Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch kháng sinh doxorubicin từ chủng đột biến streptomyces peucetius MH9 2

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH KHÁNG SINH DOXORUBICIN TỪ CHỦNG ĐỘT BIẾN STREPTOMYCES PEUCETIUS MH9.2 Giáoviênhướngdẫn: TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực hiện: Vũ Thị Quỳnh Mai Lớp: CNSH - 12.02 HàNội - 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắcem xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Tạ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô quý báu lòng nhiệt tình suốt trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập môi trường khoa học hoàn thiện Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ sư công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình học tập hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian khả thân hạn chế, khóa luận em không tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo thầy cô đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Quỳnh Mai VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường ISP2 ……………………………….19 Bảng 2.2 Thành phần 1000ml môi trường NDYE gồm: 19 Bảng 2.3 Môi trường LB 20 Bảng 2.4: dụng cụ thiết bị 21 Bảng 3.1: khảo sát pH thích hợp cho hấp thụ kháng sinh 42 Bảng 3.2: Khảo sát pH thích hợp cho liên kết kháng sinh 42 VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC HÌNH Hình 1.2: Công thức cấu tạo hóa học DXR 12 Hình 2.1: Chủng xạ khuẩn S.peucetius MH9.2……………… ………… 18 Hình 3.1: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp kháng sinh ………………………………………… 33 Hình 3.2: biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp kháng sinh 34 Hình 3.3 Khả tách chiết kháng sinh giá trị pH khác dịch lên men phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh 34 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH dịch nuôi đến khả tách chiết kháng sinh 35 Hình 3.5: Thử hoạt tính kháng khuẩn 36 Hình 3.6: Khảo sát thời gian khuấy trộn trình trích ly 36 Hình 3.7: thử hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc 37 Hình 3.8: kháng sinh thu đem thử hoạt tính khoanh giấy lọc 38 Hình 3.9: khảo sát hệ dung môi thích hợp phương pháp TLC 41 Hình 3.10: Thu nhận phân đoạn 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 38, 40 42 tinh kháng sinh 43 Hình 3.11: Đĩa thử hoạt tính kháng khuẩn kiểm tra độ tinh kháng sinh 47 Hình 3.12: Phân tích độ tinh sản phẩm TLC 47 Hình 3.13.a Kháng sinh thô sau tách thu nhận phân tích HPLC 48 Hình 3.13.b Kháng sinh tinh nồng độ 0,100µg.ml-1 phân tích HPLC 48 VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HSCC Hệ sợi chất DXR Doxorubicin Gr (-) Gram dương Gr (+) Gram âm ISP2 The International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) LB Luria Bertani TLC Thin Layer Chromatography VSV Vi sinh vật D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo milimet HSKS Hế sợi khí sinh L Lit HPLC Hight Performance Liquid Chromatography VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 1.1.2 Khái niệm kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 1.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius MH9.2 1.4 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 10 1.4.1 Giới thiệu chung kháng sinh Doxorubicin 10 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 11 1.4.3 Cấu trúc kháng sinh Doxorubicin 12 1.4.4 Cơ chế hoạt động Doxorubicin 12 1.4.5 Ứng dụng điều trị Doxorubicin 14 1.5 Phương pháp sắc ký trao đổi ion tinh kháng sinh 15 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 17 PHẦN 18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường VSVvà thiết bị 18 2.1.1 Vật liệu môi trường nuôi cấy chủng VSV 18 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiếtbị 20 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 23 2.3.2 Phương pháp bảo quản giống 25 VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh 25 2.3.4 Phương pháp khảo sát điều kiện thu nhận kháng sinh DXR thô 27 2.3.5 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) 29 2.3.6 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô phòng thí nghiệm 31 2.3.7 Phương pháp khảo sát điều kiện tinh kháng sinh DXR thô 31 2.3.8 Phương pháp sắc ký hiệu cao HPLC 32 PHẦN 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lựa chọn điều kiện thích hợp lên men sinh tổng hợp kháng sinh DXR 33 3.1.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh kháng sinh 33 3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp kháng sinh 33 3.1.4 Ảnh hưởng pH dịch nuôi đến khả sinh tổng hợp kháng sinh DXR 34 3.2 Nghiên cứu qui trình tách chiết kháng sinh thô quy mô thí nghiệm 35 3.2.1 Ảnh hưởng pH dịch nuôi đến tách chiết kháng sinh 35 3.2.2 Lựa chọn dung môi thích hợp để tách kháng sinh 35 Hệ dung môi 36 Kích thước vòng kháng khuẩn 36 Methanol: chloroform 1:9 36 D=2.5cm 36 Ethylacetate 36 D=2cm 36 Chloroform 36 D=1.8cm 36 n - Butanol 36 D=0.9cm 36 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian khuấy trộn trình tách kháng sinh 36 3.2.3 Các thí nghiệm thu nhân kháng sinh DXR thô 37 3.2.4 Quy trình thu nhận kháng sinh DXR 38 VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3.3 Tinh kháng sinh qui mô phòng thí nghiệm 41 3.3.1 Khảo sát hệ dung môi tinh DXR phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 41 3.3.2 Khảo sát pH thích hợp kháng sinh hấp phụ với resin 42 3.3.3 Khảo sát pH nhả hấp phụ kháng sinh với resin 42 3.3.3 Tinh kháng sinh trao đổi cột ion quy mô phòng thí nghiệm 43 3.4 Qui trình tinh kháng sinh quy mô phòng thí nghiệm 44 3.5 Đánh giá kháng sinh phân tích sản phẩm tinh 47 3.5.1 Phân tích khả kháng khuẩn kháng sinh 47 3.5.2 Phân tích kết tinh TLC 47 3.5.3 Phân tích sản phẩm HPLC 48 PHẦN 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Đề xuất 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học môn tập hợp ngành khoa học công nghệ bao gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, công nghệ học, nhằm tạo quy trình công nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, tế bào động, thực vật để sản xuất sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội bảo vệ môi trường CNSH ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho nhu cầu sống dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe… Bằng kiến thức sinh học thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn,… nhà khoa học cố gắng tạo trồng, vật nuôi có suất chất lượng cao, loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho người Theo tin ung thư Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) số 297 tháng năm 2011, ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu toàn giới Tỉ lệ tử vong ung thư năm 2008 chiếm 13% với số lượng 7,6 triệu người số 57 triệu ca tử vong bệnh tật toàn cầu Ung thư có phận thể Không thể dễ dàng kể hết tên loại ung thư phát thời điểm Một tính xác định ung thư tế bào bất thường phát triển nhanh chóng vượt giới hạn thông thường nó, xâm nhập vào phận liền kề lây lan sang quan khác thể – trình gọi “di căn” nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh Theo nhiều nguồn tài liệu khác từ 4.000 năm trước Ai Cập cổ đại Trung Hoa cổ biết tới bệnh lý khối u Hiện ung thư hiểu mức độ phân tử người hiểu rõ chế hình thành tế bào ung thư VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Như suốt khoảng 5.000 năm lịch sử, loài người hiểu chất bệnh ung thư, nhiên việc phòng tránh chữa ung thư thách thức to lớn toàn nhân loại Với tình hình tốc độ phát triển nay, theo Tổ chức Y tế Thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người đối mặt với số tử vong bệnh ung thư tăng lên 11 triệu người toàn giới Nhưng số nước phát triển Hoa kỳ, theo thống kê tổ chức ung thư Hoa kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong bệnh ung thư thập kỷ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người năm 1991 xuống 175/100.000 người năm 2010 Điều chứng tỏ vai trò vô quan trọng chất kháng sinh tham gia vào trình điều trị ung thư Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bang quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu,… Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điểm vượt trội có phổ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình tổng hợp tế bào ung thư Chính vậy, song song vớ việc tìm kiếm loại thuốc kháng sinh trị bệnh ung thư việc nâng cao hiệu suất trình tổng hợp loại kháng sinh biết đóng góp phần không nhỏ chiến chống ung thư Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết tinh kháng sinh Doxorubicin từ chủng đột biến Streptomyces pecetius MH9.2” VŨ THỊ QUỲNH MAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Kết thúc trình lắc, đem hỗn hợp đổ vào bình phân pha, để lắng phân pha Hỗn hợp dung môi chứa kháng sinh DXR có màu đỏ cam lắng xuống Thu hỗn hợp quay cô chân không, thu đươc kháng sinh cô đặc, hòa tan kháng sinh với 1-2ml Methanol, bảo quản -20o QUI TRÌNH TÁCH VÀ THU NHẬN KHÁNG SINHDOXORUBICIN PTN Dịch lên men XK S.peucetius MH9.2 chứa kháng sinh DXR (Sau 84h lên men) Ly tâm (5000v/ph) Xác tế bào (hạ pH đế 2.5 -3.0 H2SO4) Trộn với H2SO4: acetol tỉ lệ 1:4 khuấy trộn 2h Thu phần dịch nuôi (Tăng pH đến 7.8 NaOH 0,1N) Thu hồi dịch chứa DXR (loại acetone pp quay cô) Khuấy trộn (trộn hỗn hợp dịch nuôi chloroform – methanol tỉ lệ 9:1, pH =7.8) Thu dung môi pha lắng chứa DXR Thu pha hỗn hợp dịch lớp Thu DRX thô quay cô chân không Tách lại lần với hỗn hợp cloroform: methanol 9:1 Hòa methanol, bảo quản -20oC Thu hồi dung môi tái sử dụng Giải thích qui trình: VŨ THỊ QUỲNH MAI 39 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thu hồi dịch lên men: Sau 84 lên men, cảm quan ta thấy dịch lên men có màu đỏ sậm, hạt tế bào khuẩn ty mịn có màu vàng nhạt dịch lên men Ly tâm thu dịch nuôi: Dịch nuôi từ hệ thống lên men 2l dẫn trực tiếp đến hệ thống ly tâm để loại xác tế bào Quá trình ly tâm nhiệt độ 30oC với tốc độ 5000v/p sau ly tâm thu dịch nuôi chứa kháng sinh phần xác tế bào Acid hóa tế bào: Phần xác tế bào khuấy lỏng với hỗn hợp H2SO4 0,1N acetone(4:1) Kiểm tra pH dung dịch đến 3.0 Acetone hóa: Trộn dịch với hỗn hợp acetone:H2SO4 (4:1) khuấy trộn Các chất dinh dưỡng dư sau lên men protein, đường…tạo thành kết tủa chất phù.Lọc bỏ chất phù lắng cặn Dịch thu quay cô chân không để loại acetone, đưa pH =7.8 Loại lipit chất tan mỡ: Hỗn hợp dịch thu trộn với cloroform với tỷ lên 1:1, khuấy lien tục Các cầu mỡ, chất tan mỡ chuyển vào cloroform Loại bỏ tạp chất bình phân pha, để lắng, chiết pha Thu dịch lại chứa DXR thô Thu nhận DXR thô: Hỗn hợp dịch sau tách chất cặn lipit khuấy với hỗn hợp cloroform:methanol (9:1) với v/v = 1/1 Thời gian khuấy Hỗn hợp dung dịch khuấy chuẩn pH=7.8 Tại pH DXR dạng tự nên dễ dàng chuyển sang pha dung môi Sau tách pha, toàn DXR tan dung môi cloroform:methanol Thu kháng sinh thô hệ thống quay cô chân không Phần dung dịch đem xử lý tiếp lần để thu hồi kháng sinh lại VŨ THỊ QUỲNH MAI 40 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.3 Tinh kháng sinh qui mô phòng thí nghiệm 3.3.1 Khảo sát hệ dung môi tinh DXR phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Khảo sát hệ dung môi thích hợp sử dụng hệ dung môi sau: 1) isopropanol-etylacetat-HCl 0,001N 2) isopropanol-etylacetat-phosphate buffer M/15 3) n-butanol – methanol – phosphate buffer Chạy sắc ký mỏng TLC hệ dung môi Thu kết (hình 3.9) Hình 3.9a isopropanol- Hình 3.9b isopropanol- Hình 3.9c n-butanolmethanol-phosphat etylacetat-HCl 0,001N etylacetat-phosphat buffer buffer M/15 Hình 3.9: khảo sát hệ dung môi thích hợp phương pháp TLC Kết phân tích mỏng cho thấy với hệ dung môi isopropanol- ethylacetat – phosphate buffer (hình 3.9b) có vết tách kháng sinh rõ nét, tạo khoảng cách rõ rệt với tạp chất khác Vì áp dụng hệ dung môi chạy cột tinh kháng sinh DXR Tại phân đoạn ta thấy có kháng sinh giá trị Rf =0.21 với chấm có màu vàng cam VŨ THỊ QUỲNH MAI 41 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.3.2 Khảo sát pH thích hợp kháng sinh hấp phụ với resin Resin dùng sắc ký điều chế dạng trao đổi cation dạng acid yếu Resin sau xử lý xác định pH phù hợp để kháng sinh hấp phụ với resin Khảo sát giá trị pH thu được: Giá trị pH STT Khả hấp phụ Trung bình 2.5 Tốt 3 Rất tốt 3.5 Trung bình Không phù hợp Bảng 3.1: khảo sát pH thích hợp để kháng sinh hấp phụ Kết thu cho thấy giá trị pH=3 kháng sinh hấp thụ với resin tốt Tại giá trị khác kháng sinh gần không hấp phụ hấp phụ không tốt Vì giá trị pH=3 giá trị pH phù hợp cho trình hấp phụ Dịch lên men hạ pH đến 3,0 HCl để kết tủa kháng sinh, sau kháng sinh kết tủa hấp phụ 3.3.3 Khảo sát pH nhả hấp phụcủa kháng sinh với resin Dung môi n-butanol bão hòa dung dịch đệm phosphate 1/15 M với giá trị pH tương ứng từ 5,0- 6,0 Sau trình khảo sát, thu nhận bảng kết sau: STT Giá trị pH Khả nhả hấp phụ Trung bình Tốt Rất tốt Tốt Không phù hợp Không phù hợp 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 Bảng 3.2: Khảo sát pH thích hợp cho kháng sinh nhả hấp phụ Kết khảo sát điều kiện nhả hấp phụ cho thấy khả trao đổi ion với dung dịch đệm kết hợp với dung môi hữu để rửa kháng sinh cột phụ thuộc lớn vào hệ dung môi giá trị pH dung môi Với giá trị pH VŨ THỊ QUỲNH MAI 42 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP từ 5,0 – 5,4 kháng sinh nhả hấp phụ tốt khả giảm dần pH tăng dần đặc biệt với giá trị pH đạt 5,8 – 6,0 kháng sinh không nhả hấp phụ Vì với giá trị pH từ 5,0 -5,4 điều kiện tốt cho trình nhảhấp phụ 3.3.3Tinh kháng sinh trao đổi cột ion quy mô phòng thí nghiệm Hình 3.10a Mẫu 1, 2, Hình 3.10bMẫu Hình 3.10cMẫu 11, 12, 3, 4, 5, tương ứng 7,8,9, 10 tương ứng 13 tương ứng với với phân đoạn 2, 4, với phân đoạn 16, phân đoạn 38, 40 6, 8, 10, 12 42 18, 20 Hình 3.10: Thu nhận phân đoạn 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 38, 40 42 tinh kháng sinh VŨ THỊ QUỲNH MAI 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dung môi rửa giải nhả hấp phụ thu kháng sinh gồm dung môi isopropanol – ethyl acetate – Phosphate buffer với tỷ lệ 7: 1: với thể tích 500 ml dòng chảy tự nhiên.Từ phân đoạn đến phân đoạn 30 chủ yếu tạp chất có lẫn it kháng sinh Bắt đầu phân đoạn 38 kháng sinh có độ tinh cao Biểu đồ biểu diễn nồng độ kháng sinh phân đoạn cho thấy hệ dung môi thích hợp để áp dụng cho qui mô tinh pilot thu nhận kháng sinh isopropanol – ethyl acetate – Phosphate buffer với tỷ lệ 7: 1: 3.4 Qui trình tinh kháng sinh quy mô phòng thí nghiệm Giải thích quy trình: 1) Kháng sinh có khả tan mạnh Methanol đồng thời bền dạng muối HCl dạng muối tan mạnh nước Vì để tăng hiệu tinh đảm bảo độ bền kháng sinh, kháng sinh thô chuyển dạng muối (ion hóa) để tăng khả hòa tan dễ dàng tinh 2) Resin dùng sắc ký điều chế dạng trao đổi cation dạng acid yếu Resin sau xử lý xác định pH phù hợp để kháng sinh hấp phụ với resin Cân resin phosphate buffer 1/15M với thể tích đệm phù hợp dịch buffer cân thu được kiểm tra đạt pH 5,4 đạt cân cột 3) Kháng sinh thô sau ion hóa, tách cầu mỡ chạy qua cột điều chế hấp phụ hoàn toàn với resin theo nguyên lý trao đổi ion Để rửa chất kháng sinh, cột resin hấp phụ rửa nhiều lần với phosphate buffer 1/15M dịch thu từ cột thoát suốt 4) Hệ buffer rửa giải hỗn hơp dung môi gồm Isopropanol – Ethylacetate – Phosphate buffer (Nồng độ thay đổi từ 1/15M đến 0,13M) với tỷ lệ tối ưu để nhả hấp phụ kháng sinh 7:1:2 Thu phân đoạn chạy cột kiểm tra khả nhả hấp phụ kháng sinh phương pháp chạy mỏng TLC với hệ dung môi Chloroform: methanol: acid acetic (tỷ lệ 9:1:1) VŨ THỊ QUỲNH MAI 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thu Doxorubicin tinh phân đoạn có kháng sinh xuất giá trị Rf =0,21 với chấm mỏng có màu vàng da cam 5) Các phân đoạn thu có chứa kháng sinh DXR chuyển sang bước tạo dạng tự bước tinh Tăng pH dung dịch đến 8,6 sau lắc với Chloroform giờ, thu lại pha có chứa DXR tan chloroform loại bỏ phần dịch nuổi Phần dung môi có chứa kháng sinh trộn với Methanol HCl lắc giờ, pH dung môi hạ đến 3,0 Sau khuấy để lắng hỗn hợp dung môi thu kháng sinh giá trị pH kháng sinh chuyển thành dạng muối tan Methanol, loại bỏ pha dung môi có chứa chloroform 6) Kiểm tra độ tinh kháng sinh thu được, phương pháp đánh giá phân tích gồm: chạy phân tích mỏng TLC, phân tích độ tinh sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kháng sinh thu VŨ THỊ QUỲNH MAI 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH TINH SẠCH KHÁNG SINH DXR BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRAO ĐỔI ION DXR thô hòa ion hóa Nạp vào cột nhồi resin cân Rửa lại cột phosphate buffer Khuấy với HCl 0,1N MeOH, pH 2,5 Hạt resin ngâm với phosphate bufferpH=5,4 Kiểm tra pH dịch thoát từ cột, kiểm tra độ tinh dịch Nạp dung môi rửa giải isopropanol – ethyl acetate – Phosphatebuffer với tỷ lệ 7: 1: Thu phân đoạn chạy cột Kiểm tra sắc ký mỏng (TLC) Hệ dung môi CHCl3 - MeOH - acetic axit(9:1:1) Thu phân đoạn chứa DXR Rf=0.21, kiểm tra UV Chuyển dạng muối (DXR.HCl) Thu DXR tinh VŨ THỊ QUỲNH MAI 46 Hòa kháng sinh nước cất pH= 3,0 loại n-Butanol Kiểm tra độ tinh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.5 Đánh giá kháng sinh phân tích sản phẩm tinh 3.5.1Phân tích khả kháng khuẩn kháng sinh Hình 3.11: Đĩa thử hoạt tính kháng khuẩn kiểm tra độ tinh kháng sinh (A: sản phẩm tinh sạch; B:chất chuẩn; C: kháng sinh trước tính sạch) Dựa vào hình 3.11 thấy vòng kháng khuẩn từ kháng sinh DXR sau tinh có đường kính to so với vòng kháng khuẩn chất chuẩn DXR trước tinh Sản phẩm tinh có kích thước vòng vô khuẩn lớn D=2.5cm Như kháng sinh DXR sau tinh có hiệu lực cao so với trước tinh 3.5.2 Phân tích kết tinh TLC Hình 3.12 Phân tích độ tinh sản phẩm TLC (A: DXR chuẩn; 11; 12; 13: phân đoạn sau tinh sạch) Dựa vào hình thấy sản phẩm sau tinh thời điểm xuất DXR có màu đậm , sắc nét, rõ ràng so với sản phẩm trước VŨ THỊ QUỲNH MAI 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP tinh Kháng sinh DXR xuất giá trị Rf =0,21 với chấm mỏng có màu vàng da cam 3.5.3Phân tích sản phẩm HPLC ng Hình 3.13.a Kháng sinh thô sau tách thu nhận phân tích HPLC Hình 3.13.b Kháng sinh tinh nồng độ 0,100µg.ml-1 phân tích HPLC Các mẫu thu phân tích qua HPLC cho thấy chất chuẩn pick xuất cho DXR thời gian lưu 32 phút, tương tự mẫu kháng sinh thô có xuất DXR thời gian lưu tương tự chất chuẩn Kết kiểm tra mẫu HPLC cho thấy kháng sinh tinh (hình 3.13.a); (3.13.b) VŨ THỊ QUỲNH MAI 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề tài thu kết sau: 1) Khảo sát, lựa chọn hệ dùng môi thích hợp để tách kháng sinh Xác định hệ dung môi thích hợp hỗn hợp chloroform:methanol (9:1) 2) Khảo sát hệ dung môi phương pháp sắc ký TLC, lựa chọn hệ dung môi sử dụng phương pháp tinh kháng sinh cột trao đổi ion Lựa chọn hệ dung môi dùng nhả liên kết phương pháp cột trao đổi ion hệ dung môi isopropanol: etylacetat: phosphate buffer (7:1:2) 3) Xây dựng quy trình thu nhận kháng sinh DXR thô phòng thí nghiệm 4) Tinh kháng sinh DXR phương pháp cột trao đổi ion 4.2 Đề xuất - Nghiên cứu phát triển qui mô pilot hướng đưa vào sản xuất thử nghiệm - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp tinh DXR để phục vụ cho y dược ngành nghiên cứu VŨ THỊ QUỲNH MAI 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO A: TÀI LIỆU TIẾNG ANH Tan C., Tasaka, Kou-Ping H., et al., (1967) Daunomycin, An Antitumor Antibiotic, In the Treatment of Neoplastic Disease Clinical Evaluation with Special Reference to Childhood Leukemia.,Cancer, 20, 333 – 353 Lown J W., (1993) Anthracycline and anthraquinone anticancer agents: current status and recent developments" Pharmacol Ther 60 (2): 185-214 Caroline A A., Katherine L M., (1998) Eukaryotic DNA topoisomerase II beta Review BioEssays 20.3: 215-226 Pigram W.J., Fuller W., Hamilton L.D., (1972) Stereochemistry of Intercalation: Interaction of Daunomycin with DNA Nature New Biology,235, 17 – 19 Lomovskaya N, Otten SL, Doikatayama Y et al (1999) : "Daunorubicin over production in Streptomyces Peucetius: Cloning and characterization of the dnrU keto recductase and dnrV gene and the Dox a Cytochrome P-450 hydroxylase gene", J Bacteriol 181 (1): 305-18 Arcamone cs, (1969) "Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S peucetiusvar caesius" Biotechnol Bioeng11 Alexandre C.,andAntonio G., (2003) Isolation and Structure of a New Macrolide Antibiotic, Erythromycin G, and a RelatedBiosynthetic Intermediate from a Culture of Saccharopolyspora erythraea vol 56 The Journal of Antibiotics pp 280-288 Malla S, Niraula N P, Liou K, Sohng J K., (2010) Improvement in doxorubicin productivity by overexpression of regulatory genes in Streptomyces peucetius.Res Microbiol 161(2):109-17 Sailesh M, Narayan P N., Kwangkyoung L., and Sohng, J K., (2009) Enhancement of doxorubicin production by expression of structural VŨ THỊ QUỲNH MAI 50 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP sugar biosynthesis and glycosyltransferase genes in Streptomyces peucetius Journal of Bioscience and Bioengineering 108 (2), 92–98 10 Demina AS, Griaznova NS, Ganelin VL, Sazykin IuO., (1977) Isolation and substrate specificity of neomycin (paromomycin) phosphotransferase from Actinomyces fradiae, a producer of neomycin Antibiotiki Dec;22(12):1066-70 11 Masashi A., Shuzo S., Naoki M., Mitsuo H., Hitoshi S., andHideo S., (1983) Saccharocin, a new aminoglycoside antibioticfermentation, isolation, characterizationand structural study The journal of antibiotics Vol 36, page 615 12 Edward A Kaczka, (1955) Purification of novobiocin A corporation of New Jersey Patant Application April 21, Serial No 503,030 13 Ahuja A., (2000) Liquid-Liquid Partitioning Methods forBioseparations,Chapter in the Handbook ofBioseparations, , Ed., Academic Press,New York, Vol 2, p 329-364 14 Ratnakar N., Asolkar, Rajendra P., Maskey, Elisabeth H.,andHartmut L., (2002) Chalcomycin b, a new macrolide antibiotic from the marine isolate streptomyces sp b7064, vol 55 no 10, oct The journal of antibiotics pp 893-898 15 Khalid W Hameed, (2012) Extraction of Penicillin V from Simulated fermentation Broth by Liquid -Liquid MembraneTechnique AlKhwarizmi Engineering Journal Vol.8 , No.2, PP 77 -8 16 Ukragl (2005) Technology Transfer in Biotechnology: From Lab to Industry to Production, ed T.SCheper pg 92, – 48 17 Rhone W vs cs 1984 18 Paul G Caltrider and Harold B Hayes (1965), Process for tylosin production, A corporation of Indiana, Indianapolis June 25, Ser No 467,105 VŨ THỊ QUỲNH MAI 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 19 Frederick C.A., Williams L.D., Ughetto G., van der Marel G.A., van Boom J.H., Rich A., Wang, A.H., (1990) Structural Comparison of Anticancer Drug-DNA Complexes: Adriamycin and Daunomycin Biochemistry, 29, 2538 – 2549 20 Cassinelli cs 1963.Arcamone F, Cassinelli G, Fantini G, Grein A, Orezzi P, Pol C, Spalla C., (2001) Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S peucetius var caesius Reprinted from Biotechnology and Bioengineering, Vol XI, Issue 6, Pages 1101-1110 21 Richard J P., (1998) Chapter 1, How to approach the isolation of natural products - Natural products isolation Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, 22 Alexandre C.,andAntonio G., (2003) Isolation and Structure of a New Macrolide Antibiotic, Erythromycin G, and a RelatedBiosynthetic Intermediate from a Culture of Saccharopolyspora erythraea vol 56 The Journal of Antibiotics 23 Jiang H, Hutchinson C R., (2006) "Feedback regulation of doxorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius" Res Microbiol 157 (7): 666–74 24 Ronal M Atlas, Microoganism in our world, Publish by Mosby-year book, Inc, 1995 B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 25 Cao Văn Thu, Bài giảng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 26 Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 27 Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 VŨ THỊ QUỲNH MAI 52 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 28 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh CKS chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 29 Nguyễn Hoàng Chiến , Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh CKS chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội, 2000 30 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất y học Hà Nội,Trang 7-20, 2005 31 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 – 345 32 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 – 41 33 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 34 PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học (tập 2) – (tr 12 – 19) 35 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 VŨ THỊ QUỲNH MAI 53 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP [...]... peucetiusMH9 .2 A Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: lựa chọn điều kiện thích hợp và xây dựng được quy trình thu nhận tách chiết và tinh sạch kháng sinh DRX B Các nội dung nghiên cứu: 1 Nghiên cứu các điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh của chủng đột biến S .peucetius MH9. 2 2 Nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi thích hợp tách chiết và tinh sạch kháng sinh thô 3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách. .. suất tách chiết và tinh sạch kháng sinh 4 Xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch kháng sinh thô VŨ THỊ QUỲNH MAI 17 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN 2 VẬT LIỆ ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU U 2. 1 Vật liệu, hóa chất, t, môi trường tr VSVvà thiết bị 2. 1.1Vật liệu u và môi trường trư nuôi cấy chủng VSV 2. 1.1.1 Các chủng ng vi sinh vật v • Chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn S .peucetius MH9. 2 được làm đột biến tạii... trong nghiên cứu dây dựng quy trình tách chiết kháng sinh từ dịch sinh khối lên men với số lượng lớn có quy mô công nghiệp được sản xuất từ Trung Quốc.Các DXR chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này được cũng cấp bởi công ty TNHH Genechem (Daejeon, Hàn Quốc) VŨ THỊ QUỲNH MAI 21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2. 2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu Chủng xạ khuẩn đột biến StreptomycesMH9 .2 NuNuôi ở 28 oC Thời gian từ 72- 84h... thành kháng sinh Doxorubicin trên thị trường vẫn cao do quá trình tách chiết và tính sạch phức tạp, chưa đạt hiệu quả cao do DRX kém bền trong điều kiên nhiệt độ phòng, ở dạng tự do dễ phân hủy là mất hoạt tính kháng sinh Từ những lí do trên đề tài nghiên cứu được đề xuất với tên: Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch kháng sinh Doxorubicin từ dịch lên men xạ khuẩn Streptomyces peucetiusMH9 .2 ... nấm men của Merk - Các loại muối và muối khoáng: NaCl, ZnCl2, FeCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, Na2B4O7.10H2O, (NH4)Mo7O24.4H2O của Merk, Trung Quốc - Glyxerol, NaOH, agar của Trung Quốc, Việt Nam B Hóa chất dùng trong tách chết, phân tích, tinh sạch Methanol, Cloroform, Acid acetic, Acetone, n-Butanol…các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết trong phòng thí nghiệm đều... 1.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius MH9. 2 Chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius MH9. 2 là chủng xạ khuẩn được làm đột biến tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, Việt Nam từ chủng S .peucetius ATCC 27 9 52 cung cấp từ phòng thí nghiệm iBR – Khoa Hóa dược – Đại học Sunmoon, Hàn Quốc Xạ khuẩn Streptomyces peucetiusMH9 .2 thuộc chi Streptomyces, là VŨ THỊ QUỲNH... gian từ 72- 84h Lắc 27 0 vòng/ phút - Nuôi cấy trên đĩa thạch - Nuôi lỏng 50ml trong bình tam giác, môi trường NDYE Lựa chọn điều kiện thích hợp để lên mem sinh tổng hợp kháng sinh DXR Khảo sát pH và thời gian khuấy trộn thích hợp để tách chiết Khảo sát hệ dung môi thích hợp để tinh sạch DXR Nghiên cứu quy trình tách chiết kháng sinh DXR thôMỤC Quy trinh tinh sạch kháng sinh thô DXR Tinh sạch bằng phương... khả năng kháng khuẩn của kháng sinh DXR Khảo sát dung môi thích hợp để tách chiết kháng sinh DXR thô Khảo sát điều kiện PH thích hợp để tinh sạch DXR Phương pháp sắc ký bản mỏng TCL Đánh giá kháng sinh và phân tích sản phẩm Phân tích bằng HPLC DXR TINH SẠCH VŨ THỊ QUỲNH MAI 22 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2. 3Phương pháp nghiên cứu 2. 3.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 2. 3.1.1 Phương pháp nuôi chủng xạ... FeCl2.6H2O 0, 02 g CuCl2.2H2O 0,01 g MnCl2.4H2O 0.01g Na2B4O7.10H2O 0,01 g (NH4)6MO7O24.4H2O 0,01 g Môi trường LB (Luria Bertani): môi trường nuôi cấy chủng VSV kiểm định Bảng 2. 3 Môi trường LB Thành phần Khối lượng Trypton 10g/l Cao nấm men 5g/l NaCl 10g/l Agar 20 g/l 2. 1 .2 Hóa chất, dụng cụ và thiếtbị 2. 1 .2. 1 Dụng cụ và thiết bị VŨ THỊ QUỲNH MAI 20 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 2. 4: dụng cụ và thiết bị Tủ cấy... nhỏ và mỗi đốt nhỏ là một tế bào xạ khuẩn.Khi sinh trưởng tốt trên môi trường NDYE ở nhiệt đ 28 OC sau 84 giờ thì bắt đầu sinh kháng sinh Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC279 52 có khả năng hấp thụ các nguồn cacbohydrat khác nhau.Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có glucose, sacharose và maltose Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh