Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính kháng viêm, tăng cường miễn dịch của polisaccarit từ cây thuốc xuân hoa p palatiferum

SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA POLISACCARIT TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA P PALATIFERUM Người hường dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực : VŨ THỊ THU TRANG Lớp : 12-01 HÀ NỘI - 2016 SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm – Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện , môi trường tốt giúp thực tốt khóa luận Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hoài Bắc tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, phòng ban liên quan, Ban Chủ Nhiệm khoa công nghệ sinh học, toàn thể thầy cô giáo giảng dạy, hướng dẫn để có kiến thức ngày hôm Cuối cùng, xin bày tỏ tình cảm lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè tận tình giúp đỡ, động viên suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên VŨ THỊ THU TRANG SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu .1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Xuân Hoa 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 1.1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.1.4 Những nghiên cứu in vitro dược tính 1.1.5 Những nghiên cứu in vivo dược tính 1.2 Polisaccarit 1.2.1.Oligosaccarit 1.2.2 Polisaccarit 1.3 Vai trò sinh học tác dụng polisaccarit thực vật 13 1.3.1 Vai trò sinh học ý nghĩa kinh tế 13 1.3.2 Tác dụng chữa bệnh số polisaccarit thực vật 14 PHẦN II 17 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ 17 2.1 Vật liệu .17 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 17 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Xử lý nguyên liệu 17 2.2.2 Các phản ứng định tính đặc trưng 17 SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp 2.2.3 Định lượng polisaccarit phương pháp phenol-sunfuric axit 18 2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 19 2.2.5 Phương pháp tách chiết tinh polisaccarit 20 2.2.6 Đo độ hấp thụ quang phổ dung dịch polisaccarit 20 2.2.7 Xác định độ nhớt polisaccarit 20 2.2.8 Ảnh hưởng pH nhiệt độ tới chất lượng chế phẩm polisaccarit.21 2.2.9 Xác định hoạt tính kháng viêm invitro sử dụng phương pháp ức chế enzyme hyaluronidase theo phương pháp Reissig 21 2.2.10 Thử nghiệm tác dụng chế phẩm polisaccarit chuột tiêm cyclophosphamide 23 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Nghiên cứu thành phần polisaccarit nguyên liệu .24 3.1.1 Các phản ứng phát polisaccarit polisaccarit peptic 24 3.1.2 Thu nhận polisaccarit tinh từ Xuân Hoa 25 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh hóa polisccarit tinh 31 3.2.1 Xác định độ hấp thụ quang phổ polisaccarit 31 3.2.2 Độ nhớt dung dịch polisaccarit 31 3.2.3 Ảnh hưởng pH nhiệt độ tới chất lượng chế phẩm polisaccarit.32 3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học polisaccarit tinh từ Xuân Hoa 33 3.3.1 Xác định hoạt tính kháng viêm polisaccarit từ Xuân hoa in vitro 33 3.3.2 Thử nghiệm chế phẩm polisaccarit chuột tiêm cyclophosphamide 34 KẾT LUẬN 37 Kết luận 37 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 44 SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT A490 : Bước sóng A585 : Bước sóng 585nm BSA : Bovine seurum albumin CY : Cyclophosphamide OD : Optical density TCA : Axit tricloaxetic Hb : Hemoglobin HC : Hồng cầu BC : Bạch cầu SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz theo DuBoietal 18 Bảng 2.2: Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry 20 Bảng 2.3: Xác định khả kháng viêm polisacarit Xuân Hoa 22 Bảng 3.1: Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit polisaccarit peptic 24 Bảng 3.2: Phản ứng định tính so sánh dung môi chiết polisaccarit 27 Bảng 3.3: Hàm lượng polisaccarit dung môi chiết 27 Bảng 3.4: So sánh phương pháp loại protein Sevag TCA 29 Bảng 3.5: Xác định tác dụng ức chế hyaluronidase polisaccarit 33 Bảng 3.6: Sự thay đổi trọng lượng chuột ngày thí nghiệm 35 Bảng 3.7: Trọng lượng tương đối tuyến ức , lách, hàm lượng hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu(BC) 35 SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit 24 Hình 3.2 Sơ đồ chiết rút chế phẩm polisaccarit 30 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa 31 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến chế phẩm polisaccarit 32 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polisaccarit 32 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy dùng phổ biến tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa P palatiferum chứa hàm lượng cao polisaccarit Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ôrô Acanthaceae dùng dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn tiêu hoá, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ vết thương…Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý tập trung vào nhóm chất như: flavonoids, phytol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid… Cho đến chưa có công bố nghiên cứu đặc tính sinh hóa , dụng tác dụng kháng viêm tăng cường miễn dịch polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa Mục tiêu nghiên cứu - Chiết rút tinh polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa P palatiferum (Ness) Radlk có độ đạt 70% đến 80% - Xác định số đặc tính sinh hóa như: độ nhớt, độ polisaccarit, ảnh hưởng pH nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polisaccarit - Điều tra số tác dụng dược lý (tác dụng kháng viêm tăng cường miễn dịch) polisaccarit từ thuốc PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Xuân Hoa 1.1.1 Đặc điểm thực vật Bộ phận dùng: Lá Cây Xuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, có tên Tu Linh, Nhật Nguyệt hay Con Khỉ, Hoàn Ngọc, Thần dưỡng sinh, Trắc Mã, Điền Tích, Lan Điều Tên khoa học Pseuderanthemum Palatiferum Radik (Nees) Họ Ô rô (Acanthaceae) họ thực vật hai mầm thực vật có hoa, chứa khoảng 250 chi khoảng 2.700 loài Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), chi Pseuderanthemum có khoảng 196 loài Ở Việt Nam, chi Pseuderanthemum có loài thứ Đề tài nghiên cứu polisaccarit đối tượng Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Mô tả: Cây mọc cao từ 1-2m sống lâu năm, thân xanh màu tím lục, già chuyển thành màu nâu, phân nhiều nhánh, mọc đối diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp nguyên, cuống dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm Hoa mọc kẽ đầu cành Hoa lưỡng tính, không Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang nhiều nơi, coi thuốc quí có uy tín dân gian tỉnh thành miền Bắc, thủ đô Hà Nội Từ năm 1998, rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa bệnh thuộc nhóm bệnh đường tiêu hóa Hình 1.1: Cây Xuân Hoa 1.1.2 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đưa số thuốc từ kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa: • Chữa bệnh đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày khỏi, nấu canh nhạt để ăn • Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dày, đường ruột, đái máu, phân máu kể đái buốt, đái rắt,…): ăn đói sắc nước đặc để uống, nấu canh độ bát nhỏ Ăn 1-5 lần, máu cầm, nên ăn ngày lần • Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn xong, đau giảm dần, người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác khỏi bệnh Thử nghiệm qua số bệnh ung thư dày, gan, phổi,… thấy có diễn biến tốt Lượng dùng thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày lần, lần 3-7 lá, tùy theo hiệu giảm đau • Các bệnh u phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng trên, sau tuần triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khoảng tháng liên tục 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh hóa polisccarit tinh 3.2.1 Xác định độ hấp thụ quang phổ polisaccarit Để khảo sát độ chế phẩm polisaccarit chiết từ Xuân Hoa Trong trình chiết rút, đo độ hấp thụ quang phổ từ 200700nm Khi tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ dịch chiết dung dịch polisaccarit qua giai đoạn tinh sạch, nhận thấy chế phẩm polisaccarit đạt độ cho phép đường hấp thụ ánh sáng dung dịch đỉnh bước sóng từ 200-220nm Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa 3.2.2 Độ nhớt dung dịch polisaccarit Để tiến hành đo độ nhớt dung dịch polisaccarit chiết xuất từ Xuân Hoa, chế phẩm polisaccarit sau tinh hòa tan dạng dung dịch (1,5%) Sau đo độ nhớt nhớt kế mao quản Fann VG Ở 20oC, chế phẩm polisaccarit tinh từ Xuân Hoa có độ nhớt tuyệt đối 0,0122 31 3.2.3 Ảnh hưởng pH nhiệt độ tới chất lượng chế phẩm polisaccarit Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến chế phẩm polisaccarit 120 % polisaccarit tương đối 100 100 86.4 80 65.1 65.2 65.9 81.34 72 65.32 60 40 20 pH Dựa đồ thị ta thấy pH khác có ảnh hưởng khác đến polisaccarit, pH = (pH trung tính), chất lượng polisaccarit chế phẩm không thay đổi, đạt 100% Ở pH acid kiềm chất lượng polisaccarit chế phẩm bị giảm nhẹ khoảng (15-35%) Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polisaccarit Dựa vào kết ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng không đáng kể đến chất lượng chế phẩm polisaccarit tinh 32 3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học polisaccarit tinh từ Xuân Hoa Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, chống ung thư, chống oxi hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy polysaccarit từ thực vật có khả điều hòa miễn dịch [Indranil C,2011] ,kháng viêm Tuy nhiên, chưa có công bố nghiên cứu đặc tính sinh hóa tác dụng sinh học polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa Vì tiến hành nghiên cứu, đánh giá số tác dụng sinh học protease từ thuốc: kháng tế bào ung thư, tăng khả miễn dịch, khả kháng viêm 3.3.1 Xác định hoạt tính kháng viêm polisaccarit từ Xuân hoa in vitro Bảng 3.5: Xác định tác dụng ức chế hyaluronidase polisaccarit tinh STT Tên mẫu Giá trị EC50(mg/ml) Mẫu Polisaccarit tinh >1,6 từ Xuân Hoa Hình 3.6 Xác định hoạt tính ức chế enzyme hyaluronidase polysaccharit từ Xuân Hoa Đối chứng âm; nước Đối chứng dương Hyaluronidase thủy phân HA 33 3; 4; 5; 6: Polysaccharit nồng độ (0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg) Kết hình 3.6 bảng 3.5 cho thấy polisaccarit từ Xuân Hoa khả ức chế hoạt động emzyme hyaluronidase Trong polisaccarit từ tảo biển Porphyridium purpureum với hàm lượng (IC50 = 0.210 mg/mL) ức chế hyaluronidase [Tamio, 2013] Có nhiều chế kháng viêm, nhiên khuôn khổ luận án tiến hành kiểm tra khả ức chế hyaluronidase (enzyme thúc đẩy hoạt động nhân tố gây viêm mô) 3.3.2 Thử nghiệm chế phẩm polisaccarit chuột tiêm cyclophosphamide [Nguyễn Gia Chấn,1998] Chuột thí nghiệm gây suy giảm miễn dịch theo mô hình thí nghiệm Phan Thị Phi Phi năm 1998 cộng Chuột tiêm cyclophosphamide (CY) Cyclophosphamide chất gây tổn thương cấu trúc chức hệ miễn dịch chuột Chuột tiêm với liều 250mg/kg thể trọng phúc mạc Mục đích thí nghiệm nhằm nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch, phục hồi tổn thương cấu trúc chức hệ miễn dịch chuột tiêm cyclophosphamide polisaccarit chiết xuất từ Xuân Hoa Chuột nhắt trắng dòng Swiss chủng có trọng lượng trung bình từ 2,3g/con Chia làm lô lô 10 : Lô đối chúng sinh học (lô I), lô đối chứng thí nghiệm ( lô II), lô thí nghiệm ( lô III) Lô I tiêm nước cất, lô II, III, IV, V tiêm cyclophosphamide(CY) với liều 250mg/kg thể trọng vào phúc mạc ngày thứ Lô I II cho uống nước cất 0,15ml/con/ ngày ngày Lô III cho uống chế phẩm polisaccarit tinh từ Xuân Hoa với liều uống 150mg/kg thể trọng chuột ngày làm thí nghiệm Ngày thứ cân lại trọng lượng mổ chuột để làm tiêu sinh hóa Kết trình bày bảng 3.6: 34 Bảng 3.6: Sự thay đổi trọng lượng chuột ngày thí nghiệm Lô Trọng lượng Trọng lượng ban đầu (po)g ngày Tỉ lệ p1/po(%) thí nghiệm (p1)g I 23,39±1,01 25,67±0,79 109,75 II 23,50±1,15 21,16±1,24 90,04 III 23,85±1,13 22,65±1,07 96,88 Kết cho thấy trọng lượng lô II, III giảm so với lô đối chứng sinh học trọng lượng lô III cao lô II khác không rõ rệt Bảng 3.7: Trọng lượng tương đối tuyến ức , lách, hàm lượng hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu(BC) Lô Trọng lượng tương Hb(g%) HC(triệu) BC I 2,32±0,27 3,72±0,28 15,58±0,52 7,33±0,33 6765 II 1,23±0,26 3,31±0,15 14,90±0,54 7,13±0,26 5859 III 1,46±0,16 3,37±0,24 15,38±0,51 7,41±0,36 7720 đối Tuyến ức Lách Kết bảng 3.7 cho thấy: Trọng lượng tương đối tuyến ức giảm rõ rệt lô II (chuột gây tổn thương chức miễn dịch) so với lô I (chuột khỏe mạnh, bình thường), trọng lượng tương đối tuyến ức tăng lô III (chuột gây tổn thương chức miễn dịch điều trị polisaccarit tinh từ Xuân Hoa so với lô II - Trọng lượng tương đối lách lô II giảm nhẹ so với lô I, điều trị polisaccarit tinh từ Xuân Hoa trọng lượng tương đối lách lô III phục hồi so với lô (II) không điều trị 35 - Hàm lượng Hb số lượng HC lô đối chứng I, II, III không thấy thay đổi rõ rệt - Số lượng bạch cầu giảm mạnh lô II (5859) so với lô I (6765) Ở lô III, số lượng bạch cầu tăng rõ rệt (7720) so với lô II (5859) Điều chứng tỏ chế phẩm polisaccarit tinh từ Xuân Hoa giúp cho thể chuột phản ứng tạo bạch cầu chống lại chất cyclophosphamide (chất gây tổn thương hệ miễn dịch chuột) Qua thí nghiệm nhận thấy polisaccarit tinh từ Xuân Hoa có tác dụng tăng bạch cầu rõ rệt nhất, điều phù hợp với nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan số tác giả khảo sát [Trần Công Khánh,1997] Các kết thu phần phù hợp với kết nghiên cứu trước khả tăng cường miễn dịch polisaccarit thử nghiệm chuột: polisaccarit dương quy di thực nhật có dụng phục hồi số tổn thương cấu trúc chức đáp ứng miễn dịch tế bào chuột xử lí cyclophosphamide [Nguyễn Gia Trấn,1997; Sukurai,1996], furanose chiết tách từ P quiquefolium pectin từ Buplerum falcatum Malus (apple) spp tăng khả miễn dịch chuột khỏe mạnh [Biondo ,2008] Các kết cho thấy hàm lượng polisaccarit Xuân Hoa tương đối cao có giá trị sử dụng làm nguyên liệu thuốc Các nghiên cứu số liệu bước đầu đánh giá số tác dụng sinh học polisaccarit tinh từ thuốc Xuân Hoa Cần nhiều thời gian, kinh phí công sức để đánh giá khẳng định tác dụng tăng cường miễn dịch phát tác dụng sinh học khác thuốc quý 36 KẾT LUẬN Kết luận - Hàm lượng polisaccarit từ Hoa cao (7,5± 1,6 %), nguồn polisaccarit giá trị cho nguyên liệu thuốc - Xây dựng quy trình tách chiết tinh polisaccarit Xuân Hoa có độ khoảng (77,8%), chế phẩm polisaccarit tinh đạt (2,3g/100g nguyên liệu khô) - Đã nghiên cứu số đặc tính sinh hóa polisaccarit tinh sạch: độ nhớt tuyệt đối 0,0122 chế phẩm polisaccarit tinh bền không bị ảnh hưởng nhiệt độ, pH acid kiềm chất lượng polisaccarit chế phẩm bị giảm khoảng (15 đến 35%) - Chế phẩm polisaccarit tinh từ Xuân Hoa có khả phục hồi số chức quan tuyến ức, lách làm tăng số lượng bạch cầu chuột tiêm cyclophosphamide (CY) - Chế phẩm polisaccarit tinh từ Xuân Hoa không ức chế enzyme hyaluronidase (một enzyme gây viêm) Đề nghị Đây kết ban đầu xác định hàm lượng polisaccarit thu nhận polisaccarit bán tinh từ Xuân Hoa Cần có thời gian, công sức kinh phí để: Hoàn thiện quy trình chiết rút tinh polisaccarit 90% Sử dụng phương pháp khác để khẳng định tác dụng kháng viêm phát tác dụng sinh học khác polisaccarit từ thuốc quý 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Lê Thị Lan Oanh, Võ Hoài Bắc, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thị Dung, Hoa Thị Hằng, Trần Thị Thơm , “Khảo sát số tiêu sinh hóa tác dụng thủy phân protein Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum(Nees)”, Tạp chí Dược liệu 1999, (1), tr 13-17 Lê xuân Thám, Trần hữu Độ Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư Việt nam: Nấm Chân Chim Tạp chí dược học 1999 ,8, tr.10-12 Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Công Hào, Phan Phước Hiền , “Triterpenoid steroid phân lập từ Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum, Acanthaceae”, Tuyển tập công trình Hội nghị Khoa học Công nghệ Hóa học Hữu Toàn quốc lần thứ ba, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 2005, tr 422-425 Nguyễn Gia Chấn, Lê Minh Phương, Bùi Thị Bằng, Phan Thị Phi Phi, Phạm Thu Anh, Đỗ Hòa Bình Tác dụng phục hồi miễn dịch polysaccharide chiết xuất từ rễ củ đương quy Tạp chí Dược liệu 1998 , (3), tr 49-52 Nguyễn Gia Chấn, Thái Thanh Hải, Nguyễn Thị Thanh Hương, Bùi Thị Bằng Đặc điểm sinh hóa dương quy Nhật Bản, trồng Thái Nguyên Tạp chí dược liệu1997, (2), tr 18-22 Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng , “ Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa”, Tạp chí Dược Liệu 2000, (6), tr 16 Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Trần Vân Hiền, Tạ Thị Phòng, Trần Lê Du Thử độc tính cấp diễn tác dụng bảo vệ tế bào gan Xuân Hoa Tạp Chí Dược Học 1999, 9, tr.15-17 38 Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quyết Chiến , “Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk”, Tạp chí Khoa học Công nghệ 2004, 2, tr 75-79 Phạm Hoàng Hộ , “Cây cỏ Việt Nam”, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh 2000, tr.67 10 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Trường Thực hành hóa sinh học Nxb Giáo dục 1997 11 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng- Hóa sinh học Nxb Giáo dục 1997 12 Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn, “Phytochemical study on Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk., Acanthaceae”, Tạp chí Hóa học 2003, 41 (2), tr 115-118 13 Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá khảo sát sơ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết giàu flavonoid từ Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Tạp chí Dược học 2005, 45 (9),tr 9-12 14 Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài Lê Mai Hương Góp phần nghiên cứu thực vât, thành phần hóa học tác dụng sinh học Xuân Hoa Tạp chí Dược liệu 1998, (3), tr 37- 41 15 Trần Công Khánh Sự thật thuốc "kỳ diệu", Xuân Hoa Tạp chí thuốc sức khỏe 1997, 101, tr 10 - 11 16 Trần Kim Thu Liễu, Nguyễn Kim Phi Phụng , “Contribution to the study on chemical constituents of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk (Acanthaceae)”, Tuyển tập công trình Hội nghị Khoa học Công nghệ Hóa học Hữu Toàn quốc lần thứ tư, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 2007, tr 426-429 17 Võ Hoài Bắc Lê Thị Lan Oanh Hàm lượng acid amin nguyên tố khoáng Xuân Hoa Tạp chí dược liệu 2003, (8), tr.11 – 15 39 18 Xuân Lục (2005), “Cây thuốc diệu kỳ, Tu lình, thuốc nhiều tên nhiều tác dụng”, Tạp chí dược liệu sức khỏe cộng đồng, 2, tr.22-23 Tài liệu tiếng Anh: 19 Puhlann J, knaus U, Tubar L, Schaefer W, Waguer H – Immunologically active metalic, ion-contanining polisaccarit of Achyrocline satureioides phytochemistry 1992, Vol.31, No 8: 2617-2621 20 Almino Afonso de O Paiva , Allisson J.G Castro , Marília S Nascimento , Luiza Sheyla E.P Will , Nednaldo D Santos , Renata M Araújo , Caroline A.C Xavier ,Francisco Airton Rocha , Edda Lisboa Leite Antioxidant and anti-inflammatory effect of polysaccharides from Lobophora variegata on zymosan-induced Immunopharmacology 2011, arthritis 11(9):1241-11 in Asian rats International Natural Products Research, 11(4), 306–321 21 Biondo PD, Goruk S, Ruth MR, O’Connell E, Field CJ: Effect of CVT-E002 (COLD-fX) versus a ginsenoside extract on systemic and gutassociated immune function Int Immunopharmacol 2008, 8:1134-1142 22 Chan Y, Chang T, Chan CH, Yeh YC, Chen CW, Shieh B, et al: Immunomodulatory effects of Agaricus blazei Murill in Balb/cByJ mice J.Microbiol Immunol Infect 2007, 40:201-208 23 Dieu HK., Loc CB, Yamasaki S, “The effects of Pseuderanthemum palatiferum, a new medicinal plant, on growth performances and diarrhea of piglets”, Japa Agri Res Qua 2006, 40 (1): 85-91 24 Dourado F, Madureira P, Carvalho V, Coelho R, Coimbra MA and Vilanova M Purification, structure and immunobiological activity of an arabinan-rich pectic polysaccharide from the cell walls of Prunus dulcis seeds Carbohydr Res 2004, 339: 2555–2566 25 Ghiware N.B., Aseemuddin N, Kawade R.M, Vadvalkar S.M, “Pharmacological Exploration Of Saccharum officinarum Leave Extracts For 40 Its Anti-Oxidant And Anti-Inflammatory Activity” International Journal of Pharm Tech Research 2012 , 4(4): 1785-1791 26 Grabowska E., Eckert K., Fichtner I., Schulze-Forster K., Maurer H R Bromelain proteases suppress growth, invasion and lung metastasis of B16F10 mouse melanoma cells Int J Oncol 1997, 11: 243–248 27 Hasek, Basnet P, Kadota S, Namba T- imnunostimulating activity of Celosian, an antihepatoxoxic polisaccarit isolated From celosia argentea Plan Medica 1997, 63: 126-219 28 Indranil C, Usha S, Sanat K B, Mangala L and Sadhan K D.A Protease Isolated from the Latex of Plumeria rubra Linn (Apocynaceae) 2: Anti-inflammatory and Wound-Healing Activities.Tropical Journal of Pharmaceutical Research December 2011, 10 (6): 755-760 29 Kainoor K Janardhanan Anti-inflammatory and Free Radical Scavenging Activities of Polysaccharide−Protein Complex Isolated from Phellinus rimosus (Berk.) International Journal of Medicinal Mushrooms 2009, (11): 365-373 30 Lim BO, Lee SH, Park DK, Choue RW: Effect of dietary pectin on the production of immunoglobulins and cytokines by mesenteric lymph node lymphocytes in mouse colitis induced with dextran sulfate sodium Biosci Biotechnol Biochem 2003, 67:1706-1712 31 Lowry O.H, Rosebrough N.J, Farr A.L, and Randall R.J, J.Biol.Chem 1951, 193: 265 (The original method) 32 Luo A, and Fan Y, Int J Mol Sci 2011:4068-4079 33 Nath LK, Dutta SK Wound healing Response of the Proteolytic Enzyme Curcain Indian J.Pharmacol 1992, 24: 114-115 34 Oliveira R, Marques F, Azeredo J Purification of polysaccharides from a biofilm matrix by selective precipitation Biotechnology Techniques June 1999, (13):,391-393 41 of proteins 35 Ooi VE, Liu F Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes Curr Med Chem 2000, 7:715–729 36 Peerawit Padee, Somsak Nualkeaw, Chusri Talubmook, Supasorn Sakuljaitrong, “Acute toxicity and sub-acute toxicity of Pseuderanthemum palatiferum”, Isan Journal of Pharmaceutical Sciences 2009, (1): 74-81 37 Rabelo A.P.B, E.B Tambourgi, A Pessoa Jr Bromelain partitioning in two- phase aqueous systems containing PEO–PPO–PEO block copolymers J Chromatogr 2004, B 807: 61–68 38 Rice PJ, Adams EL, Ozment-Skelton T, Gonzalez AJ, Goldman MP, Lockhard BE, et al: Oral delivery and gastrointestinal absorption of soluble glucans stimulate increased resistance to infectious challenge J Pharmacol Exp Ther 2005, 314:1079-1086 39 Sakurai M.H, Matsumoto T, Yamada H Detection and tissue distribution of enti-ulcer pectic polisaccarit from bupleurum falcatum by policlonal antibody, planta Medica 1996, 62: 346-399 40 Staub AM Removal of protein—Sevag method Method Carbohydr Chem 1965, 5:1-5 41 Stimpel M, Proksch A, Wagner H and Lohmann-Matthes ML Macrophage activation and induction of macrophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea Infect Immun 1984, 46: 845–849 42 Tamio M, Mariko Y, Yoshiho K, Hideo E and Shinobu I Hyaluronidase-inhibiting Acidic Polysaccharide Isolated from Porphyridium purpureum 2013, 椙山女学園大学研究論集 第 44 号（自然科学 43 Vetvicka V, Vashishta A, Saraswat-Ohri S, Vetvickova J: Immunological effects of yeast- and mushroom-derived beta-glucans J Med Food 2008, 11:615-622 42 44 Zheng Q, Feng Yi, Xu D S, Lin X , Chen Y Z, Influence of sulfation on antimyocardial ischemic activity of Ophiopogon japonicus polysaccharide J Asian Nat Prod Res 2009, 11(4):306-21 43 PHỤ LỤC Hình 1: Đồ thị chuẩn glucoz theo phương pháp DuBoietal Hình 2: Đồ thị chuẩn BSA theo phương pháp Lowry 44 Hình 3: Phương trình hồi quy tuyến tính HA OD 0.4 y = 0.69x + 0.003 R2 = 0.996 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.1 0.2 0.3 45 0.4 0.5 HA (mg) 0.6 [...]... cơ bản của phương ph p: phương ph p Lowry là phương ph p mở rộng từ phản ứng Biure Phương ph p dựa trên nguyên tắc cơ bản sau đây : + Sự tạo thành phức h p của đồng và protein trong dung dịch kiềm + Phức h p của đồng và protein khử phosphomolyblic – phosphotungstate và tạo dung dịch có màu xanh đậm Phương ph p này có thể được sử dụng để xác định từ 20- 200 µg protein/ml - Thiết bị, vật liệu và hóa... chì và kết tủa với etanol 96o) Dịch chiết từ lá cây Xuân Hoa khô có polisaccarit tồn tại dưới dạng hòa tan Phản ứng ở thuốc thử xanh metylen (đặc trưng cho poliscacarit peptic) của dịch chiết lá Xuân Hoa chúng tôi thấy kết quả âm tính Như vậy trong thành phần dịch chiết từ lá cây Xuân Hoa không có polisaccarit peptic 3.1.2 Thu nhận polisaccarit tinh sạch từ lá cây Xuân Hoa 3.1.2.1 Lựa chọn phương ph p. .. polisaccarit, tuy nhiên dịch chiết sử dụng etanol 25% cho phản ứng định tính polisaccarit cao nhất Chúng tôi tiến hành định lượng polisaccarit tổng số trong các dịch chiết theo 3 phương ph p chiết rút như đã mô tả ở trên Tiến hành xác định hàm lượng polisaccarit theo phương ph p phenol-sunfuric axit của DuBoietal và xác định protein theo phương ph p Lowry trong các dịch chiết 1, 2, 3 26 Bảng 3.2: Phản... phương ph p chiết rút hiệu quả polisaccarit Để tìm ra cách chiết polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa đạt hiệu quả cao, dựa vào nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và Việt Nam như : tách chiết polisaccarit từ cây Dipsacus asperoides [Lim, 2003], và chiết rút polisaccarit từ nấm hương [Chan, 2007,] Chúng tôi đã lựa chọn chiết polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa với 3 dung môi etanol 25%, chloroform, và nước... polisaccarit của nguyên liệu 3.1.1 Các phản ứng phát hiện polisaccarit và polisaccarit peptic Để khảo sát sơ bộ, chúng tôi đã tiến hành thu nhận dịch chiết từ nguyên liệu và thực hiện các phản ứng định tính đặc trưng cho polisaccarit và polisaccarit peptic Bảng 3.1: Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit và polisaccarit peptic Nguyên liệu Xuân Hoa Phản ứng định tính NaOH Axetat Etanol 10% chì 96% ++++ ++++... ở trên, phần dịch tủa ở giữa, phần dịch trong ở dưới Tiến hành xác định protein và polisaccarit ở 3 phần Chúng tôi nhận thấy polisaccarit phần lớn t p trung ở dịch ở trên nhưng vẫn có protein, phần tủa ở giữa phần lớn là protein và phần dịch dưới chứa cả protein và polisaccarit Hút nhẹ lấy phần dịch trong ở trên và ti p tục cho sevag như trên (l p lại 3lần) Sau khi loại protein bằng sevag, dịch trong... lị b) Hoạt tính kháng oxy hóa Các nghiên cứu [Phan Minh Giang, 2005] đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây Xuân Hoa bằng phương ph p nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt động của enzyme peroxydase trong máu Kết quả cho thấy cả hai loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa 1.1.5 Những nghiên cứu in... công bố quy trình tách chiết và phương ph p nghiên cứu tính chất hóa học của polisaccarit từ cây cedrelatubifiora có hoạt tính kháng bổ thể intro [Grabowska, 1997] Một số galaclomannan và các dẫn xuất chứa sunfat của chúng được chiết xuất từ một số cây họ đậu có hoạt tính chống đông máu, phân hủy fibrin và kháng virut CB5 invitro [Ooi,2000] Polisaccarit trung tính (Seleroglucan) từ Selerotium glucanicum... quan trọng của chúng về tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng virut, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin [Zheng, 2009] Một số công trình nghiên cứu về tính chất hóa học và tác dụng chữa bệnh của polisaccarit đã được công bố trên t p chí khoa học Năm 1992, Puhlann J công bố hai loại polisaccarit peptin chứa ion kim loại chiết xuất từ Achyrocline Satureioides có hoạt tính miễn dịch và kháng bổ... dụng TCA 2.2.6 Đo độ h p thụ quang phổ của dung dịch polisaccarit Để khảo sát độ sạch của chế phẩm polisaccarit, hòa tan polisaccarit bằng nước cất sau đó đo độ h p thụ quang phổ của dung dịch polisaccarit trên máy quang phổ (8452A-DIODE ARAYSPECTROPHOTOMETER) 2.2.7 Xác định độ nhớt polisaccarit Hòa bột polisaccarit trong nước ở các nồng độ khác nhau Sau đó đo độ nhớt của dung dịch trên nhớt kế Fann