 89 89 93 93 94 96 97 99 99 102 103 105 105 108 114 116 iv DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết tắt/ Ký hiệu Tên đầy đủ bp base pair Da dalton DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate FAO Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin kb kilobase M Matrix protein MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis NA Neuraminidase NEP Nuclear Export Protein NP Nucleoprotein NS Non-structural protein OIE Office International des Epizooties PA Polymerase acidic protein PB1 Polymerase basic protein PB2 Polymerase basic protein RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein (-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid WHO cs World Health Organization Cộng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo phân đoạn RNA hệ gen chức protein virus cúm A Tóm tắt lịch sử đại dịch dịch cúm A ngƣời Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA, virus cúm A gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 virus cúm A ngƣời Số ngƣời nhiễm tử vong virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA, liên quan đến độc lực thích nghi lây truyền virus cúm A/H5N1 ngƣời Danh sách biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng nghiên cứu Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng so sánh đặc tính di truyền gen PB2, PB1 PA Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng phả hệ nguồn gốc gen PB2, PB1 PA Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận giải trình tự gen PB2, PB1 PA virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Thành phần qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm A/H5N1 từ RNA tổng số nghiên cứu kỹ thuật biế /H5N1 nghiên cứu Chu t kỹ thuật biế /H5N1 nghiên cứu kỹ thuật PCR thu nhận DNA gen PB2, PB1 PA từ cDNA hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Chu kỹ thuật PCR thu nhận DNA gen PB2, PB1 PA từ cDNA hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid pCR®2.1-TOPO® Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp E.coRI Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Chu trình nhiệt kỹ thuật PCR giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 3.1 Trang 17 19 23 29 33 34 35 39 42 43 43 44 44 47 48 49 50 63 vi Bảng Tên bảng 3.2 Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi amino acid protein PB1 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PB1 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PB1-F2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí thay đổi amino acid trình tự gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA polymerase, liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền virus cúm A/H5N1 ngƣời Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype gen PB2, PB1 PA polymerase, hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.1 4.2 Trang 64 66 68 70 71 75 76 78 106 109 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình/ Sơ đồ Tên hình, sơ đồ 1.1 1.2 1.3 Mơ hình ảnh chụp tiểu phần virus cúm A Mơ hình cấu trúc hệ gen virus cúm A Sơ đồ sếp trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu ORF vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A Mơ hình phân bố vùng chức protein PA Mơ hình cấu trúc 3D vị trí phức hợp polymerase cấu trúc phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền phân đoạn hệ gen virus cúm A Sơ đồ hình thành virus cúm A gây đại dịch cúm ngƣời ự hình thành lƣu hành xâm nhiễm gây bệnh ngƣời củ /H5N1 châu Á từ 2003 – 2011 Sơ đồ ổ hợp hình thành genotype Z, G V củ /H5N1 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu gen PB2, PB1 PA polymerase virus cúm A/H5N1 Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực kỹ thuật PCR giải trình tự gen PB2, PB1 PA virus cúm A/H5N1 Sơ đồ nguyên lí kỹ thuật PCR Sơ đồ cấu trúc vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen) Kết điện di kiểm tra DNA phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Kết điện di kiểm tra DNA gen PB2 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra DNA gen PB1 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra DNA gen PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt enzym EcoRI Trang 12 12 13 15 21 23 24 26 37 41 41 47 53 54 55 56 57 ... h a DNA gen PB2, PB1 PA 3.1.3 Kết giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA 3.2 KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA C A SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/ H5N1 NGHIÊN CỨU... ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA C A VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƢỜI 1.2.1 Các đại dịch cúm A ngƣời lịch sử 1.2.2 Đặc điểm biến đổi gen PB2, PB1 PA virus cúm A gây đại dịch cúm ngƣời... LUẬN 4.1 VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA C A SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/ H5N1 NGHIÊN CỨU 4.1.1 Về kết thu nhận gen PB2, PB1 PA 4.1.2 Về qui trình nghiên cứu thu nhận gen PB2, PB1 PA