Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính kháng viêm, tăng cường miễn dịch của polisaccarit từ cây thuốc xuân hoa p palatiferum

Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch được từ lá Xuân Hoa .... Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên thế giớ

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THUỐC XUÂN HOA P PALATIFERUM

Người hường dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC

Sinh viên thực hiện : VŨ THỊ THU TRANG

Lớp : 12-01

HÀ NỘI - 2016

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm – Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện , môi trường tốt giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hoài Bắc đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Viện Đại Học Mở

Hà Nội, các phòng ban liên quan, Ban Chủ Nhiệm khoa công nghệ sinh học, cùng toàn thể các thầy cô giáo đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có những kiến thức như ngày hôm nay

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm và lòng biết ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

VŨ THỊ THU TRANG

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu chung về cây Xuân Hoa 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật. 2

1.1.2 Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa. 3

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa. 5

1.1.4 Những nghiên cứu in vitro về dược tính. 5

1.1.5 Những nghiên cứu in vivo về dược tính. 6

1.2 Polisaccarit 8

1.2.1.Oligosaccarit. 8

1.2.2 Polisaccarit. 9

1.3 Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật 13

1.3.1 Vai trò sinh học và ý nghĩa kinh tế 13

1.3.2 Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật. 14

PHẦN II 17

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Nguyên liệu thực vật. 17

2.1.2 Hóa chất, thiết bị. 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Xử lý nguyên liệu. 17

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

2.2.3 Định lượng polisaccarit bằng phương pháp phenol-sunfuric axit. 18

2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. 19

2.2.5 Phương pháp tách chiết và tinh sạch polisaccarit 20

2.2.6 Đo độ hấp thụ quang phổ của dung dịch polisaccarit 20

2.2.7 Xác định độ nhớt polisaccarit 20

2.2.8 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế phẩm polisaccarit.21 2.2.9 Xác định hoạt tính kháng viêm trên invitro sử dụng phương pháp ức chế enzyme hyaluronidase theo phương pháp Reissig 21

2.2.10 Thử nghiệm tác dụng của chế phẩm polisaccarit trên chuột được tiêm cyclophosphamide 23

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu thành phần polisaccarit của nguyên liệu 24

3.1.1 Các phản ứng phát hiện polisaccarit và polisaccarit peptic. 24

3.1.2 Thu nhận polisaccarit tinh sạch từ lá cây Xuân Hoa. 25

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của polisccarit tinh sạch 31

3.2.1 Xác định độ hấp thụ quang phổ của polisaccarit 31

3.2.2 Độ nhớt của dung dịch polisaccarit 31

3.2.3 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế phẩm polisaccarit.32 3.3 Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch được từ lá Xuân Hoa 33

3.3.1 Xác định hoạt tính kháng viêm của polisaccarit từ cây Xuân hoa trên in vitro 33

3.3.2 Thử nghiệm chế phẩm polisaccarit trên chuột được tiêm cyclophosphamide 34

KẾT LUẬN 37

1 Kết luận 37

2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 44

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

A490 : Bước sóng A585 : Bước sóng 585nm BSA : Bovine seurum albumin

CY : Cyclophosphamide

OD : Optical density TCA : Axit tricloaxetic

Hb : Hemoglobin

HC : Hồng cầu

BC : Bạch cầu

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz theo DuBoietal 18

Bảng 2.2: Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry 20

Bảng 2.3: Xác định khả năng kháng viêm của polisacarit Xuân Hoa 22

Bảng 3.1: Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit và polisaccarit peptic 24

Bảng 3.2: Phản ứng định tính so sánh các dung môi chiết polisaccarit 27

Bảng 3.3: Hàm lượng polisaccarit trong các dung môi chiết 27

Bảng 3.4: So sánh phương pháp loại protein bằng Sevag và TCA 29

Bảng 3.5: Xác định tác dụng ức chế hyaluronidase của polisaccarit 33

Bảng 3.6: Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 5 ngày thí nghiệm 35

Bảng 3.7: Trọng lượng tương đối của tuyến ức , lách, hàm lượng hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu(BC) 35

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit 24 Hình 3.2 Sơ đồ chiết rút chế phẩm polisaccarit 30 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng của polisaccarit chiết từ lá cây Xuân Hoa 31 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến chế phẩm polisaccarit 32 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polisaccarit 32

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng của chúng về tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin

Các nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá cây Xuân Hoa P palatiferum

chứa hàm lượng cao polisaccarit

Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ôrô Acanthaceae được dùng trong dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh

như: nhiễm khuẩn tiêu hoá, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ các vết thương…Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam và thế giới đã xác minh được một số tác dụng sinh học của lá cây thuốc này như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính và tác dụng dược lý chỉ tập trung vào nhóm các chất như: flavonoids, phytol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid… Cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu

về các đặc tính sinh hóa , dụng tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Chiết rút và tinh sạch được polisaccarit từ lá cây thuốc Xuân Hoa P

- Xác định được một số đặc tính sinh hóa như: độ nhớt, độ sạch của polisaccarit, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến chất lượng của chế phẩm polisaccarit

- Điều tra một số tác dụng dược lý (tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch) của polisaccarit từ cây thuốc này

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Xuân Hoa

Đề tài của chúng tôi nghiên cứu polisaccarit trên đối tượng là cây Xuân

Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

Mô tả: Cây có thể mọc cao từ 1-2m sống lâu năm, thân cây xanh màu tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều nhánh, lá mọc đối diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp lá nguyên, cuống

lá dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm Hoa mọc ở kẽ lá hoặc ở đầu cành Hoa lưỡng tính, không đều

Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang ở nhiều nơi, được coi là cây thuốc quí có uy tín trong dân gian ở các tỉnh thành miền Bắc, nhất là thủ đô Hà Nội

Từ năm 1998, rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc về nhóm bệnh đường tiêu hóa

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa

1.1.2 Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa

Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đưa ra một số bài thuốc từ kinh nghiệm dân gian đã sử dụng lá cây Xuân Hoa:

• Chữa bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày cho đến khi khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn

• Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu, phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt,…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ Ăn 1-5 lần, máu sẽ cầm, nên ăn ngày 2 lần

• Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần, người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh Thử nghiệm qua một số bệnh ung thư dạ dày, gan, phổi,… đều thấy có diễn biến tốt Lượng lá dùng thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày 2 lần, mỗi lần 3-7 lá, tùy theo hiệu quả giảm đau

• Các bệnh u ở phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng như trên, sau 1 tuần các triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khoảng 3 tháng liên tục

• Các bệnh về gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan,…): ăn lá tươi như trên ngày 2 lần khi đói Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 là thuốc trị xơ gan đặc hiệu

• Bệnh về thận (viêm thận cấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng nước đái đục, đái ra máu): điều trị như trên sau 1 tuần Ăn 1 lần/ngày, nhưng nếu nước giải chỉ trong được nửa ngày thì tăng lên 2 lần/ngày Trong thời gian nửa tháng, các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt

• Chữa viêm loét (loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại, trực tràng,…): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buổi sáng) Với các vết thương thuộc phạm vi dạ dày, chỉ cần ăn trong 1 tuần, tránh uống rượu mạnh Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiểu hơn tùy theo nặng, nhẹ

• Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổi huyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ trong thời gian ngắn, huyết áp sẽ trở lại bình thường, khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật, tùy theo mức độ để định liều lượng, có thể ăn vào buổi sáng giúp cơ thể ổn định trong ngày và đề phòng khi thời tiết thay đổi đột ngột

• Chữa về chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt là chấn thương

sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục các mô cơ bị dập, kháng viêm nhiễm, lá làm cả thuốc đắp và thuốc uống Với vết thương kín, có thể nhai để đắp, vết thương hở thì nên giã để đắp

• Chữa cảm cúm: nếu kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi, nhiệt độ cao, nên ăn lá cách 2 giờ, cơn sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn tiêu hóa cũng khỏi Sau cơn sốt, nên ăn cháo có lá thuốc trộn vào giúp cho người bệnh mau chóng trở lại bình thường

• Khôi phục sức khỏe: khi mệt mỏi toàn thân hoặc cần nâng cao sức chịu đựng cường độ cao, nên ăn như liều đinh 5-7 lá trước nửa giờ Trẻ con đi

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự đã cô lập được các hợp chất phytol, β-sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol và

poriferasterol, β-sitosterol 3- β-O-D-glucopyranoside từ lá cây Xuân Hoa

[Nguyễn Thị Minh Thu, 2000]

Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự đã cô lập từ lá khô cây Xuân Hoa hợp chất 1-pentacosanol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn

hợp β-sitosterol glucopyranoside và stigmasterol glucopyranoside và apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside [Phan Minh Giang,

3-O-β-D-2003]

Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng và cộng sự đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa các hợp chất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid và palmitic acid [Nguyễn Văn Hùng, 2004]

Năm 2005, Mai Đình Trị và các cộng sự đã cô lập các hợp chất từ lá cây Xuân Hoa bao gồm: β-amyrin, oleanolic, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside và stigmasterol3-O-β-D-glucopyranoside [Mai Đình Trị, 2005]

Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa các hợp chất squalene, dotriacontane, phytol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol,

hỗn hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside, 24-methylenecycloartanol và

loliolide [Trần Kim Thu Liễu, 2007]

Các nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng lá Xuân Hoa chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%), đặc biệt hàm lượng isoleucin, leucin và valin rất cao (25 – 150 mg%; 46 – 85 mg% và

29 – 1001 mg%) Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd,

As, Cr [Võ Hoài Bắc, 2003], phát hiện hàm lượng cao protease, polisaccarit từ

lá cây này [Lê Thị Lan Oanh, 1999]

1.1.4 Những nghiên cứu in vitro về dược tính

a) Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 1998, Trần Công Khánh và cộng sự đã thử tác dụng kháng vi sinh vật kiểm định (trong ống nghiệm) của cao đặc chiết từ lá cây Xuân Hoa, kết

quả cho thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,

men (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans)[Trần Công Khánh, 1998]

Các nhà khoa học [Phan Minh Giang, 2005] đã khảo sát sơ bộ hoạt tính

kháng khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n-butanol (ở nồng độ 10

mg/ml) từ lá cây Xuân Hoa, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể

hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,

hơn cao trích n-butanol Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt các chủng Salmonella typhi 158, Shigella flexneri và Escherichia coli, đây là

những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu chảy, viêm ruột, lị

Các nghiên cứu [Phan Minh Giang, 2005] đã nghiên cứu hoạt tính

kháng oxy hóa của các loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây Xuân Hoa

bằng phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt động của enzyme peroxydase trong máu Kết quả cho thấy cả hai loại cao

ethyl acetate và n-butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa

1.1.5 Những nghiên cứu in vivo về dược tính

a) Thử độc trên động vật thử nghiệm

Năm 1999, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự đã khảo sát độ độc của dịch chiết

lá cây Xuân Hoa trên cá chọi Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá chọi vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày [Lê Thị Lan Oanh, 1999]

Kết quả thử nghiệm độc tính của lá khô cây Xuân Hoa cũng đã được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí nghiệm, cho thấy không có độc tính

Các nghiên cứu [Nguyễn Thị Minh Thu, 1999] đã thử độc tính cấp diễn của cây Xuân Hoa theo phương pháp của Behrens trên chuột nhắt trắng Phương pháp được tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau, liên tục theo dõi diễn biến hành vi của chuột từ khi đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày Kết quả cao đặc toàn phần lá cây không gây độc tính cấp tính trên chuột, chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh qua 48 giờ

Năm 2009, Peerawit và cộng sự đã thử nghiệm độc tính của cao trích

ethanol 80% từ lá cây Xuân Hoa cả in vitro lẫn in vivo Kết quả thử nghiệm

fluorescent protein) cho thấy mẫu thử không độc ở nồng độ 50 µg/ml, liều cao

nhất có thể pha được Với thử nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích

ethanol 80% được thực hiện trên chuột trưởng thành qua đường uống, với một liều duy nhất ở các nồng độ khác nhau, 500, 1000, 1500 và 2000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột Kết quả cho thấy chuột không có dấu hiệu ngộ độc trong 24 giờ đầu và không chết qua 14 ngày thử nghiệm, không có sự khác biệt về thể trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng Với

thử nghiệm in vivo trên chuột qua đường uống, mỗi ngày, trong 14 ngày, ở

các nồng độ khác nhau, 250, 500, 1000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột, không có liều nào gây độc cho chuột Các trị số hóa lý như creatinine, triglyceride, cholesterol tổng, protein tổng và albumin không có sự khác biệt giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng [Peerawit, 2009]

b) Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Năm 1999, Các nhà khoa học Việt Nam đã thử tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao đặc toàn phần lá cây Xuân Hoa trên chuột nhắt trắng Mô hình gây ngộ độc gan bằng tetrachloromethane Kết quả như sau: ở liều gây độc gan 1 ml CCl4/kg thể trọng, hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể,

có dấu hiệu bình phục tế bào gan Ở liều gây độc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng,

hàm lượng men gan có giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục tế bào gan [Nguyễn Thị Minh Thu, 1999]

c) Tác dụng trị tiêu chảy.

Năm 2006, Diệu HK và cộng sự đã xác định hiệu quả của bột lá Xuân Hoa trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai chế phẩm Coli-norgent và Cotrimxazol Kết quả 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô có tỉ lệ khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái phát thấp hơn so với kháng sinh Coli-norgent (90,48% / 9,52%) và Cotrimxazol (83,33% / 14,29%)[ Diệu, 2006]

1.2 Polisaccarit

Polisaccarit là các saccarit bao gồm từ hai đến hiều gốc đường đơn kết hợp với nhau Polysaccarit được chia thành 2 phân nhóm oligosaccarit và polisaccarit

1.2.1.Oligosaccarit

Oligosaccarit bao gồm không quá 10 gốc monosaccarit kết hợp với nhau bằng liên kết O-glucozit Oligosaccarit phổ biến nhất là nhóm disaccarit bao gồm các đường kép điển hình Ngoài disaccarit còn có trisaccarit, tetrasaccarit

Các disaccarit phổ biến là mantoz,lactoz và saccatoz Ví dụ :

+ Mantoz( còn gọi là đường mạch nha), được cấu tạo từ 2 phân tử glucoz Liên kết glucozit được tạo thành giữa một OH-glucozit với OH ở C4

α-D-của gốc glucoz thứ hai Do đó phân tử manozo vẫn còn chứa một nhóm glucozit tự do, nên vẫn giữ được tính khử nhưng chỉ bằng một nửa của glucoz

OH-+ Saccaroz (đường mía) được cấu tạo từ α-D-glucoz và β-D-glucoz Hai monosaccarit này kết hợp với nhau qua liên kết glucozit được tạo thành giữa hai nhóm OH-glucozit của chúng Vì vậy sacaroz không có tính khử, sacaroz hòa tan tốt trong nước

+ Trisaccarit phổ biến và được biết rõ hơn cả là rafinoz Rafinoz được cấu tạo chủ yếu từ 3 monosaccarit là glucoz và fructoz

+ Tetrasaccarit phổ biến được biết đến là stakioz cấu tạo từ 4 gốc monosaccarit, trong đó có 2 gốc α-D-galactoz, một gốc α-D-glucoz và một gốc β-D-glucoz

+ Stakioz và ranfinoz không có tính khử vì tất cả các nhóm OH-glucozit đều tham gia tạo thành liên kết glucozit [Phạm Thị Trân Châu, 1997]

1.2.2 Polisaccarit

Polisaccarit do nhiều gốc monosaccarit kết hợp với nhau có khối lượng phân tử lớn Các monosaccarit trong phân tử polisaccarit có thể thuộc một hay nhiều loại khác nhau Trong một số trường hợp các gốc monosaccarit có chứa các nhóm thế glucozit trong phân tử polisaccarit có thể là α- hoặc β-glucozit Tên gọi polisaccarit phân theo tên của monosaccarit cấu tạo nên nó nhưng đổi đuôi ‘oz’ thành đuôi ‘an’

Ví dụ : D-glucan, D-Fructan, D-galactan, D-galactoglucan,.v v[Phạm Thị Trân Châu,1997]

Những monosaccarit thường gặp trong phân tử polisaccarit là hexoz (glucoz, galactoz, mantozo) hoặc pentozo (arabinoz, xiloz,…) So với aldoz thì xetoz ít tham gia tạo thành phần polisaccarit hơn Những polisaccarit chứa hơn 5-6 loại monosaccarit khác nhau rất ít gặp

Tùy theo nguồn gốc tự nhiên, polisaccarit chia thành 3 nhóm lớn: Polisaccarit vi sinh vật, polisaccarit động vật và polisaccarit thực vật

• Polisaccarit vi sinh vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu,1997]

Nhóm polisaccarit này được tích tụ một lượng đáng kể trong dịch nuôi cấy của vi sinh vật do đó có thể tách ra một cách cụ thể dễ dàng.Ví dụ :

+ Nigeran là polysaccarit được tách ra từ dịch nuôi cấy của aspergilus niger , nigenran do các gốc D-glucopiranoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→3 và α-1→4 glucozit luân phiên nhau

+ Dextran là glucan do một số vi khuẩn giống Leuconostoc

các vi khẩn này có enzyme dextran-sucraza xúc tác quá trình biến sacaroz

thành dextran Dextran được dùng làm chất thay thế huyết thanh của máu và

nó cũng là nguyên liệu ban đầu sản xuất sephadex – là những rây phân tử có nhiều ứng dụng thực tế trong phòng thí nghiệm

• Polisaccarit động vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu,1997]:

Trong hàm lượng nhỏ hơn so với polisaccarit ở thực vật nhưng polisaccarit ở động vật giữ vai trò quan trọng trong cơ thể động vật Polisaccarit ở động vật chia thành các loại như glicogen, kitin, heparin,… + Glicogen cũng thuộc glucan, là polysaccarit dự trữ ở động vật và người Trong đó, glicogen có cấu tạo phân nhánh tương tự amilopectin của tinh bột nhưng có độ phân nhánh nhiều hơn Phần lớn các gốc glucoz trong phân tử kết hợp với nhau tạo liên kết α-1→4-glucozit, liên kết α-1→6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử Glicogen có thể bị thủy phân dưới tác dụng của enzymee hoặc axit, khi thủy phân hoàn toàn nhận được α-D-glucoz Glicogen hòa tan trong nước nóng, và có màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với Iot Ở động vật glicogen tập trung chủ yếu ở gan và cơ [Trần Thị Áng,1997]

+ Kitin do các gốc N-axetil β-glucozamin kết hợp với nhau bằng liên kết β-1→4-glucozit Kitin là hợp phần chính của bộ khung bên ngoài của ngành chân khớp và một số động vật không xương sống khác Về số lượng kitin chiếm vị trí thứ 2 trong xenluloz, trong các hợp chất hữu cơ có trên quả đất Nếu xử lý kitin bằng kiềm đặc kết hợp với nung nóng 1 phần nhóm N-axetil sẽ bị tách và tạo thành chitozan Chitozan đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, dược phẩm, công nông nghiệp… + Heparin là một mucopolysaccarit có tính chất sinh học quan trọng, là chất chống đông máu Heparin có trong nhiều tổ chức của cơ thể, nhưng chủ yếu là ở gan , phổi và cơ Thường heparin được liên kết với protein

• Các polisaccarit thực vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu ,1997 ]: Trong tự nhiên polisaccarit thực vật có tầm quan trọng đặc biệt đối với cuộc sống và có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị

+ Axit anginic là hợp phần chính của thành tế bào rong nâu Axit anginic của các rong khác nhau về thành phần đơn phân, chúng đều chứa axit D-manuronic và L-gluronic với tỉ lệ xê dịch trong khoảng 0,5-3 Các monosaccarit trong axit anginic kết hợp với nhau bằng liên kết 1→4-glucozit

và tạo thành mạch thẳng

+ Thạch (agar) là một sunfat của polisaccarit tích tụ nhiều ở trong loại rong đỏ gồm 2 dạng polisaccarit : agaroz và agaropectin Agaroz do D-galactopiranoz và 3,6 anhidro L-galactopiranoz tạo nên bằng liên kết 1→4 và liên kết 1→3- glucozit

Agaropectin khác với agaroz về hàm lượng nhóm sunfat Cấu tạo chi tiết của agaropectin chưa được sáng tỏ Thạch cũng như axit anginic có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm và một số ngành sản xuất khác

+ Inulin là polisaccarit dự trữ của nhiều loại thực vật do D-fructoz tạo nên và inulin chứa một polisaccarit có tên là fructan gồm các D-fructo furanoz kết hợp với nhau bằng liên kết (2→1)-glucozit và tận cùng bằng một sacaroz không khử Inulin có nhiều nhất trong củ mẫu đơn (12%) rễ cải đắng (10%) cũng như trong cây họ nhà hòa thảo Người và động vật đồng hóa inulin dễ dàng Inulin dễ hòa tan trong nước nóng, để lạnh lắng xuống thành kết tủa Khối lượng phân tử của inulin tương đối thấp (5000-6000) Da

+ Tinh bột là polisaccarit dự trữ chủ yêu trong thế giới thực vật Tinh bột có nhiều trong quả, hạt (trong hạt thóc, ngô, lúa mì tinh bột chiếm 70%),

củ và trái cây Tinh bột cũng có một ít trong lá Tinh bột gồm 2 cấu tử là amiloz và amilopectin đều do các đơn vị glucoz tạo nên Trong amiloz các gốc glucoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit tạo thành mạch thẳng Amilopectin có cấu tạo nhánh, ở điểm phân nhánh các gốc glucoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit và liên kết phụ α-1→6-glucozit Amiloz hòa tan dễ dàng trong nước ấm và trong dung dịch có độ nhớt không cao Amilopectin chỉ hòa tan trong nước nóng khi có áp suất và trong dung

dịch có độ nhớt rất cao Amiloz có phân tử lượng 10.000-100.000 Da, còn phân tử lượng của amilopectin lại xê dịch 50.000-1.000.000 Da Hóa tính đặc trưng nhất của tinh bột là phản ứng màu với iot Tinh bột tương tác với iot tạo màu xanh và đôi khi thấy màu đỏ Tinh bột được dùng để sản xuất glucoz, rượu etylic, thuốc thử iot, tá dược trong viên nén,…

+ Xenluloz là polisaccarit cấu trúc phổ biến nhất của thực vật và cũng là chất hữu cơ phổ biến nhất trên hành tinh của chúng ta Hằng năm lượng xenluloz do cây trồng tổng hợp nên là 1011tấn Xenluloz là thành phần chính của màng tế bào thực vật xenluloz chiếm 50% trong gỗ và 90% trong bông Xenluloz là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucoz kết hợp với nhau qua liên kết β-1→4-glucozit Số gốc glucoz trong xenluloz xê dịch 50.000-106 Da Xenluloz và dẫn xuất của nó có giá trị to lớn trong nhiều ngành (sợi, giấy sợi nhân tạo, chất dẻo, chất nổ )

+ Pectin là những chất polisaccarit pectin có phân tử lớn mà phần tử chính của phân tử cấu tạo bởi axit poligalacturonic, do đó được xếp vào nhóm poliuronic Pectin thường gặp trong các bộ phận của cây và một tảo Đặc biệt cùi trắng của một số cây họ cam quýt (rutaceate) như bưởi, cam, chanh chứa hàm lượng pectin rất cao, có thể lên đến 30% Pectin chia làm 2 loại : pectin hòa tan có trong dịch tế bào và protopectin là dạng không hòa tan nằm trong thành tế bào và các lớp gian bào

+ Gôm và các chất nhầy : Gôm là những polisaccarit được tiết ra ở dạng dịch keo khô ở những vết nứt, vết chặt, lỗ đục sâu,…như gôm arập từ cây Acacia verele mọc ở ven vùng sa mạc Ai cập Gôm có nguồn gốc bệnh lý

và sự tiết ra gôm là một phản ứng với điều kiện bất lợi

+ Chất nhầy phần lớn là polisaccarit thuộc nhóm galactomannan, thường có cấu trúc mạch thẳng chủ yếu tạo bởi gốc D- manopiranoz, kết hợp với nhau bằng mối liên kết β- 1→4 nhưng cũng có mạch nhánh tạo bởi các D-galactopiranoz (α-1→6) Chất nhầy là thành phần cấu tạo của tế bào bình

Do cấu trúc của polisaccarit rất phức tạp cho nên việc nghiên cứu cấu trúc, tính chất của từng loại polisaccarit còn có nhiều khó khăn và còn rất hạn chế

1.3 Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật

1.3.1 Vai trò sinh học và ý nghĩa kinh tế [Trần Thị Áng, 1997]

Polisaccarit thực vật cũng có các chức năng sinh học như học như các polisaccarit trong cơ thể sống khác khác đã trình bày ở phần đầu:

- Chúng giữ vai trò là chất dự trữ ở thực vật, như tinh bột trong tế bào chất, trong không bào và các cơ quan dự trữ, có nhiệm vụ giữ thế cân bằng áp suất thẩm thấu và quá trình trao đổi chất của tế bào sống

- Polisaccarit là thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào giữ vai trò bảo vệ: celluloz, hemicelluloz, pectin,… Polisaccarit ngoại bào giữ vai trò quan trọng trong các chức năng bảo vệ của thực vật như: chất nhầy ở các màng tế bào mặt ngoài rễ, chất dịch tiết ra khi khối mô bị tổn thương,

- Một số polisaccarit thực vật có tác dụng kiềm hãm quá trình lắng tụ hồng cầu, một số glucoprotein có thành phần giống glucoprotein của huyết thanh tham gia vào các “phản ứng miễn dịch” của thực vật Một số lipopolisaccarit có thành phần giống lipopolisaccarit của vi khuẩn gram (-) Các chất trên cũng giữ vai trò trong phản ứng bảo vệ của thực vật Do đó chứa 1 lượng lớn nhóm hydroxit (-OH) với đôi điện tử của nguyên tử oxi nên dọc theo phân tử polisaccarit có mật độ điện tử đậm đặc, điều đó làm dễ dàng tạo mối liên kết hydro giữa các phân tử làm bền cấu trúc bậc 2 của polisaccarit, đồng thời chúng dễ dàng liên kết với các phân tử biopolime khác của tế bào

- Pectin là polyuronic mạch thẳng chủ yếu là axit poligalacturonic được dùng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, dược phẩm và một số ngành công nghiệp khác

- Ngoài ra nhóm polisaccarit nhầy với cấu trúc phức tạp và đa dạng có vai trò quan trọng trong y học, dược học, công nghiệp thực phẩm,…

1.3.2 Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật

Theo y học cổ truyền thì nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương,…[Lê Xuân Thám,1999] Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng của chúng về tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng virut, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin [Zheng, 2009] Một số công trình nghiên cứu về tính chất hóa học và tác dụng chữa bệnh của polisaccarit đã được công

bố trên tạp chí khoa học

Năm 1992, Puhlann J công bố hai loại polisaccarit peptin chứa ion kim

loại chiết xuất từ Achyrocline Satureioides có hoạt tính miễn dịch và kháng

bổ thể trong môi trường in vitro đã công bố quy trình tách chiết và phương pháp nghiên cứu tính chất hóa học của polisaccarit từ cây cedrelatubifiora có hoạt tính kháng bổ thể intro [Grabowska, 1997] Một số galaclomannan và các dẫn xuất chứa sunfat của chúng được chiết xuất từ một số cây họ đậu có hoạt tính chống đông máu, phân hủy fibrin và kháng virut CB5 invitro

[Ooi,2000] Polisaccarit trung tính (Seleroglucan) từ Selerotium glucanicum

có tác dụng kháng virut mụn rộp Herpes loại [Stimpel, 1984]

Nhiều nghiên cứu cho thấy các polysaccarit từ thực vật có khả năng điều hòa miễn dich [Nath, 1992], kháng viêm [Ooi, 2000], làm tan các cục máu đông [Puhlann,1992], cải thiện hệ tuần hoàn máu ở tim [Zeny, 2009], khả năng quét các gốc tự do và chống ung thư [Ooi, 2000; Kainoor, 2009] Ví dụ

các polysaccarit tách từ Agaricus subrufescens [Lowry,1951], Lentinula edodes [Vetvicka, 2008], Sclerotium rofsii [Rice, 2005], các furanose chiết tách từ P

năng miễn dịch trong các chuột khỏe mạnh [Biondo, 2008] Fucans,

polysaccarit từ tảo Lobophora variegate có khả năng chống oxi hóa, quét các

gốc tự do [Kainoor, 2009], giảm sự giải phóng các TNFα [Almino , 2011]

Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu về các đặc tính sinh hóa của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xử lý nguyên liệu

Lá cây Xuân Hoa sau khi thu hái, rửa sạch, phơi chỗ râm mát đến ráo nước rồi sấy khô ở nhiệt độ khoảng 50-60oC ở trong tủ sấy, xay nhỏ lá thành bột

+ Cho 3ml dung dịch đã chiết vào ống nghiệm, nhỏ 5 giọt axetat chì 10% nếu phản ứng có kết tủa trắng chứng tỏ có polisaccarit

+ Cho 1ml dung dịch đã chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml xanh metylen Nếu sản phẩm cho màu xanh da trời thì chứng tỏ nguyên liệu là polisaccarit pectic

2.2.3 Định lượng polisaccarit bằng phương pháp phenol-sunfuric axit

- Nguyên lý cơ bản của phương pháp: Đây là phương pháp so màu

được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay để xác định nồng độ carbohydrat trong dung dịch [Dourado, 2004] Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là carbohydrat khi phản ứng với dung dịch axit sunfuric đặc, tạo ra sản phẩm là các dẫn xuất furfural Sự phát triển của các dẫn xuất furfural và phenol được xác định bằng phương pháp so màu

- Cách tiến hành phản ứng màu: Pha glucoz 1mg/ml rồi từ dung dịch

pha lấy ra lượng khác nhau( bảng 2.1), ống đối chứng thay bằng nước, cho tác dụng với 200µl phenol 5%, cho thêm 1ml axit sunfuric, để 10 phút, sau đó vortexed 30 giây và để 20 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đo ở bước sóng 490nm Mẫu đối chứng được chuẩn bị giống như trên, chỉ thay 400µl mẫu

bằng nước cất

Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz theo DuBoietal STT

Glucoz (1mg/ml)

(µl)

H 2 0 (µl)

Lượng glucoz (µg)

Phenol 5%

(µl)

Axit sunfuric (ml)

Dựa trên số đọc (OD) thu được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra

lượng polisaccarit trong dịch nghiên cứu Đồ thị chuẩn (xem phụ lục, hình 1)

2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry

- Nguyên lý cơ bản của phương pháp: phương pháp Lowry là phương

pháp mở rộng từ phản ứng Biure Phương pháp dựa trên nguyên tắc cơ bản sau đây :

+ Sự tạo thành phức hợp của đồng và protein trong dung dịch kiềm + Phức hợp của đồng và protein khử phosphomolyblic – phosphotungstate và tạo dung dịch có màu xanh đậm

Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định từ 20- 200 µg protein/ml

- Thiết bị, vật liệu và hóa chất

+ Dung dịch BSA (albumin huyết thanh bò) có nồng độ khác nhau (0.4, 0.8, 1.2, 1.6 và 2mg/ml)

+ Thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần sau khi mua sẵn

+ Thuốc thử A: 1.56g CuSO4.5H2O/100ml nước cất

+ Thuốc thử B: 2.37g sodium tartarte/100ml nước cất

+ Thuốc thử C: 2g NaOH + 10g Na2CO3/500ml nước cất

+ Thuốc thử D: Kết hợp và trộn 100ml thuốc thử C+1ml thuốc thử A+1ml thuốc thử B theo thứ tự

Chuẩn bị dung dịch BSA 4mg/ml, rồi pha loãng dung dịch với độ pha loãng 2 lần bằng H2O Lấy từ dịch pha loãng với các lượng khác nhau(bảng 2.2), ống đối chứng thay bằng nước cất,thêm 1ml dung dich D và để 10 phút, sau đó cho thêm 100µl thuốc thử folin pha loãng 2 lần, để 30 phút rồi tiến hành đo độ hấp thụ quang ở máy quang phổ ở bước sóng 620nm Dựa trên số đọc (OD) thu được đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (xem phần phụ lục hình 2) để tính ra lượng protein trong dịch nghiên cứu

Hàm lượng protein (%) được tính theo công thức:

Hàm lượng Protein tổng số(%) = p1×100/po