Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thế nấm cordyceps militaris

9 Bảng 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của quả thể và sợi nấm Cordyceps militaris .... Loài Nấm Cordyceps militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính s

Trang 1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Trang 2

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn : ThS VŨ DUY NHÀN

Sinh viên thực hiện : HOÀNG THỊ NHÀN Lớp : 13.01- K20

Hà Nội - 2017

Trang 3

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học

Mở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiên luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên

Hoàng Thị Nhàn

Trang 4

Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH

MỤC LỤC

Danh mục các chữ cái viết tắt

Danh mục hình

Danh mục bảng

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về nấm Codyceps militaris 4

1.1.1 Đặc điểm của nấm Codyceps militaris 4

1.1.2 Thành phần hóa học trong Codyceps militaris 6

1.1.2.1.Adenosine 6

1.1.2.2 Cordycepin 7

1.1.2.3 Sterols 8

1.1.2.4 Nucleotides 8

1.1.2.5 Protein và các amino acid 8

1.2.6 Acid béo 9

1.1.2.7 Polysaccharide 9

1.1.2.8 Acid cordyceptic 10

1.1.2.9.Ergosterol 11

1.1.3 Các ứng dụng từ quả thể nấm Codyceps militaris 11

1.1.3.1 Tăng cường khả năng miễn dịch 11

1.1.3.2 Điều trị bệnh ung thư 11

1.1.3.3 Giải độc thận 12

1.1.3.4 Điều trị bệnh phổi 12

1.1.3.5 Điều trị bệnh tim mạch 12

1.1.3.6 Tăng sức bền 13

1.1.3.7 Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu 13

1.2 Giới thiệu về Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris 13

1.2.1 Đặc điểm Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris 13

Trang 5

1.2.2 Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide từ quả thể nấm

Cordyceps militaris 14

1.2.3 Tác dụng dược lý của polysaccharide 17

1.3 Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ quả thể nấm Cordycep militaris 18

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Polysaccharide trên thế giới 18

1.3.2 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng Cordyceps militaris ở Việt Nam 20

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tách chiết Polisaccharide từ Quả thể nấm Cordyceps militaris 25

2.2.2 Xác định hàm lượng Polysaccharide theo phương pháp phenol-sunfuric của Milchel.DuBois, K.A.Gilles và cs, 1956 25

2.2.3 Thu nhận Polysaccharide bằng phương pháp kết tủa 28

2.2.4 Phân tích nhóm chức của Polysaccharide bằng IR 28

PHẦN 3: KẾT QUẢ 30

3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết 30

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ mẫu/ dung môi dùng để tách chiết 31

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất tách chiết 32

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng về thời gian chiết 32

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 34

3.4 Xây dựng quy trình tách chiết 35

3.5 Kết quả đo phổ 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Trang 6

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

CP Cordyceps Polysaccharide

C.Militaris Nhộng trùng hạ thảo

C sinensis Đông trùng hạ thảo

Sp Species- Một loài

Spp Species plural- Nhiều loài

P1 Polysaccharide thu được từ dịch sau khi chiết với nước P2 Polysaccharide thu được từ phần bã đã bổ sung NaOH 4% P3 Polysaccharide thu được sau khi kết tủa

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cordyceps militaris 5

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Adenosine 6

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Cordycepin 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo polysaccharide 10

Hình 2.1: Cordyceps militaris nuôi cấy tại Viện Khoa học và công nghệ quân sự - BQP 23

Hình 2.2: Mẫu dùng để tách chiết 23

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tách chiết và tinh sạch Cordyceps polysaccharide 25 Hình 2.4: Mẫu đo đường chuẩn 27

Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn glucose( /) 27

Hình 2.6: Máy ép thủy lực Specac 29

Hình 2.7: Máy đo phổ Spectrum two 29

Hình 3.1: Ảnh hưởng của phương pháp chiết tới hàm lượng polysaccharide trong dịch chiết 30

Hình 3.2: Ảnh hưởng của phương pháp chiết tới khối lượng Polysaccharide thu được 30

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi trong dung dịch chiết 31

Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi lên khối lượng polysaccharide thu được 32

Hình 3.5: Ảnh hường thời gian chiết lên hàm lượng polysaccharide thu được 33

Hình 3.6: Ảnh hưởng thời gian chiết đối với khối lượng polysaccharide thu được 33

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hàm lượng polysaccharide thu được 34

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới khối lượng polysaccharide thu được 34

Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tách chiết Polysaccharide 36

Trang 8

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR của mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết quả

nghiên cứu của Fengyao Wu [19] 40

Hình 3.11: Kết quả đo phổ hồng ngoại IR của mẫu P1 41

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại khoa học 4

Bảng 1.2: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris 9

Bảng 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của quả thể và sợi nấm Cordyceps militaris 14

Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides 14

Bảng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide 16

Bảng 1.6: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận từ một số loại nấm 18

Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.2: Xây dựng phương trình đường chuẩn Glucose 26

Bảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu 42

Trang 10

Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301 - CNSH 1

MỞ ĐẦU

Chi nấm Cordyceps được biết đến cách đây hơn 2000 năm trước công nguyên, với hơn 350 loài trên toàn thế giới Trong đó có loài Cordyceps sinensis thường ký sinh và sinh trưởng lên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp nhất là ấu trùng của loài Hepialus armoricanus Sản phẩm quả thể nấm trên xác ấu trùng được dân gian Trung Quốc từ xưa gọi là Đông Trùng Hạ Thảo, là loại dược liệu quý hiếm bậc nhất đối với y học cổ truyền Trung quốc.Bên cạnh Cordyceps sinensis còn có loài

nấm Cordyceps militaris cũng có đặc điểm tương tự Loài nấm Cordyceps militaris phân bố chủ yếu ở vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan[5]

Trong chi Cordyceps còn có một loài khác là Cordyceps militaris (L ex Fr.)Link cũng có thành phần và tính chất dược liệu tương tự với Cordyceps sinensis Loài nấm dược liệu này với nhiều tên thông dụng khác nhau tại một

số quốc gia như: Đông trùng hạ thảo, Trùng thảo, Bắc Trùng thảo (Trung Quốc), Tong ch’ung ha ch’o (Hàn Quốc), Tochukaso (Nhật Bản), Yarchakunbu (Tây Tạng) Shonkor Kumar Das và cộng sự, 2010 [5]

Loài Nấm Cordyceps militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể như cordycepin, ergosterol, mannitol, cordyepolysaccharide và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn

cao hơn cả loài Cordyceps sinensis[5] Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, sinh

khối của các loài nấm này có một số chức năng dược lý: bảo vệ gan, tăng cường chức năng thận, chống ung thư bạch cầu, chống hình thành khối u và hạn chế di căn, cải thiện khả năng tiết insuline đối với người tiểu đường, tăng cường khả năng [5,7]

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng quả thể Cordyceps militaris và cơ thể

ấu trùng bị chúng kí sinh có chứa các chất có hoạt tính sinh học quan trọng, có phổ tác dụng dược lý rộng như polysaccharides, cordycepin, ergosterol[8] Cordyceps polysaccharides (CP) là nhóm hoạt chất giàu nhất và quan trọng

Trang 11

nhất, được xem là công cụ và đối tượng nghiên cứu để ứng dụng và phát triển

các sản phẩm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Đông trùng hạ thảo được

xem là một loại dược liệu cỏ truyền quý hiếm bậc nhất của Trung Quốc so với các loại nấm dược liệu khác Chính vì vậy gần đây các phương pháp để tách

chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ

sợi nấm và quả thể được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi[9]

Các polysaccharide có tác dụng dược lý tăng cường miễn dịch, bảo vệ tế bào gan, giảm mỡ máu, chống đột biến, giảm đường huyết, chống oxy hóa [7] Trong

số các tác dụng trên, tác dụng kháng khối u của tế bào gan được đề cập nhiều hơn

cả Các nghiên cứu dược tính của các hoạt chất trong sinh khối Cordyceps militaris cho thấy có khả năng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [7]

Có rất nhiều nghiên cứu để tìm ra phương pháp tách chiết polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng như ứng dụng nhất định Hiện nay, các phương pháp thường sử dụng công nghệ chiết bằng siêu âm, chiết bằng nước nóng, chiết bằng cồn, đun hồi lưu và đun hồi lưu trong môi trường kiềm Công nghệ chiết bằng siêu âm đem lại hàm lượng cao nhưng lại khó triển khai được bằng quy mô lớn, trong khi

đó đun hồi lưu đạt được giá trị tương ứng cao nhất là 22.6% Ở Việt Nam đã một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu công bố một số kết quả trong việc sản

xuất chế phẩm từ các chủng nấm Cordyceps, sản phẩm thu nhận được có chất

lượng tốt nhưng khó khăn khi kiểm soát hàm lượng polysaccharide và các hoạt chất khác như adenosine, cordycepine trong sản phẩm và triển khai với quy mô công nghiệp Chính vì vậy việc tìm ra một phương pháp tách chiết phù hợp với điều kiện Việt nam hiện nay rất là quan trọng

Trang 12

Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm dược liệu đạt được lên tới hơn 10 triệu m3, trong đó có bao gồm cả Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link[5,7] Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam

Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa phương như: Hà Nội, Đà Lạt, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sapa (Lào Cao), Thành phố Hồ Chí Minh Dự kiến trong những năm tới sản lượng quả

thể Cordyceps militaris Link tại Việt nam sẽ tăng lên nhanh chóng, quy mô

nuôi trồng công nghiệp ngày càng được triển khai ở nhiều địa phương Như

vậy, nguồn nấm dược liệu Cordyceps militaris sẽ rất phong phú, phục vụ cho

các nghành sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng trong nước, một phần nguyên liệu cũng sẽ hướng tới xuất khẩu

Đề tài: “Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm

Codyceps militaris” góp phần tạo ra kỹ thuật và công nghệ sản xuất Cordycep polysaccharide là rất cần thiết nhằm bổ sung nguồn nguyên liệu cho ngành sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng

1.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết: đun hồi lưu, siêu âm

1.2 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết: cỡ hạt chất chiết, tỷ lệ chất chiết/dung môi, hỗn hợp dung môi, nhiệt độ, thời gian

2 Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu Polysaccharide phân lập được

Trang 13

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về nấm Codyceps militaris

1.1.1. Đặc điểm của nấm Codyceps militaris

Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng có giá trị

dược liệu quý tương tự như nấm Cordyceps sinensis Khác với nấm Cordyceps sinensis với sản lượng rất ít và chỉ mọc trong tự nhiên, loài nấm

Cordyceps militaris có thể được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo Vào cuối

mùa thu thì các chất trên da của ấu trùng Hepialus armoricanus tương tác với

các bào tử nấm tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng

Hepialus armoricanus để sinh trưởng và phát triển Đến đầu mùa hè năm sau,

do tác động của các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp, nấm phát sinh mạnh mẽ và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui

ra khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy vào mùa hè ở các vùng núi cao trên 4000m như Vân Nam, Cam Túc, Thanh Hải, Tứ Xuyên… [8]

Bảng 1.1: Phân loại khoa học

Trang 14

Hình 1.1: Cordyceps militaris

Theo Sung et al, trên thế giới có hơn 350 loài Codyceps khác nhau, tính

riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 120 loài Đông trùng hạ thảo Tuy

nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nấm Codyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người Loài nấm Cordyceps militaris phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 2000-

3000m so với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có tính sinh học

trong quả thể như Cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide dismutase và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của

loài Cordyceps sinensis[5] Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu

chính của loài nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như sau: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al., 2006, Park C.et al., 2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al 2001), sự lão hóa Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hóa của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L>M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [7]

Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm đạt được lên tới hơn 10 triệu , trong đó Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr) Link.,[5,7] Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam Cordyceps militaris

(L ex Fr) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa phương như: Hà Nội, Tam Đảo, Thành phố Hồ Chí Minh Hàm lượng hoạt chất

Trang 15

adenosine trong sản phẩm đạt bình quân là 0,31,45mg/g và Cordycepin là 9mg/g Trong những năm vừa qua, Viện Hóa học – Vật liệu, Viện Khoa học

3-và Công nghệ Quân sự/BQP cùng một số đơn vị trong cả nước như Viện Bảo

vệ thực vật đã nghiên cứu thành công công nghệ nhân giống, nuối trồng quy

mô công nghiệp đối với chủng Cordyceps militaris (L ex Fr) Link và đã triển

khai chuyển giao cho nhiều cơ sở ở Hà Nội, Đà Lạt, Nha Trang, Thành phố

Hồ Chí Minh

1.1.2. Thành phần hóa học trong Codyceps militaris

Cordyceps militaris có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quan trọng nhất là adenosine, codycepin, polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thư và các bệnh do virus Bên cạnh đó đông trùng hạ thảo còn chứa khoảng 28 acid béo bão hòa và không bão hòa, các loại vitamin như B1, B2, B12, E, K và các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Ze, Mn, Se…Selen (Se) là một chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp ngăn ngừa ung thư

1.1.2.1.Adenosine

Chất Adenosine có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể Chất này giúp cải thiện tuần hoán ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế bào thoái hóa, tăng lượng oxy trong máu Vì vậy việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ thể là vô cùng cần thiết, giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng để lao động hiệu quả

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Adenosine

Trang 16

1.1.2.2 Cordycepin

Cordycepin có cấu trúc 3’

của nucleosid adenosin b

Cordycepin được phân l

Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared), cordycepin được xem nh

từ quả thể và sợi nấm Cordycepin có công th

lượng 251, điểm nóng ch

thể hoà tan trong dung d

hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do v

dụng dung dịch muối kh

Hình 1.3:

Vì cordycepin có c

không thể phân biệt Khi tham gia t

ngăn chặn quá trình kéo dài thêm

thúc sớm Do đó, cordycepin

Năm 2003, Sun và cs đ

kháng khối u

sinensis và Cordyceps m

trong sợi nấm cao hơn

chất có tiềm năng dược h

minh cordycepin có ho

u trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có d

a nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đư

c phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris

NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared),

c xem như là một hợp chất có hoạt tính sinh học

m Cordycepin có công thức C10H13N5O3

m nóng chảy tại 230-231OC, độ hấp thu cực đại thoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nh

hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên c

i khử trùng và đệm phosphat làm dung môi

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Cordycepin

Vì cordycepin có cấu trúc tương tự adenosin nên RNA polymerase

t Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin

n quá trình kéo dài thêm các RNA và tạo ra các phân t

ó, cordycepin được xem như chất kháng ung th

m 2003, Sun và cs đã chứng minh hàm lượng cordycepin v

i u ở Cordyceps kyushuensis cao hơ

Cordyceps militaris , ở Cordyceps nuôi cấy cao hơn t

ơn ấu trùng chủ Tác giả cũng khẳng định rằ

c học cao Năm 2007, Noriko Yoshikawa và cs chminh cordycepin có hoạt tính kháng ung thư hiệu quả thông qua vi

t purin alkaloid có dạng

n đường ribose

Cordyceps militaris NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared),

t kháng ung thư hiệu quả

ng cordycepin với hoạt tính cao hơn Cordyceps

y cao hơn tự nhiên, và

ằng đây là hợp

m 2007, Noriko Yoshikawa và cs chứng

qua việc ức chế

Trang 17

quá trình methyl hóa acid nucleic và polyadenin hóa Đồng dạng của cordycepin là 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thông qua việc ức chế reverse transcriptase Tác giả cũng chứng minh rằng tiền chất của cordycepin là adenosin cũng có hoạt tính kháng ung thư

1.1.2.3 Sterols

Một số hợp chất loại sterol đã được tìm thấy trong Cordyceps đông trùng hạ thảo Một số trong những chất này là ergosterol, Delta – 3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol và campasterol v.v… Trong đó, ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiềm chất thiết yếu của vitamin D2, có giá trị rất quan trọng Ergosterol trong C sinensis có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991

[10,14], được cho là chất ophiocordin, ở Cordyceps pseudomilitaris là chất

bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân

tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C Militaris[5]

1.1.2.4 Nucleotides

Nucleotides( gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần

khá đa dạng trong nấm Cordyceps Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine

có hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều

kiện nhân tạo hàm lượng của nucleotide thường cao hơn C.Militaris tự nhiên Nucleotides trong Cordyceps tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của

nucleotides trong suốt quá trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide trong

Codyceps khi nuôi trên môi trường rắn [13]

1.1.2.5 Protein và các amino acid

Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18

acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein và tryptophan Các acid amin có hàm lượng cao nhất là glutamat,

Trang 18

arginin và acid aspartic và có dược tính cao nhất là arginin, glutamat, tryptophan và tyrosin Năm 2011, Zheng và cs đã nghiên cứu họ protein

trong Cordyceps militaris Kết quả cho thấy bộ gen Cordyceps militaris chứa

61 họ protease nhưng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen

mã hóa trypsin, 167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid

hydrolase Hơn nữa, Cordyceps militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho

hoạt động biến dưỡng adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid triphosphat reductase và deoxyadenosin kinase [14,19]

1.2.6 Acid béo

Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm

70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối

Bảng 1.2: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris

Acid béo Phần trăm acid béo tổng (%)

Quả thể Sinh khối

từ polysaccharid trong việc kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng

như tác động điều hòa miễn dịch Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là

Trang 19

α-sườn qua vị trí O-6 của g

cũng cho thấy dược tính c

lượng phân tử, ví dụ nh

1000 kDa) có xu hướng tan trong n

khối u hiệu quả hơn Tuy nhiên, ho

miễn dịch cho cơ thể hơ

Hình 1.4:

1.1.2.8 Acid cordyceptic

Acid cordyceptic

tiên ở Cordyceps sinensis

được xác định là D-mannitol Mannitol là h

hoạt tính quan trọng nh

trong tự nhiên chủ yếu ở

cà rốt và rêu Hàm lượ

Mannitol có cấu tạo gồ

tự như xylitol hay sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu h

t galactomannan nhiều nhánh Các hợp chất này bao gồm D

ệ 3:5, thường chứa một tỷ lệ nhỏ protein Nó l

ồm các liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các g

ở mạch chính, có các liên kết đa dạng gi

ận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nh

ới trọng lượng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol đ

a các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9 Các phân tích

t khung sườn α-D-glucan với các liên kết (1-4) và (1-D-(1-6)-mannopyranose (Manp) được gắ

ủa gốc α-(1-3)-glucopyranosyl (Glcp) Nghiên c

c tính của polysaccharid là từ các đặc tính của nó nh

ụ như các polyglucan có trọng lượng phân tửớng tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạ

n Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do s

ơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp[8,

Hình 1.4: Công thức cấu tạo polysaccharide

Acid cordyceptic

là một isomer của acid quinic, được nghi

Cordyceps sinensis năm 1957 Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic

mannitol Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhi

ng như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho Chấ

ếu ở rễ, thân và lá cây; được tìm thấy nhiều trong nợng acid cordyceptic trong Cordyceps kho

o gồm một alcohol và một đường, hoặc một polyol; t xylitol hay sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu hướng lo

ồm D-mannose và protein Nó là một cấu

ợc gắn vào khung glucopyranosyl (Glcp) Nghiên cứu này

c tính của nó như trọng

ử lớn hơn

có hoạt tính kháng

là do sự tăng cường ,17]

c nghiên cứu đầu

acid cordyceptic

ọc chính có nhiều

ho Chất này tồn tại

ều trong nấm ăn, khoảng 7-29%

ột polyol; tương ớng loại bỏ ion

Trang 20

hydrogen trong nước làm dung dịch trở nên acid Công thức hóa học của mannitol là C6H14O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166oC, tỷ trọng 1,489 (20oC) và nhiệt độ sôi 290-295oC (467 kPa) Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lượng

mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm

có hàm lượng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể [7,15]

1.1.2.9.Ergosterol

Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D Hàm lượng ergosterol

ở Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau Cordyceps sinensis tự

nhiên phân lập ở Tây Tạng Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có

hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm immunoglobin A

1.1.3 Các ứng dụng từ quả thể nấm Codyceps militaris

1.1.3.1 Tăng cường khả năng miễn dịch

Một thí nghiệm kéo dài 5 năm trên 61 bệnh nhân bị bệnh lupus cho thấy,

việc dùng Cordyceps militaris với liều 3-4 g/ngày và artémisinine (0,6

g/ngày) đã làm giảm sự tái diễn căn bệnh tự miễn này Trong một thí nghiệm khác với các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến triển, người ta kết luận rằng các bệnh nhân được điều trị bằng loại nấm này đã được cải thiện chức năng miễn dịch và nâng cao chất lượng cuộc sống[4]

1.1.3.2 Điều trị bệnh ung thư

Chất Cordycepin trong thuốc Cordyceps militaris có thể ức chễ sự phân

hạch của các tế bào ung thư, trì hoãn sự lây lan của các tế bào ung thư, có khả năng diệt một lượng lớn các tế bào T, các thực bào trong cơ thể Các

polysaccharides trong Cordyceps militaris có thể góp phần thúc đẩy chuyển hóa hạch, tăng cường khả năng tự chống ung thư cơ thể Đồng thời Cordyceps militaris còn có tác dụng an thần, giảm đau tương đối tốt làm giảm sự khởi đầu của cơn đau ung thư Do hiện này vẫn chưa có thuốc chữa trị unh thư đặc hiệu,

và hầu hết các loại thuốc này không chỉ tốn kém mà còn có tác dụng phụ tương

Trang 21

đối lớn, như vậy nếu so sánh, Cordyceps militaris không những không có tác dụng phụ mà còn giúp cơ thể phục hồi một cách toàn diện, tăng cường chức

năng miễn dịch của họ Do đó, việc sử dụng Cordyceps militaris để phòng chống

ung thư và dùng như các chất bổ trợ trị liệu là một lựa chọn tốt[7]

1.1.3.3 Giải độc thận

Thử nghiệm mù đôi được thực hiện trên 21 bệnh nhân cao tuổi theo liệu trình điều trị với amikacine (một kháng sinh rất độc cho thận), người ta quan

sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm Cordyceps militaris thì thận được bảo vệ

tốt hơn, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chiếu dùng giả dược Kết quả một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị suy thận chỉ

dùng nấm Cordyceps militaris thì thấy có cải thiện chức năng thận và hệ miễn

dịch Một thử nghiệm khác cũng được thực hiện trên 69 bệnh nhân ghép thận,

kết quả là nấm Cordyceps militaris đã làm giảm độc tính của cyclosporine

trên thận[4]

1.1.3.4 Điều trị bệnh phổi

Cordyceps militaris có khả năng tăng cường hiệu năng sử dụng oxy trong cơ thể, cùng với các chiết xuất từ nó đã được chứng minh có thể giúp hỗ trọ điều trị nhiều bệnh về đường hô hấp, bao gồm cả các bệnh nghiêm trọng như hen suyễn, COPD (bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính), viêm phế quản, giúp

ức chế cơn co khí quản,v.v.[4]

1.1.3.5 Điều trị bệnh tim mạch

Phân tích hoá học cho thấy Cordyceps militaris có adenosine,

deoxy-adenosine, nucleotide adenosine và các loại nucleotide tự do khác,v.v

giúp giữ ổn định và điều chỉnh rối loạn nhịp tim Cordyceps militaris kết hợp với bài thuốc của đông y có thể hỗ trợ chữa trị các bệnh về tim

Ngoài ra, các digoxin, hydrochlorothiaside, dopamine và dobutamine trong đông trùng hạ thảo giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của các bệnh nhân suy tim mãn tính, như làm tăng các điều kiện chung về thể chất, sức

khoẻ, chức năng tim[4]

Trang 22

1.1.3.6 Tăng sức bền

Liều 3 g Cordyceps militaris mỗi ngày cho kết quả tốt trong việc gia

tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mạn tính Một thí nghiệm thực hiện năm 2004 tại Mỹ cho thấy những người ở độ tuổi 40-70 có

sức khỏe tốt nếu được dùng trích tinh Cordyceps militaris trong 12 tuần đã có

sự gia tăng sức bền thể lực so với nhóm đối chỉ dùng giả dược [4]

1.1.3.7 Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu

Nấm Cordyceps militaris có khả năng giảm lượng cholesterol xấu trong

máu đồng thời nâng cao hàm lượng cholesterol tốt trong cơ thể Đây là kết quả của công trình nghiên cứu từ 273 người tại Trung Quốc bị cao lipid máu, được biết trong quá trình nghiên cứu, mỗi người sử dụng 3g Cordyceps

militaris mỗi ngày [12,15]

1.2 Giới thiệu về Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris 1.2.1 Đặc điểm Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris

Polysaccharides là các phân tử carbohydrate polyme bao gồm chuỗi dài các đơn vị monosaccharide bị ràng buộc bởi các liên kết glycosidic và thủy phân cho các monosaccharides cấu thành hoặc oligosaccharides

Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là một galactomannan nhiều

nhánh Các hợp chất này bao gồm D-mannose và D-galactose với tỷ lệ 3:5, thường chứa một tỷ lệ nhỏ protein Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc α-D-mannopyranosyl ở mạch chính, có các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nhỏ Tuy nhiên, một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp

xỉ 7700 g/mol được phân tách gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9 Các phân tích cho thấy nó có một khung sườn α-D-glucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và các mạch nhánh của α-D-(1-6)-mannopyranose (Manp) được gắn vào khung sườn qua vị trí O-6 của gốc α-(1-3)-glucopyranosyl (Glcp) Nghiên cứu này cũng cho thấy dược tính của polysaccharid là từ các đặc tính của nó như trọng lượng phân tử, ví dụ như

Trang 23

các polyglucan có trọng lượng phân tử lớn hơn (10-1000 kDa) có xu hướng tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu quả hơn Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường miễn dịch cho cơ thể hơn

là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp [8,17]

Bảng 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của

quả thể và sợi nấm Cordyceps militaris

Một số loại đường Hàm lượng (mg/g khô)

(Nd: Không phát hiện được)

1.2.2 Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide từ quả thể nấm

Cordyceps militaris

Có rất nhiều nghiên cứu để tìm ra phương pháp tách chiết polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng như ứng dụng nhất định Bảng sau là một số kết quả nghiên cứu về tách chiết

Polysaccharides từ Cordyceps militaris

Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides

800C, chiết ba lần, thời

Trang 24

gian 90 phút là tốt nhất Shi và

Hàm lượng Polysscharide trong dịch nuôi cấy đạt 2.53 -6.74

Thu được hai thành phần polysacharide là CPS-1

và CPS2, hiệt suất chiết

1/20, thời gian 1 giờ, chiết 2 lần (3) Phương pháp chiết hồi lưu trong môi

trường kiềm:

nồng độ NaOH trong dung dịch chiết

là 0.7 mol/l, tỷ lệ chất chiết 1/8, thời

gian 0.5 giờ, chiết 3 lần

Hàm lượng polysaccharide đạt đối với 3 phương pháp cô cạn, đun hồi lưu, đun hồi lưu trong môi trường kiềm đạt ương tứng là: 20.25%; 22.6% và 1.49%

Trang 25

Thu được thành phần CM-hs-CPS2

Tinh sạch:

Hiện trạng về kỹ thuật tinh sạch Polysaccharide được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide

- Phương pháp hỗn hợp dung môi chloroform: butanol loại 97% hàm lượng protein Kết hợp phương pháp Sevag với triflouromethyl, trichloroethane thì loại được 96.2% protein Fengyao Wu

và cộng sự

[19]

- Sử dụng cột sắc ký trao đổi inon DEAE-Cellulos 52 để tinh sạch và lọc bằng cột lọc gel Sephadex G-

100

- Thu được hợp phần CM-Hs-CPS2 chứa ác thành phần manose, glucosse, galactose với

tỷ lệ 1.35:8.34:1.00 và được liên kết bởi nhóm α- glycosidic Hui Yan và

cộng sự [17]

- Sử dụng phương pháp Sevag và Enzym để loại protein với tỷ lệ 1/40 enzym trypsin 3%, tại pH 8, nhiệt

- Kết quả thu được hai thành phần CPS-1 và CPS2 ở dạng rắn

Trang 26

độ 650C, 1,5 giờ, tiếp tục sử dụng papain 2.5% ở pH 7, 50oC, 1 giờ

Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform/butyl alcolhol 1/5 (v/v),

ly tâm, thu cặn thêm Ethanol 90%,

để qua đêm Sử dụng cột sắc ký ion DEAE–Cellulose 52 để tinh sạch

1.2.3 Tác dụng dược lý của polysaccharide

Các polysaccharide có tác dụng dược lý tăng cường miễn dịch, bảo vệ tế bào gan, giảm mở máu, chống đột biến, giảm đường huyết, chống oxy hóa [3] Trong số các tác dụng trên, tác dụng kháng khối u của tế bào gan được đề cập nhiều hơn cả Các nghiên cứu dược tính của các hoạt chất trong sinh khối

Cordyceps militaris cho thấy có khả năng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et

al 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [3]

Hoạt tính kháng khối u mạnh của polysaccharides nhờ vào hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide - peptide do polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide

Ngoài cấu trúc 1/3 - β -glucans có khả năng kháng khối u đã được chứng minh trên cơ sở nghiên cứu lâm sàng, các nghiên cứu đã chỉ ra glucans

có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo của mình các phân tử thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose đã liên kết với các đơn vị khác trong chuỗi ở một số vị trí, với các chuỗi bên là các đơn vị

Trang 27

Cordyceps militaris Sinh khối Khối u ác tính, ung thư phổi

Ganoderma lucidum Quả thể Ung thư phổi, ung thư vú

Như đề cập ở trên tính chất dược lý của nấm Cordycep militaris chủ

yếu phụ thuộc vào các chất có hoạt tính sinh học: Cordyceps polysaccharide, Cordycepin, orgesteron, nucleoic…

1.3 Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ quả thể nấm

Cordycep militaris

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Polysaccharide trên thế giới

Một số nghiên cứu đã được thực hiện về tách chiết và tinh sạch các polysaccharide từ nấm trên thế giới như:

Theo (Li et al.2006) đã nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và hoạt động

chống oxi hóa của polysaccharide từ C.militaris Hiện nay, quả thể C.militaris

có sẵn như là nguyên liệu làm thuốc và sức khỏe sản phẩm thực phẩm ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Đông Nam Á Hoạt tính sinh học Polysaccharide

là phổ biến trong các loại nấm, và hầu hết có cấu trúc ở các loài khác nhau Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định chính xác các cấu trúc khác nhau của polysaccharide Trong nghiên cứu này, CM-hs-CPS2 được chiết

xuất từ C.militaris nuôi trồng trên môi trường gạo rắn Các kết quả của các

thành phần cẩu trúc của nó đã chỉ ra CM-hs-CPS2 được hình thành từ

Trang 28

mannose, glucose và galactose với tỉ lệ mol 1.35: 8.34 :1.00 CM-hs-CpS2 gồm có pyranose và liên kết bởi -glycosidic liên kết, là một loại polysaccharide có tính axit sulfate chứa aceamido nhóm Trong vài năm qua,

những đặc điểm cấu trúc của nhiều polysaccharide thu được từ C.militaris đã

được báo cáo [17]

Hai polysacharide (CPS-2 và CPS-3) được phân lập từ C.militaris nuôi

bởi Yu CPS-2 bao gồm chủ yếu là các loại đường rhamnose, glucose và galactose với tỉ lệ mol 1:4,46: 2,43 CPS-3 là một polysaccharide, mà chứa glucose với một liên kết của -D-glucose (Yu et al., 2004) Sau đó,

polysaccharide P70-1 cũng thu được từ quả thể của C.militaris (Yu et al., 2007) Với môi trường axit polysaccharide phân lập từ C.militaris trồng tên

đậu tương nảy mầm gồm có galactose, arabinose, xylose, rhamnose và acid galacturonic (Ohta et al., 2007) Lee và cộng sự của ông đã báo cáo thuộc tính cấu trúc CPMN Cha II và CPMN Cha III được lấy từ các sợi nấm nuôi của

C.militaris CPMN Cha II là một galactomannan 1,6-nhành-glucan với -liên kết và cấu thép cuộn thành ngẫu nhiên (Lee et al., 2010a) CPMN Cha III là một -1,4-nhánh -1,6-galactoglucomannan (Lee et al., 2010b) Các tế diễn giải của polysaccharide khác biệt cấu trúc từ kết quả trên thân thể đến một

thực tế rằng họ đã chủng C.militaris khác nhau Hơn nữa, môi trường nuôi

cấy khác nhau( tằm nhộng, trung bình gạo rắn và nước dùng) có thể góp phần cấu trúc khác nhau của polysaccharide [12]

Sun và cộng sự nghiên cứu các điều kiện khai thác trên C.sinensis sợi

nấm và thấy rằng tỉ lệ của nguyên bột nguyên liệu và nước là 1:2,5, thới gian chiết là 24h và pH 7,5-8,0 là tốt, thấy rằng nhiệt độ là yếu tố quan trọng đối với việc chiết polysaccharide Kết quả tốt nhất thu được khi tiến hành tách chiết và thực hiện hai lần với 0,1g của sợi nấm bột trong 20ml nước cất (pH=4,2) ở 100℃ trong 70 phút [11]

Wang et al tiến hành nghiên cứu sự khác biệt trong phương pháp khai

thác polysaccharide từ C.militaris, bằng phương pháp siêu âm với dung môi:

Định dạng
Số trang	56
Dung lượng	3,5 MB