Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể trồng nấm cordyceps militaris

Chính vì vậy gần đây các phương pháp để tách chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ sợi nấm và giá thể Cordyceps militaris được quan tâm và nghiên

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH i

LỜI CẢM ƠN

L ời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ

thu ận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại đây

M ở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại

tr ường và thực hiện luận văn này

Cu ối cùng tôi muốn gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập

th ể lớp 13-01 Khoa Công Nghệ Sinh Học đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi

Sinh viên

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris 3

1.1.1 Đặc điểm của nấm Cordyceps militaris 3

1.1.2 Thành phần hoá học chính của nấm Cordyceps militaris 5

1.1.2.1 Cordycepin 5

1.1.2.2 Adenosine 6

1.1.2.3 Polysaccharide 7

1.1.2.4 Acid cordycepic 8

1.1.2.5 Nucleotides 8

1.1.2.6 Sterol 9

1.1.2.7 Protein và các axit amin 9

1.1.2.8 Axit béo và nguyên t ố kim loại 10

1.1.3 Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris 11

1.1.3.1 C ải thiện chức năng gan 11

1.1.3.2 Gi ải độc thận 11

1.1.3.3 Gi ảm đường huyết 12

1.1.3.4 Ch ống rối loạn tình dục 12

1.1.3.5 T ăng sức bền, chống mệt mỏi 12

1.1.3.6 Ch ống lão hoá 12

1.2 Giới thiệu về Polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps militaris 13

1.2.1 Đặc điểm Polysaccharide trong giá thể nấm Cordyceps militaris 13

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH iii

1.2.2 Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris 14

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ Cordyceps militaris 16

1.2.3.1 Tình hình nghiên c ứu Polysaccharide từ Cordyceps militaris trên th ế giới 16

1.2.3.2 Tình hình nghiên c ứu nuôi trồng Cordyceps militaris ở Việt Nam 20

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Thiết bị và hoá chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tách chiết Polysaccharide từ giá thể trồng nấm Cordyceps militaris 24

2.2.1.1 Kh ảo sát phương pháp chiết 24

2.2.1.2 Kh ảo sát điều kiện chiết 25

2.2.2 Xác định hàm lượng Polysaccharide theo phương pháp phenol-sulfuric của Michel Dubois, K A Gilles và cs, 1956 25

2.2.3 Thu nhận polysaccharide bằng phương pháp kết tủa 28

2.2.4 Phân tích nhóm chức của Polysaccharide bằng IR: 29

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tách chiết Polysaccharide 30

3.1.1.Nguyên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết 30

3.1.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mẫu/dung môi 32

3.1.3 Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết 33

3.1.4 Nghiên cứu xác định thời gian chiết 34

3.2 Bước đầu xây dựng quy trình tách chiết 35

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

3.3 Bước đầu xác định các nhóm chức của polysaccharide tách chiết

được 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

Kết luận 44

Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong tự nhiên 4

Hình 1.2: C ấu trúc hoá học của Cordycepin 6

Hình 1.3: C ấu trúc hoá học của adenosine 6

Hình 1.4: C ấu tạo hoá học của một số Nucleotides 9

Hình 1.5: Công th ức cấu tạo Polysaccharide 13

Hình 2.1: Cordyceps militaris nuôi c ấy tại Viện Hoá học-Vật liệu KH&CN quân sự 22

Hình 2.2: Giá th ể và bột để tách chiết 22

Hình 2.3: Máy siêu âm 23

Hình 2.4: S ơ đồ quy trình tách chiết Cordyceps polysaccharide 24

Hình 2.5: M ẫu đo đường chuẩn 27

Hình 2.6: Đồ thị đường chuẩn glucose (
/) 27

Hình 2.7: Máy ép thu ỷ lực 29

Hình 2.8: Máy đo phổ hồng ngoại IR 29

Hình 3.1: K ết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu Cordyceps militaris 31

Hình 3.2: K ết quả khảo sát sự thay đổi tỷ lệ mẫu/dung môi 32

Hình 3.3: K ết quả khảo sát nhiệt độ 33

Hình 3.4: K ết quả khảo sát thời gian 34

Hình 3.5: S ơ đồ tách chiết polysaccharide 36

Hình 3.6: Ph ổ hồng ngoại IR của mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết quả nghiên c ứu của Fengyao Wu 41

Hình 3.7: Ph ổ hồng ngoại IR của mẫu P1 42

Hình 3.8: Ph ổ hồng ngoại IR của mẫu P2 42

Hình 3.9: Ph ổ hồng ngoại IR của mẫu P3 43

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

DANH MỤC BẢNG

B ảng 1.1: Phân loại khoa học 3

B ảng 1.2: Hàm lượng các axit béo trong Cordyceps militaris 10

B ảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide thu nhận từ một s ố loại nấm 15

B ảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides 19

B ảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm 23

B ảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris 40

B ảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu 43

Khoá luận Tốt Nghiệp 2017

Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

Spp Species flural – nhiều loài

EPS Exopolysaccharide – polysaccharide ngoại bào

P1 Polysaccharide thu được sau khi chiết với nước nóng P2 Polysaccharide thu được sau khi bổ sung NaOH 4% P3 Polysaccharide thu được sau khi bổ sung cồn

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, rất nhiều loài nấm được quan tâm đến như nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng phục vụ chăm sóc sức khoẻ con người ngày một tăng lên Ngoài ra chúng được các nhà nghiên cứu y dược học hết sức chú ý vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học có trong mỗi loại

Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm

như Cordyceps sisnensis (Berk.) hoặc Cordyceps militaris (L Ex Fr).link lên

ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp nhất là ấu

trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus armoricanus Là một

loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến Sách y học

cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc để bồi

bổ sức khoẻ người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như cải thiện chức năng phổi và thận, chống ung thư điều hoà miễn dịch và tác dụng hạ huyết áp Mặt khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ với cơ thể người

chính của Đông trùng hạ thảo, trong đó đã được chứng minh như chống ung thư, điều hoà miễn dịch và tác dụng chống oxy hoá đáng lưu ý Chính

vì vậy gần đây các phương pháp để tách chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá

cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ sợi nấm và giá thể Cordyceps

militaris được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi Khi đó sẽ có thể ứng dụng

để sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu

sóc sức khoẻ con người

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 2

Nội dung nghiên cứu cần giải quyết:

- Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể trồng nấm Cordyceps militaris

- Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

1.1.1 Đặc điểm của nấm Cordyceps militaris

Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm

như Cordyceps sisnensis hoặc Cordyceps militaris lên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp nhất là ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặcHepialus armoricanus Vào mùa đông, nấm

côn trùng và làm cho côn trùng chết, khi đó nấm tồn tại trong cơ thể côn trùng dạng hệ sợi và là giai đoạn vô tính Đến mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm không khí cao, hệ sợi nấm vô tính tiến hành giao phối và chuyển giai đoạn hữu tính, hình thành cây nấm (chất đệm) là cơ quan chứa bào tử vô tính và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Các loài nấm này phân bố rộng

ở châu Á, châu Úc vùng Đông Á, đặc biệt là các cao nguyên cao hơn mặt biển

từ 4000-5000m như Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam, (Trung Quốc) [1,11]

Bảng 1.1: Phân loại khoa học

Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên có hai loại

chính người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH

và Cordyceps militaris Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu ở vùng

núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan Loài

nấm Cordyceps militaris, phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ

2000-3000m so với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể như cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của

loài Cordyceps sinensis Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu chính của loại nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như sau: kìm

hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005) [6], ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001)[18] Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M.,

2004, Balaban R.S et al., 2005) Với giá trị hết sức có ý nghĩa đối với ngành y dược như vậy thì việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm nhằm nhân nuôi

hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết là vô cùng quan trọng, đây là cơ sở để bảo tồn được nguồn gen quý và gây trồng quả thể trong giá thể nhân tạo

Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong tự nhiên

1.1.2 Thành phần hoá học chính của nấm Cordyceps militaris

Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris có 17 axít amin khác nhau, D-mannitol,

lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu, K, Na, Mg, Zn, Si ) Theo số liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc,

thành phần hóa học của thể quả nấm Cordyceps militaris như sau:

+ Protein chiếm 40,69%

+ Các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam)

+ Các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm)

+ Hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%),

cordycepic axit (11,8%), polysaccharide (30%),(Shih et al, 2007)[19]

1.1.2.1 Cordycepin

Hợp chất cordycepin là một hợp chất quan trọng, quyết định phẩm chất, chất lượng của nấm Đông trùng hạ thảo (Mina Masuda et al., 2005) Cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một dạng nucleotide có hoạt tính sinh học phổ rộng, thường được chuyển đổi thành 5’-mono, di và triphosphate, hợp chất này ức chế sự hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư [6] Sản lượng cordycepin thu được từ thể quả nấm phụ thuộc vào khối lượng theo thể tích dung môi chiết xuất, thời gian chiết xuất và nồng độ của cồn làm dung môi [2] Sản lượng đạt cực đại khi sử dụng cồn có nồng độ 20,21%, thời gian chiết xuất là 101,88 phút, khối lượng dung môi là 33,13 ml/gam thể quả nấm (Jiang-Feng Song et al., 2007) [15]

Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus Gần đây hơn, cordycepin cũng cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm của

Trương Thuỳ Trang – 1301

interleukins trong tế bào lympho T

2000 [18]

Hình 1.

1.1.2.2 Adenosine

Adenosine xuất hi

hầu hết các loài Cordyceps v

Khi thu nhận nấm Cordyceps trong t

bào lympho T, do Ahn và cộng sự đã chứ

1.2: Cấu trúc hoá học của Cordycepin

t hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú

t các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tớ

m Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ

2,45±0,03mg/g trong quả thể,ở C sinensis hàm lượng là 1,643±0,03 mg/g, trong

ng trong sợi nấm Cordyceps militaris lên men là 1,592±0,03

o vệ tim mạch, bảo vệ gan thận rất tốt

Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của adenosine

ứng minh năm

c cho là phong phú ở

ới 14,15 mg/g adenosine là 1,643±0,03 mg/g, trong lên men là 1,592±0,03

c cho là có tác dụng

1.1.2.3 Polysaccharide

Nấm Cordyceps spp được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản

xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh Chúng chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di-, và các

oligosaccharide, và nhiều polysaccharides phức tạp (gồm có cyclofurans

(đường 5C, mạch vòng, chưa rõ chức năng), beta-glucans; beta-mannans; và

phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-) Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans với các mối liên kết glycosidic

chứa các liên kết: (1/3) - (1/6) - β glucans và (1/3) - 1 – glucans [11]

Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides

đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được

thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào

ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid

glucuronic Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein

hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide

- peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn Cấu trúc 1/3 - β - glucans

có khả năng kháng khối u được biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân

tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose Heteroglycans là một nhóm lớn

fucans, xylans, và mannans

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 8

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là

các đường monosaccharide, mannose và galactose Kết quả nghiên cứu cho

thấy hai loại polysaccharides này có khả năng phục hồi các tổn thương gan

do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Yan và cộng sự cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các

1.1.2.4 Acid cordycepic

Theo dược điển của Trung Quốc, acid cordycepic hay D-manitol, một đồng phân của acid quinic với cấu trúc polyol chiếm khoảng 9% trong

được sử dụng như một dấu hiệu trong kiểm soát chất lượng nuôi cấy nấm C

1957, đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau phẫu thuật cắt thận, làm giảm ho và hen suyễn Đặc biệt acid cordycepic có thể cung cấp sự bảo vệ hiệu quả trong điều trị các bệnh nhân sau nhồi máu não và chấn thương, chẳng hạn như cải thiện vi tuần hoàn não và lưu lượng máu não, thúc đẩy phục hồi thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu cục

bộ, giảm điều tiết áp lực nội sọ, và giảm sự hình thành dịch não tủy và não mô hàm lượng nước

1.1.2.5 Nucleotides

Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần

khá đa dạng trong nấm Cordyceps Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine

có hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều

kiện nhân tạo hàm lượng của nucleotide thường cao hơn Cordycep spp tự nhiên Nucleotides trong Cordyceps tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của

nucleotides trong suốt quy trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide

trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn

Hình 1.4: Cấu tạo hoá học của một số Nucleotides

1.1.2.6 Sterol

Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của

vitamin D2, có giá trị dược liệu quan trọng Ergosterol trong C sinensis có

thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991

[16], được cho là chất ophiocordin, ở Cordyceps pseudomilitaris là chất

bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân

tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C militaris Hàm lượng ergosterol trong quả thể nhân tạo của Cordyceps rất cao (10,68mg/g) cao hơn

nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44mg/g [17]

1.1.2.7 Protein và các axit amin

Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33%

Protein này bao gồm 18 loại amino acid, gồm có aspartic, threonine, serine, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine, histidine, cystine, cysteine trong đó các thành phần có tác dụng dược

lý chính là arginine, glutamate, tryptophan và tyrosine

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 10

Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể

nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh

khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm).Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) trong quả thể Số liệu phân tích của Chang và cộng sự (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001)

1.1.2.8 Axit béo và nguyên tố kim loại

Acid béo bao gồm carbon, hydro và oxy là thành phần chính của lipid, phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và

không no ở Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có

C16:1, C17:1, C18:1,C18:2 Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch Chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B12 và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe,

Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V [15]

Axit béo Phần trăm acid béo tổng (%)

1.1.3 Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris

Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sử dụng nấm

viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục Viện nghiên cứu nội tiết Thượng

Hải (Trung Quốc) cũng đã dùngCordyceps militaris để điều trị cho các bệnh

nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt

1.1.3.1 Cải thiện chức năng gan

monosaccharide, mantose và galactose Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại

tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Yan et al , 2008 cho rằng

tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hoá của các Polysaccharide[15]

1.1.3.2 Giải độc thận

Rất nhiều công trình y học hiện đại đã xác nhận là nhờ nấm có khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị

từ 3-5g Cordyceps militaris/ngày Kết quả cho thấy chức năng thận được

cải thiện đáng kể Một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận do

sử dụng geltamixin, người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng

89% chức năng thận được phục hồi Kiểm nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là Cordyceps militaris đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [1]

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 12

1.1.3.3 Giảm đường huyết

máu Các nhà khoa học đã nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95% bệnh nhân được cải tiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3g nấm/ngày, hiệu quả đạt được

là do tác nhân ung thư phổi đã được uống 6g Cordyceps militaris/ngày cùng

với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46% [1,3]

1.1.3.4 Chống rối loạn tình dục

giới bao gồm giảm ham muốn lãnh cảm, liệt dương Nghiên cứu đã được tiến hành ở Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn sau 40 ngày sử

dụng 3g Cordyceps militaris/ngày thì có 64,8% bệnh nhân đã được cải thiện

được tình trạng tình dục Đối với nữ giới, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, chứng đa khí hư cũng được cải thiện [1,7]

1.1.3.5 Tăng sức bền, chống mệt mỏi

Theo báo cáo thì khi sử dụng mỗi ngày 3g Cordyceps militaris thì kết

quả làm tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính Năm 2004 tại MỸ các nhà khoa học đã làm thí nghiệm cho người 40-70

tuổi, nếu sử dụng Cordyceps militaris trong 12 tuần thì sự tăng sức bền

thể lực sức mạnh được cải thiện ở cả hai yếu tố là gia tăng Adenosin triphosphate (ATP) và giải phóng năng lượng ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy hoá của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [1,7]

1.1.3.6 Chống lão hoá

chống oxy hoá nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể

1.2 Giới thiệu về Polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps militaris

1.2.1 Đặc điểm Polysaccharide trong giá thể nấm Cordyceps militaris

lớn monosaccharide được liên kết với nhau bởi O-glycosidic Một liên kết glycosidic được hình thành từ một nửa là glycosyl của hemiacetal kết hợp với nhóm hydroxyl của mono khác để hình thành nên một đơn vị glycosyl trong

chuỗi polysaccharide Polysaccharide có cấu trúc mạch thẳng hoặc phân nhánh, tuỳ theo số lượng các monome chứa trong polysaccharide mà được

chia thành hai nhóm: homopolysaccharide chỉ bao gồm một loại monosaccharide và heteropolysaccharide được hình thành từ hai hay nhiều chủng loại monosaccharide

Hình 1.5: Công thức cấu tạo Polysaccharide

Các glycosidic liên kết với nhau tại các vị trí, như liên kết α – (1/2), (1/3), (1/4) hay β – (1/2), β – (1/3), β – (1/4) Cả hai homopolysaccharide và heteropolysaccharide có thể chứa các liên kết dạng α, β phụ thuộc vào đơn vị hình thành nên chúng Các heteropolysaccharide không chỉ khác nhau về đơn

vị cấu tạo, số lượng và trình tự của các đơn vị monosaccharide mà chúng cũng khác nhau về trình tự của các mối liên kết glycosidic Điều này dẫn đến

một đa dạng gần như vô hạn trong cấu trúc của các polysaccharide

Các polysaccharide chính trong nấm Cordyceps có một số dạng glucans

với các mối liên kết glycosidi được hình thành từ liên kết (1/3) – (1/6) – β

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 14

glucans và (1/3) – 1 – glucans Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp

chính của polysaccharide được chứng minh kháng khối u, trong khi với

có thể được giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hoá học

của các polysaccharide

1.2.2 Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris

Kết quả nghiên cứu từ các công bố khoa học cho thấy nấm C.militaris

được nhiều nghiên cứu khẳng định tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh, đồng thời cũng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm hiện nay, ví dụ như trong điều trị ung thư, điều hòa miễn dịch, suy giảm chức năng gan, thận… (Seulmee et al., 2009; Shonkor, 2010)[4]

Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung

thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid

glucuronic Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein

hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide – protein hoặc polysaccharide – peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn Cấu trúc 1/3 – β – glucans có khả năng kháng khối u được biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose

Chủng nấm Nguồn thu nhận

Polysaccharide Kháng khối u dạng

Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide thu nhận từ

một số loại nấm

Đặc tính kháng khối u của các polysaccharides có thể bị ảnh hưởng bởi kích thước củaphân tử, mức độ phân nhánh, hình thức, và khả năng hòa tan trong nước

Nói chung, các polysachcharidecàng có trọng lượng phân tử lớn và hòa tan trong

nước tốt có khả năng kháng khối u cao hơn Một số nghiên thu được trên lâm sàng cho biết về khả năng kháng khối u cao thuộc về phức hợp polysaccharide - protein tách ra từ quả thể, đây là các heteropolysaccharides có chứa galactose, glucose,

mannose và fucose [6,9,15] Hầu hết các Polysaccharide công bố có hoạt động

kháng u đã biết đều có cấu trúc cơ bản β-glucan chỉ khác nhau về loại hình liên kết glucosidic [17] Do vậy, hoạt động chống khối u đòi hỏi có cấu trúc đặc trưng như liên kết β-(1-3) trong chuỗi chính của glucan và thêm vào đó là nhánh β-(1-6) Nếu β-glucan chủ yếu là mạch thẳng, chứa các nhánh không quá dài, chúng sẽ cho

thấy hoạt động chống ung thư Polysaccharide cho thấy khả năng chống tế bào

ung thư có thể chứa các cấu trúc khác nhau như hetero-glucan, heteroglycan, glucan-protein, α-manno-β-glucan liên kết glucoside [15]

β-Hợp chất exopolysaccharide (EPS) là một polysaccharide ngoài bào, có thể được thu nhận bằng lên men chìm từ một số loài nấm lớn Một số nghiên cứu đã

rất thành công trong thu nhận EPS và sinh khối nấm Cordyceps trong lên men

Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 16

chìm trên môi trường gồm glucose-peptone-cao nấm men với lượng EPS cao nhất

là (0,2-1,01g/L) thu được sau từ 7-15 ngày lên men Lượng sản phẩm thu được thường trùng với động học phát triển hệ sợi, hình thái nấm và trạng thái dinh dưỡng Trong số các các nghiên cứu, sản phẩm tổng hợp ngoại bào ở một số

chủng nấm Cordyceps đạt được có mức độ cao khi lên men trên môi trường khoai

tây-malt-peptone Như vậy, sự tích lũy EPS trong nuôi lỏng tương quan chặt chẽ với lượng sinh khối nấm tạo ra Sự sinh tổng hợp các dạng EPS trong lên men chìm sẽ phụ thuộc đặc điểm sinh học của các chủng nấm Hơn nữa, sự sản xuất

định các enzyme, ngăn cản sự mất nước của sợi nấm, lưu trữ các chất dinh dưỡng

thế kỷ trước nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu nuôi các chủng nấm Cordyceps sp

trong điều kiện nhân tạo Năm 1982, Shen Nanying tại Viện Nghiên cứu Tứ

Xuyên đã tách và nuôi thành công chủng Cordyceps sp CS4 trong môi trường

nhân tạo Chủng nấm CS4 sau quá trình tinh sạch trải quả quá trình lên men trong điều kiện vô trùng với các điều kiện tương tự như điều kiện tự nhiên của vùng núi Tây Tạng như nhiệt độ thấp, thành phần không khí được tối ưu hóa về nồng độ nitơ, carbondioxide, carbonmonoxide và oxy chỉ có mức độ thấp Với qui trình lên men bề mặt, sản phẩm thu được đã được thử nghiệm lâm sàng trên 2000 bệnh nhân đang điều trị ung thư đã đem nhiều kết quả tốt, từ đó các sản phẩm thuốc có

bổ sung sinh khối nấm Cordyceps sp CS4 ngày càng được sự dụng rộng rãi và

nổi tiếng trên toàn thế giới [16]

Theo (Li et al., 2006) đã nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và hoạt động

chống oxy hoá của Polysaccharide từ C.militaris Hiện nay, quả thể C.militaris có

sẵn như là nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm thực phẩm tăng sức khoẻ ở Trung

Quốc, Hàn Quốc và Đông Nam Á Hoạt tính sinh học Polysaccharide là phổ biến

trong các loại nấm, hầu hết có cấu trúc ở các loài khác nhau Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định chính xác cấu trúc khác nhau của chúng Trong nghiên

cứu này, CM-hs-CPS2 được chiết xuất từ C.militaris được nuôi trồng trên môi

trường gạo rắn Các kết quả của các thành phần cấu trúc của nó đã chỉ ra CPS2 được hình thành từ mannose, glucose và galatose với tỷ lệ mol 1,35: 8,34: 1,00 CM-hs-CPS2 gồm có pyranose và liên kết bởi α-glycosidic liên kết, là một

CM-hs-loại polysaccharide có tính axit sulfate chứa nhóm acetamido[16]

Yu et al., đã phân lập ra ba polysaccharide từ C.militaris ký hiệu CPS-1,

CPS-2 và CPS-3 Phân tích quang phổ cho thấy các monosaccharide CPS-1 là rhamnose, xylose, mannose, glucose và galactose với tỷ lệ mol 1: 6,43: 25,6: 16: 13,8, có các liên kết 1-2-mannose, 1-4-xylose, 1-2 hoặc 1-3-rhamnose liên kết với galactose trong cấu hình β CPS-2 bao gồm chủ yếu là các loại đường rhamnose, glucose và galactose với tỷ lệ mol 1: 4,46: 2,43 [10] CPS-3 là một

2004) Yang et al thu được sáu polysaccharides từ C.militaris sau khi làm sạch bằng sắc ký DEAE-cellulose 52 và Sephacryl S-100 HR, ba polysaccharides phân

số đã thu được: P50-1, P70-1 và P70-2 [10]

Với môi trường axit polysaccharide phân lập từ C.militaris trồng trên đậu

tương nảy mầm gồm có galactose, arabinose, xylose, rhamnose và axit galacturonic (Ohta et al., 2007) [20] Lee và các cộng sự của ông đã báo cáo thuộc tính cấu trúc của CPMN Cha II và CPMN Cha III được lấy từ các sợi nấm nuôi

của C.militaris CPMN Cha II là một galactomannan 1,6-nhánh-glucan với β-liên

kết và cấu tạo cuộn ngẫu nhiên (Lee et al., 2010) CPMN Cha III là một nhánh β-1, 6-galactoglucomannan (Lee et al., 2010) Môi trường nuôi cấy khác

β-1,4-Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH 18

nhau (tằm nhộng, lượng gạo và nước dùng) có thể góp phần tạo ra cấu trúc khác

nhau của polysaccharide [6,20]

Wang et al tiến hành nghiên cứu sự khác biệt trong phương pháp khai thác

cồn Kết quả cho thấy C.militarispolysaccharide thô đạt 10,97% khi thực hiện với

nước và 80% công suất khi có sự hỗ trợ của vi sóng trong 20 phút [12]

chúng có thể được nuôi cấy tốt trong môi trường rắn hoặc lỏng Huang và cộng sự

đã nghiên cứu các thành phần của bột quả thể và sợi nấm của C.militaris và nhận thấy rằng hàm lượng đường tổng là 260,64 và 389,47 mg/g, nhưng sự giảm hàm lượng đường trong quả thể lại cao hơn trong sợi nấm khi thu nhận từ tự nhiên và

nuôi nhân tạo Trong môi trường nhân tạo, lượng polysaccharide trong sinh khối

800C, chiết ba lần, thời gian 90 phút là tốt nhất Shi và

cộng sư

[13]

Chiết từ quả thể: Sử dụng nước và sóng

vi ba, tỷ lệ chất chiết: nước: 2:4, thời gian sử dụng sóng vi ba 20 phút

Hàm lượng Polysaccharides đạt 10.7%

Hàm lượng Polysscharide trong dịch nuôi cấy đạt 2.53 -6.74 g/l

Thu được hai thành phần polysacharide là CPS-1

và CPS2, hiệt suất chiết đạt 0.82%

1/20, thời gian 1 giờ, chiết 2 lần (3) Phương pháp chiết hồi lưu trong môi trường kiềm:

nồng độ NaOH trong dung dịch chiết

là 0.7 mol/l, tỷ lệ chất chiết 1/8, thời gian 0.5 giờ, chiết 3 lần

Hàm lượng polysaccharide đạt đối với 3 phương pháp cô cạn, đun hồi lưu, đun hồi lưu trong môi trường kiềm đạt ương tứng là: 20.25%; 22.6% và 1.49%

Polysaccharide bằng ethanol

Thu được thành phần CM-hs-CPS2

Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides