BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MẠNH KIÊN NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 ĐƢƠNG NHIỄM TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC Mã số : 62 72 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HÒA PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án mình, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy (Cô): - PGS.TS Lê Thanh Hịa – Viện Cơng nghệ sinh học, - PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận án - Thầy Chủ tịch Hội đồng Thầy (Cô) Hội đồng chấm luận án, nhà khoa học nƣớc, có nhiều ý kiến q báu, giúp tơi hồn thiện luận án Trong q trình thực đề tài nghiên cứu hồn thành luận án mình, tơi nhận đƣợc giúp đỡ q báu Nhà trƣờng, đơn vị cơng tác, tập thể, nhà khoa học, gia đình bè bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y 7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu trƣờng - Thầy, cô anh, chị Bộ môn Hóa sinh, Phịng Quản lý đào tạo Sau đại học, Trung tâm Gen Protein – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Phịng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học, tạo điều kiện giúp đỡ bảo tơi suốt q trình thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận án - Cơ quan thú y vùng nƣớc hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh phẩm thông tin dịch bệnh giúp thực đề tài nghiên cứu - Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 Việt Nam Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đốn vắc-xin phịng chống”, khn khổ Nhiệm vụ “Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, giúp đỡ hỗ trợ tơi kinh phí thực đề tài nghiên cứu - Cuối cùng, tơi xin đƣợc cảm ơn gia đình ngƣời thân, hỗ trợ động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày …tháng năm 2014 NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Mạnh Kiên LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan số liệu luận án phần số liệu đề tài nghiên cứu Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 Việt Nam Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán vắc - xin phòng chống” Phần kết đề tài luận án thành nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên Tơi đƣợc đồng ý Chủ nhiệm đề tài tồn thành viên nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu vào luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ - Các số liệu kết trình bày luận án hoàn toàn trung thực Một phần số liệu kết nghiên cứu luận án đƣợc cơng bố Tạp chí khoa học chun ngành, với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014 TÁC GIẢ Nguyễn Mạnh Kiên i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục hình sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 1.1.1 Cấu tạo chung virus cúm A 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen virus cúm A 1.1.3 Cấu tạo chức phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 1.1.4 Đặc điểm cấu tạo chức gen PB2, PB1 PA 1.1.5 Phức hợp enzym polymerase virus cúm A 1.1.6 Đặc tính biến đổi di truyền gen hệ gen virus cúm A 1.2 ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƢỜI 1.2.1 Các đại dịch cúm A ngƣời lịch sử 1.2.2 Đặc điểm biến đổi gen PB2, PB1 PA virus cúm A gây đại dịch cúm ngƣời ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 1.3.1 Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 1.3.2 Đặc điểm sinh học virus cúm A/H5N1 1.4 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƢỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Tại Việt Nam Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 2.1.3 Các kit sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 2.1.4 Mơi trƣờng sử dụng dịng hóa 2.1.5 Các hóa chất sử dụng điện di gel agarose i iv v vii 3 12 14 16 16 17 22 22 26 28 28 30 33 33 33 35 36 36 36 ii 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 2.2.2 Thiết kế trình tự mồi nucleotide sử dụng nghiên cứu 2.2.3 Kỹ thuật RT-PCR 2.2.4 Tinh DNA sản phẩm PCR 2.2.5 Kỹ thuật điện di nucleic acid gel agarose 2.2.6 Kỹ thuật dịng hóa DNA 2.2.7 Giải trình tự DNA 2.2.8 Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide amino acid gen nghiên cứu 2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số chuyển đổi cDNA hệ gen virus 3.1.2 Kết PCR thu nhận dịng hóa DNA gen PB2, PB1 PA 3.1.3 Kết giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA 3.2 KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI 3.2.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB2 3.2.1.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB2 3.2.1.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PB2 3.2.2 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PB1 3.2.2.3 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1-F2 3.2.2.4 Kết xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 3.2.3 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PA 3.2.3.1 Kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PA 3.2.3.2 Kết so sánh tỉ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid gen PA 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 3.3.1 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 3.3.2 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 3.3.3 Kết phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 37 38 38 41 44 45 45 48 50 52 53 53 53 54 60 61 61 61 65 67 67 69 69 73 73 73 77 79 79 82 85 iii Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 4.1.1 Về kết thu nhận gen PB2, PB1 PA 4.1.2 Về qui trình nghiên cứu thu nhận gen PB2, PB1 PA 4.2 VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.2.1 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB2 4.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB1 4.2.2.1 Về kết so sánh thành phần nucleotide amino acid gen PB1 4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PB1-F2 4.2.2.3 Về kết xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 4.2.3 Về biến đổi thành phần nucleotide amino acid gen PA 4.3 VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.3.1 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 4.3.2 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 4.3.3 Về kết xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 4.4 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 4.3.1 Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học dịch tễ học lây truyền sang ngƣời virus cúm A/H5N1 4.3.2 Về nguồn gốc tổ hợp gen PB2, PB1 PA polymerase KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 88 88 88 88 89 89 93 93 94 96 97 99 99 102 103 105 105 108 114 116 iv DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết tắt/ Ký hiệu Tên đầy đủ bp base pair Da dalton DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate FAO Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin kb kilobase M Matrix protein MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis NA Neuraminidase NEP Nuclear Export Protein NP Nucleoprotein NS Non-structural protein OIE Office International des Epizooties PA Polymerase acidic protein PB1 Polymerase basic protein PB2 Polymerase basic protein RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein (-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid WHO cs World Health Organization Cộng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo phân đoạn RNA hệ gen chức protein virus cúm A Tóm tắt lịch sử đại dịch dịch cúm A ngƣời Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA, virus cúm A gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 virus cúm A ngƣời Số ngƣời nhiễm tử vong virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA, liên quan đến độc lực thích nghi lây truyền virus cúm A/H5N1 ngƣời Danh sách biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng nghiên cứu Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng so sánh đặc tính di truyền gen PB2, PB1 PA Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng phả hệ nguồn gốc gen PB2, PB1 PA Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận giải trình tự gen PB2, PB1 PA virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Thành phần qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm A/H5N1 từ RNA tổng số nghiên cứu kỹ thuật biế /H5N1 nghiên cứu Chu t kỹ thuật biế /H5N1 nghiên cứu kỹ thuật PCR thu nhận DNA gen PB2, PB1 PA từ cDNA hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Chu kỹ thuật PCR thu nhận DNA gen PB2, PB1 PA từ cDNA hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid pCR®2.1-TOPO® Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp E.coRI Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Chu trình nhiệt kỹ thuật PCR giải trình tự DNA gen PB2, PB1 PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 3.1 Trang 17 19 23 29 33 34 35 39 42 43 43 44 44 47 48 49 50 63 vi Bảng Tên bảng 3.2 Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PB2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi amino acid protein PB1 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PB1 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PB1-F2 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trình tự gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí thay đổi amino acid trình tự gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc so sánh Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide amino acid gen PA 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh Các vị trí thay đổi amino acid protein PB2, PB1 PA polymerase, liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền virus cúm A/H5N1 ngƣời Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype gen PB2, PB1 PA polymerase, hệ gen biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.1 4.2 Trang 64 66 68 70 71 75 76 78 106 109 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình/ Sơ đồ Tên hình, sơ đồ 1.1 1.2 1.3 Mơ hình ảnh chụp tiểu phần virus cúm A Mơ hình cấu trúc hệ gen virus cúm A Sơ đồ sếp trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu ORF vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A Mơ hình phân bố vùng chức protein PA Mơ hình cấu trúc 3D vị trí phức hợp polymerase cấu trúc phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A Cơ chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền phân đoạn hệ gen virus cúm A Sơ đồ hình thành virus cúm A gây đại dịch cúm ngƣời ự hình thành lƣu hành xâm nhiễm gây bệnh ngƣời củ /H5N1 châu Á từ 2003 – 2011 Sơ đồ ổ hợp hình thành genotype Z, G V củ /H5N1 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu gen PB2, PB1 PA polymerase virus cúm A/H5N1 Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực kỹ thuật PCR giải trình tự gen PB2, PB1 PA virus cúm A/H5N1 Sơ đồ nguyên lí kỹ thuật PCR Sơ đồ cấu trúc vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen) Kết điện di kiểm tra DNA phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu Kết điện di kiểm tra DNA gen PB2 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra DNA gen PB1 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra DNA gen PA biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR Kết điện di kiểm tra mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt enzym EcoRI Trang 12 12 13 15 21 23 24 26 37 41 41 47 53 54 55 56 57 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hịa (2008), “Đặc điểm gen H5 virus cúm A/H5N1 thuộc dƣới dòng Phúc Kiến (Fujian) gây bệnh gia cầm ngƣời phân lập Việt Nam năm 2007”, Tạp chí Y – Dƣợc học quân sự, 33(8), tr 29-36 Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn Thị Bích Nga, Đồn Thanh Hƣơng, Đặng Thị Ngọc Dung, Lê Thanh Hòa (2011), “Đặc điểm cấu trúc phân tử gen polymerase PB1 chủng DkNA72 DkNA114 thuộc phân dòng Phúc Kiến virus cúm A/H5N1 phân lập Việt Nam”, Tạp chí Y – Dƣợc học quân sự, 36(1), tr 36-41 Nguyễn Mạnh Kiên, Đặng Thị Ngọc Dung, Lê Thanh Hòa (2012), “Đặc điểm phân tử tổ hợp gen polymerase liên quan bệnh học virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 phân lập từ vịt bệnh Quảng Trị năm 2011”, Tạp chí Y học Việt Nam, 396(1), tr 50-56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Murphy BR and Webster RG (1996), Orthomyxoviruses In “Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M.” (eds.) Fields Virology (3rd ed.), pp 1397-1445 Nicholson KG, Wood JM and Zambon M (2003), “Influenza”, Lancet, 362, pp 1733-1745 Lee CW and Saif YM (2009), “Avian influenza virus”, Comp Immun Microbiol Infect Dis, 32, pp 301–310 Cox NJ and Subbarao K (2000), “Global epidemilogy of influenza: Past and Present”, Annu Rev Med, 51, pp 407–421 Lê Thanh Hịa, Trƣơng Nam Hải, Nơng Văn Hải, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Quyền Đình Thi, Lê Trần Bình (2009), “Nguồn gen chế tiến hóa phân tử virus cúm A/H1N1-2009 gây đại dịch ngƣời nay”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(2), tr 133-153 Alexander DJ (2007), “An overview of the epidemiology of avian influenza” Vaccine, 25, pp 5637–5644 Hilleman MR (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control”, Vaccine, 20 (25-26), pp 3068-3087 Lê Thanh Hòa (2006), Y-sinh học phân tử Nhà xuất Y học, tập 1, 240 trang Chen W, Calvo PA, Malide D, Gibbs J, Schubert U, Bacik I, Basta S, O'Neill R, Schickli J, Palese P, Henklein P, Bennink JR, Yewdell J (2001), “A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death”, Nature Medicine, 7, pp 1306-1312 10 Parrish CR and Kawaoka Y (2005), “The origins of new pandemic viruses: The acquisition of new host ranges by canine parvovirus and influenza A viruses”, Annu Rev Microbiol, 59, pp 553-586 11 Wise HM, Foeglein A, Sun J, Dalton RM, Patel S, Howard W, Anderson EC, Barclay WS and Digard P (2009), “A complicated message: Identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment mRNA”, J Virol, 83(16), pp 8021–8031 12 Peiris JSM, de Jong MD and Guan Y (2007), “Avian influenza virus (H5N1): A threat to human health, Clinical Microbiology, Reviews”, American Society for Microbiology, 20(2), pp 243–267 13 Gabriel G, Dauber B, Wolff T, Planz O, Klenk HD, Stech J (2005), “The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host”, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 18590-18595 14 He X, Zhou J, Bartlam M, Zhang R, Ma J, Lou Z, Li X, Li J, Joachimiak A, Zeng Z, Ge R, Rao Z and Liu Y (2008), “Crystal structure of the polymerase PAC–PB1N complex from an avian influenza H5N1 virus”, Nature, 454, pp 1123 – 1126 15 Reuther P, Mänz B, Brunotte L, Schwemmle M, Wunderlich K (2011), “Targeting of the influenza A virus polymerase PB1-PB2 interface indicates strain-specific assembly differences”, J Virol, 85(24), pp 13298-309 16 Gabriel G, Herwig A, Klenk HD (2008), “Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin alpha is a determinant of host range of influenza A virus”, PLoS Pathog, 4(2), pp.11-13 17 Hudjetz B and Gabriel G (2012), “Human-like PB2 627K influenza virus polymerase activity is regulated by importin-α1 and -α7” PLoS Pathog, 8(1): e1002488 18 Boivin S and Hart DJ (2011), “Interaction of the influenza A virus polymerase PB2 C-terminal region with importin alpha isoforms provides insights into host adaptation and polymerase assembly”, J Biol Chem, 286(12), pp 10439-48 19 Labadie K, Afonso SED, Rameix WMA, Werf S, Naffakh N (2007), “Hostrange determinants on the PB2 protein of influenza A viruses control the interaction between the viral polymerase and nucleoprotein in human cells”, Virology, 362, pp 271–282 20 Tada T, Suzuki K, Sakurai Y, Kubo M, Okada H, Itoh T, Tsukamoto K (2011), “NP body domain and PB2 contribute to increased virulence of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in chickens”, J Virol, 85(4), pp 1834-1846 21 Gao Y, Zhang Y, Shinya K, Deng G, Jiang Y, et al (2009), “Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host”, PLoS Pathog, 5(12), pp 1-11 22 Ping J, Dankar SK, Forbes N.E., Keleta L, Zhou Y, Tyler S and Brown EG (2010), “PB2 and Hemagglutinin mutations are major determinants of host range and virulence in mouse-adapted influenza A virus” J Virol., 84(20), pp 10606-10618 23 Schat KA, Bingham J, Butler JM, Chen LM, Lowther S, Crowley TM, Moore RJ, Donis RO, Lowenthal JW (2012), “Role of position 627 of PB2 and the multibasic cleavage site of the hemagglutinin in the virulence of H5N1 avian influenza virus in chickens and ducks”, PLoS One, 7(2): e30960 24 Wise HM, Barbezange C, Jagger BW, Dalton RM, Gog JR, Curran MD, Taubenberger JK, Anderson EC and Digard P (2011), “Overlapping signals for translational regulation and packaging of influenza A virus segment 2” Nucleic Acids Research, 39(17), pp 7775–7790 25 Perez DR and Donis RO (1995), “A 48-amino-acid region of influenza A virus PB1 protein is sufficient for complex formation with PA”, J Virol, 69, pp 6932–6939 26 Li J, Li Y, Hu Y, Chang G, Sun W, Yang Y, Kang X, Wu X, Zhu Q (2011), “PB1-mediated virulence attenuation of H5N1 influenza virus in mice is associated with PB2”, J Gen Virol, 92(6), pp 1435-1444 27 Naffakh N, Massin P, Escriou N, Bernadette C and Sylvie van der Werf (2000), “Genetic analysis of the compatibility between polymerase proteins from human and avian strains of influenza A viruses”, Journal of General Virology, 81, pp.1283–1291 28 Hulse – Post DJ, Franks J, Boyd K, Salomon R, Hoffmann E, Yen HL, Webby RJ, Walker D, Nguyen TD, Webster RG (2007), “Molecular changes in the polymerase genes (PA and PB1) associated with high pathogenicity of H5N1 influenza virus in mallard ducks”, J Virol, 81, pp 8515-8524 29 Coleman JR (2007), “The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages” J Virol, 4, pp 9-11 30 Conenello GM, Zamarin D, Perrone LA, Tumpey T, Palese P (2007), “A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence”, PloS Pathog, 3(10), pp 30-41 31 Conenello GM, Tisoncik JR, Rosenzweig E, Varga ZT, Palese P, Katze MG (2011), “A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza A virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo”, J Virol, 85(2), pp 652-662 32 Chakrabarti AK, Pasricha G (2013), “An insight into the PB1-F2 protein and its multifunctional role in enhancing the pathogenicity of the influenza A viruses” Virology, 440(2), pp 97-104 33 O’Neill R, Schickli J, Palese P, Bennink JR and Yewdell JW (2001), “A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death”, Nat Med, 7, pp 1306–1312 34 Zamarin D, Garcia SA, Wang R, Palese P (2005), “Influenza virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1”, PloS Pathog, 1, pp 4-10 35 Varga ZT, Grant A, Manicassamy B, Palese P (2012), “Influenza virus protein PB1-F2 inhibits the induction of type I interferon by binding to MAVS and decreasing mitochondrial membrane potential”, J Virol, 86(16), pp 8359-8366 36 Zell R, Krumbholz A, Eitner A, Krieg R, Halbhuber KJ and Wutzler P (2007), “Prevalence of PB1-F2 of influenza A viruses”, J Gen Virol, 88, pp 536–546 37 Schmolke M, Manicassamy B, Pena L, Sutton T, Hai R, Varga ZT, Hale BG, Steel J, Pérez DR, García-Sastre A (2011), “Differential contribution of PB1-F2 to the virulence of highly pathogenic H5N1 influenza A virus in mammalian and avian species”, PLoS Pathog, 7(8): e1002186 38 Roland Z, Andi K, Annett E, Reimar K, Karl J, Halbhuber and Peter W (2007), “Prevalence of PB1-F2 of influenza A viruses”, J Gel Virology, 88, pp 536–546 39 DeLuca DS, Keskin DB, Zhang GL, Reinherz EL, Brusic V (2011), “PB1F2 Finder: scanning influenza sequences for PB1-F2 encoding RNA segments” BMC Bioinformatics 12 (13):S6 doi: 10.1186/1471-2105-12-S13S6, Epub 2011 Nov 30 40 Mehle A, Doudna JA (2009), “Adaptive strategies of the influenza virus polymerase for replication in humans” PNAS USA, 106, pp 21312–21316 41 Perez DR and Donis RO (2001), “Functional analysis of PA binding by influenza a virus PB1: effects on polymerase activity and viral infectivity”, J Virol., 75(17), pp 8127-8136 42 Mehle A, Dugan VG, Taubenberger JK and Doudna JA (2012), “Reassortment and mutation of the avian influenza virus polymerase PA subunit overcome species barriers”, Journal of Virology, 86(3), pp 1750–1757 43 Area E, Martín-Benito J, Gastaminza P, Torreira E, Valpuesta JM, Carrascosa JL, Ortín J (2004), “3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains”, Proc Natl Acad Sci USA, 101, pp 308–313 44 Lamb RA and Krug RM (2001), Orthomyxoviridae: the viruses and their replication In Fields Virology, pp 1487–1579 Edited by P M.Howley Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 45 Taubenberger JK, Reid AH, Lourens RM, Wang R, Jin G, Fanning TG (2005), “Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes”, Nature, 437(7060), pp 889-893 46 Ito T and Kawaoka Y (2000), “Host-range barrier of influenza A viruses” Vet Microbiol, 74, pp 71–75 47 Swayne DE and Suarez DL (2000), “Highly pathogenic avian influenza”, Rev Sci Tech Off Int Epiz, 20, pp 463-482 48 Baigent SJ and Mc Cauley JW (2003), “Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission”, Bioessays, 25, pp 657– 671 49 Phạm Văn Ty (2005), Virus học Nhà xuất giáo dục, 334 trang 50 Hurt AC, Selleck P, Komadina N, Shaw R, Brown L, Barr IG (2007), “Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to the neuraminidase inhibitors and adamantanes”, Antiviral Res, 73, pp 228-231 51 Reperant LA, van de Bildt MW, van Amerongen G, Leijten LM, Watson S, Palser A, Kellam P, Eissens AC, Frijlink HW, Osterhaus AD, Kuiken T (2012), “Marked endotheliotropism of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 following intestinal inoculation in cats” J Virol., 86(2), pp 1158-1165 52 Taubenberger JK and Kash JC (2010), “Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic formation”, Cell Host Microbe, 7, pp 440–451 53 Chen JM, Sun YX, Chen JW, Liu S, Yu JM, Shen CJ, Sun XD, Peng D (2009), “Panorama phylogenetic diversity and distribution of type A influenza viruses based on their six internal gene sequences”, Virology Journal, 6(137), pp.1186-1206 54 Yao Y, Mingay LJ, Mccauley JW, Barclay WS (2001), “Sequences in influenza A virus PB2 protein that determine productive infection for an avian influenza virus in mouse and human cell lines”, J Virol, 75, pp 5410-5415 55 Subbarao K, London W, Murphy BR (1993), “A single amino acide in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range”, J Virol, 67, pp 1761-1764 56 Massin P, van der Werf S, Naffakh N (2001), “Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses”, J Virol, 75, pp 5398-04 57 Rolling T, Koerner I, Zimmermann P, Holz K, Haller O, Staeheli P, Kochs G (2009), “Adaptive mutations resulting in enhanced polymerase activity contribute to high virulence of influenza A virus in mice” J Virol, 83(13), pp 6673-80 58 Steel J, Lowen AC, Mubareka S, Palese P (2009), “Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N”, PloS Pathog, 5, pp 252-265 59 Bussey KA, Bousse TL, Desmet EA, Kim B, Takimoto T (2010), “PB2 residue 271 plays a key role in enhanced polymerase activity of influenza A viruses in mammalian host cells”, J Virol, 84(9), pp 4395-406 60 Zhou B, Li Y, Halpin R, Hine E, Spiro DJ, Wentworth DE (2011), “PB2 residue 158 is a pathogenic determinant of pandemic H1N1 and H5 influenza a viruses in mice”, J Virol, 85(1), pp 357-65 61 Wagner R, Matrosovich M, Klenk H (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Med Virol, 12(3), pp 159-166 62 Cheung CL, Rayner JM, Smith GJD, Wang P, Zhang J, Yuen KY, Webster RG, Peiris JSM, Guan Y, Chen H (2006), “Distribution of amantadine-resistant H5N1 avian influenza variants in Asia”, J Infect Dis, 193, pp 1626-1629 63 Reid AH, Taubenberger JK, Fanning TG (2004), “Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus”, Nat Rev Microbiol, 2, pp 909–914 64 Taubenberger JK and Morens DM (2006), “1918 influenza: the mother of all pandemics”, Emerg Infect Dis, 12, pp 15-22 65 WHO (2013a), “Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2013”, on 12 April 2013, http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_tab le_archivsen/index.html 66 Chen H, Deng G, Li Z, Tian G, Li Y et al (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, PNAS, 101(28), pp 10452-10457 67 Chen H, Smith GJD, Li KS, Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung CL, Xu KM, Duan L, Wu WL, Chen Y, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JSM, Guan Y (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, PNAS USA, 103, pp 2845-2850 68 WHO/OIE/FAO - H5N1 Evolution Working Group (2012), “Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1)”: updated nomenclature Influenza Other Respi Viruses 2012 Jan; 6(1), pp 1-5 69 WHO (2013b), “Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness”, on 20_2_2013, http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/201302_h5h7h9_vaccinevirusupdate.pdf 70 Li Y, Shi J, Zhong G, Deng G, Tian G, Ge J, et al (2010), “Continued evolution of H5N1 influenza viruses in wild birds, domestic poultry and humans in China from 2004 to 2009”, J Virol, 84, pp 8389–8397 71 Wan XF, Dong L, Lan Y, Long LP, Xu C, et al (2011), “Indications that live poultry markets are a major source of human H5N1 influenza virus infection in China”, J Virol 85 (24), pp 13432-13438 72 WHO (2013c), Human infection with avian influenza A(H7N9) virus in China – update Available from http://www.who.int/csr/don/2013_04_19/en/index.html 73 Vijaykrishna D, Bahl J, Riley S, Duan L, Zhang JX, et al (2008), “Evolutionary dynamics and emergence of panzootic H5N1 influenza viruses”, PloS Pathog, 4(9), pp 1-10 74 Li KS, Guan Y, Wang J, Smith GJ, Xu KM, Duan L, et al (2004), “Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia”, Nature, 430, pp 209-213 75 Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), “Virus cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype tƣơng đồng kháng nguyên – miễn dịch – vaccine”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6(4A), tr 529-553 76 Wan XF, Nguyen TD, Davis CT, Smith CB, Carrel M, Do HT, Mai DT, Cox NJ, Nguyen CV, Klimov A, Donis RO (2008), “Evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in Vietnam between 2001 and 2007”, PLoS One, 3, pp 1-12 77 Nguyen T, Rivailler P, Davis CT, Hoa T, Balish A, Dang NH, Jones J, Vui DT, Simpson N, Huong NT, Shu B, Loughlin R, Ferdinand K, Lindstrom SE, York I.A, Klimov A, Donis RO (2012), “Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus populations in Vietnam between 2007 and 2010”, Virology, 432(2), pp 405-416 78 Nguyen TD, Nguyen TV, Vijaykrishna D, Webster RG, Guan Y, Peiris MJS and Smith GJD (2008), “Multiple Sublineages of Influenza A Virus (H5N1), Vietnam, 2005−2007”, Emerging Infectious Diseases, 14(4), pp 632-636 79 Nguyen TD, Davis CT, Stembridge W, Ngo HT, Wan XF, Mc Carron M, Lindstrom SE, Cox NJ, Nguyen CV, Klimov AI, Donis RO (2009), “Characterization of a highly pathogenic avian influenza H5N1 virus sublineage in poultry seized at ports of entry into Vietnam”, Virology, 387, pp 250-256 80 , 2003 – 2008”, , 764(5/2011), tr 86 – 89 81 Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), “Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) ngƣời khu vực phía Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 517 (8/2005), tr 46-49 82 Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong M, Hien TT, Webster RG, Guan Y (2006), “Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam”, Virology, 350, pp 258-268 83 Wang J, Vijaykrishna D, Duan L, Webster RG, Peiris JSM, Chen H, Smith GJD, Guan Y (2008), “Identification of the progenitors of Indonesian and Vietnamese avian influenza A (H5N1) viruses from southern China”, J Virol, 82, pp 3405-3414 84 Nguyễn Ngọc Tiến, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Tùng Ken Inui (2011), “Lƣu hành virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 Việt Nam vaxcin phịng bệnh cúm gia cầm”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XVIII(6), tr 76 - 78 85 Đậu Huy Tùng, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Tùng, Nguyễn Nam Thắng, Trần Xuân Hạnh, Kim Young Bong Đinh Duy Kháng (2012), “Đánh giá hiệu lực vacxin cúm H5N1 (chủng NIBRG14) số clade lƣu hành Việt Nam năm 2011và phân tích đặc tính di truyền virut H5N1 clade 2.3.2.1b”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XIX(6), tr 5-16 86 Nguyễn Thị Bích Nga Lê Thanh Hịa (2012), “Xác định nhóm kháng ngun 1.1 2.3.2.1 cúm A/H5N1 xuất Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền phả hệ gen hemagglutinin (H5) giai đoạn 2004 – 2011”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XIX(2), tr 20-28 87 Bộ Y tế Việt Nam (2013), Thông cáo chung: Tình hình Cúm A(H7N9), http://www.moh.gov.vn/wps/portal/boyte/tintuc/chitiet/!ut/p/c5/04, Truy cập 18/4/2013 88 Guan Y, Smith GJD, Webby RJ and Webster RG (2009), “Molecular epidemiology of H5N1 avian influenza”, Rev sci tech Off int Epiz, 28 (1), pp 39-47 89 Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2002), “Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses”, Nat Med, 8, pp 950-954 90 Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2004), “The NS1 gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti-viral cytokine responses”, Virus Res, 103, pp 107-113 91 Lycett SJ, Ward MJ, Lewis FI, Poon AF, Kosakovsky PSL, Brown AJ (2009), “Detection of mammalian virulence determinants in highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses: multivariate analysis of published data”, J Virol, 83(19), pp 9901-9910 92 Duan L, Smith GJD, Wang J, Vijaykrishna D, Li KS, Shortridge KF, Webster RG, Peiris JSM, Chen H and Guan Y (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996–2006”, Virology, 380(2), pp 243–254 93 Chen H, Bright RA, Subbarao K, Smith C, Cox NJ, Katz JM, Matsuoka Y (2007), “Pyolygenic virulence factors involved in pathogenesis of 1997 Hong Kong H5N1 influenza viruses in mice”, Virus Res, 128(1-2), pp.159-63 94 Le MTQ, Wertheim HFL, Nguyen HD, Taylor W, Hoang PVM, et al (2008), “Influenza A H5N1 clade 2.3.4 virus with a different antiviral susceptibility profile replaced clade virus in humans in Northern Vietnam”, PloS ONE, 3(10), pp 1-8 95 Le QM, Sakai-Tagawa Y, Ozawa M, Ito M, Kawaoka Y (2009), “Selection of H5N1 influenza virus PB2 during replication in humans”, J Virol, 83(10), pp 5278-5281 96 Hatta M, Hatta Y, Kim JH, Watanabe S, Shinya K, Nguyen T, Lien PS, Le QM & Kawaoka Y (2007), “Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice”, PLoS Pathog 3, pp 1374-1379 97 Katz JM, Lu X, Tumpey TM, Smith CB, Shaw MW (2000), “Molecular correlates of Influenza A/H5N1 virus pathogenesis in mice” J Virol, 74(22), pp 10807-10810 98 Hatta M, Gao P, Halfmann P, Kawaoka Y (2001), “Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses”, Science, 293(5536), pp 1840-1842 99 Li J, Ishaq M, Prudence M, Xi X, Hu T, Liu Q, Guo D (2009), “Single mutation at the amino acid position 627 of PB2 that leads to increased virulence of an H5N1 avian influenza virus during adaptation in mice can be compensated by multiple mutations at other sites of PB2”, Virus Res, 144(1-2), pp 123-129 100 Subbarao K, Shaw MW (2000), “Molecular aspects of avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Medical”, Virology, 10(5), pp 337-348 Reviews 101 Song MS, Pascua PN, Lee JH, Baek YH, Lee OJ, Kim CJ, et al (2009), “The polymerase acidic protein gene of influenza a virus contributes to pathogenicity in a mouse model”, J Virol, 83, pp.12325-35 102 Lê Trần Bình, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trƣơng Nam Hải (2006), Phân tích mối tƣơng đồng kháng nguyên miễn dịch chủng virus cúm A, chủng cƣờng độc đƣơng nhiễm chủng vacxin cúm A/H5N1, Tạp chí Cơng nghệ sinh học,4(3), tr 1-7 103 Trần Quang Vui, Nguyễn Thị Bích Nga, Đồn Thị Thanh Hƣơng, Nguyễn Bá Hiên, Lê Thanh Hòa (2009), “Gen PB1 PB1-F2 virus cúm A/H5N1 chủng A/CK/VietNam/HG4/2005, so sánh với số chủng phân lập 2004-2007 vùng đồng sơng Cửu Long”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(2), tr 1-8 104 Cao Thị Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dƣơng (2005), “Đánh giá độc tính khả lây cho ngƣời virus cúm A/H5N1 qua vụ dịch 2004-2005 miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen”, Tạp chí Y học dự phịng, 15(6), tr 5-10 105 Bộ Y tế Việt Nam (2005), “Hƣớng dẫn lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm virus cúm A/H5N1”, Ban hành kèm theo định số 1269/QĐ-BYT ngày 07 tháng năm 2005 Bộ trƣởng Bộ Y tế 106 Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd editon.) Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN 978-0-87969-577-4 107 Clark David P (2005), Molecular Biology: Academic Cell Update Edition, Elsevier Academic Press, Jun 9, 2005 - Science - 816 pages ISBN: 0-12-175551-7 108 Bae SH, Cheong HK., Lee JH, Cheong C, Kainosho M, Choi BS (2001), “Structural features of an influenza virus promoter and their implications for viral RNA synthesis”, Proc Nat Acad Sci USA, 98, pp 10602–10607 109 Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR (2001), “Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses” Arch Virol, 146, pp 2275–89 110 Chan CH, Lin KL, Chan Y, Wang YL, Chi YT, Tu HL, Shieh HK, Liu WT (2006), “Amplification of the entire genome of influenza A virus H1N1 and H3N2 subtypes by reverse-transcription polymerase chain reaction”, Journal of Virological Methods, 136, pp 38-43 111 O’Connell J (2002), RT-PCR protocols in “Methods in Molecular Biology”, 193, © Humana Press Inc., Totowa, NJ, 378 pp, http://www.humanapress.com 112 Hagemann TL, Kwan SP (2008), SeqEd: Manipulation of sequence data and Choromatograms from the ABI DNA Sequencer Analysis Files: 55-63, in “Sequence data analysis guidebook (Methods in Molecular Biology)” Eds: Swindell SR Humana Press Inc., Totowa, NJ 113 Nicholas KB and Nicholas HB (1997), Gendoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments Distributed by the author 114 Tamura K, Dudley MN, Kumar S (2007) “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0”, Mol Biol Evol, 24, pp 1596-1599 115 Kim HR, Lee YJ, Choi KP, Oem JK, Lee OS, Kang HM, Choi JG, and Bae YC (2012), “Highly pathogenic avian influenza (H5N1) outbreaks in wild birds and poultry, South Korea”, Emerg Infect Dis, 18(3), pp 480-483 116 Sonnberg S, Phommachanh P, Naipospos TS, McKenzie J, Chanthavisouk C, Pathammavong S, Darnell D, Meeduangchanh P, Rubrum AM, Souriya M, Khambounheuang B, Webby RJ, Douangngeun B, Webster RG (2012), “Multiple introductions of avian influenza viruses (H5N1), Laos, 2009-2010”, Emerg Infect Dis., 18(7) pp 1139-1143 117 Guan Y, Peiris JSM, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp 1203-1207 118 Jiao P, Tian G, Li Y, Deng G, Jiang Y, Liu C, Liu W, Bu Z, Kawaoka Y, Chen H (2008), “Single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice”, J Virol, 82, pp 1146-1154 TRANG WEB http://www.moh.gov.vn http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Primer.cgi http://www.macvector.com/index.html http://www.megasoftware.net/mega.html http://www.nrbsc.org/gfx/gendoc/html http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/201101_h5n1evoconceptualdiagram.pdf http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/20090527IDCDC RG15a.pdf PHỤ LỤC LUẬN ÁN ... 5’-ACATACTGGAAAGGACACACAACG-3’ H5R1 5’-GGCATACTAGAGTTTATCGCCC-3’ KPB2F 5’-AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTCA-3’ Mồi xuôi KPB2R 5’-AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTA-3’ Mồi ngƣợc Gen PB2 ~ 2,3 kb PB2FS 5’-TCCGAGAGAGGCGAAGAGAC-3’... 5’-TCCGAGAGAGGCGAAGAGAC-3’ Mồi giải trình tự Gen PB2 KPB1F 5’-GCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAATG-3’ Mồi xuôi KPB1R 5’-AGTAGAAACAAGGCATTTTTTCATGAA-3’ Mồi ngƣợc Gen PB1 ~ 2,3 kb 10 PB1F3 5’-TGAGCATTGGTGTTACAGTG-3’... PB1 11 PB1R3 5’-AGTAGAAACAAGGCATTTTTT-3’ Mồi ngƣợc 3’- PB1 12 PB1FS 5'-GGACGGCTAATAGATTTCCTCAAG-3' Mồi giải trình tự Gen PB1 13 KPAF 5'-AGCRAAAGCAGGTACTGATYCGAAATG-3' Mồi xuôi 14 KPAR 5'-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACA-3'