Nghiên cứu tinh sạch và ảnh hưởng của polysaccarit từ cây thuốc xuân hoa psederanthemum palatiferum (nees) ralk trên các cytokine tiền viêm trên mô hình in vitro

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA POLISACCARIT TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RALK TRÊN CÁC CYTOKINE TIỀN VIÊM TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực : NGUYỄN THANH THỦY Lớp : 13-01 HÀ NỘI - 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA POLISACCARIT TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RALK TRÊN CÁC CYTOKINE TIỀN VIÊM TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực : NGUYỄN THANH THỦY Lớp : 13-01 HÀ NỘI - 2017 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm – Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, môi trường tốt giúp thực tốt khóa luận Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hoài Bắc tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, phòng ban liên quan, Ban Chủ Nhiệm khoa cơng nghệ sinh học, tồn thể thầy giáo giảng dạy, hướng dẫn để tơi có kiến thức ngày hôm Cuối cùng, xin bày tỏ tình cảm lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè tận tình giúp đỡ, động viên suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên NGUYỄN THANH THỦY Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu đề tài PHẦN I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm viêm 1.2 Vai trò đại thực bào (macrophage) đáp ứng viêm 1.3 Vai trò cytokine đáp ứng viêm 1.4 Giới thiệu chung Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum 1.5 Polisaccarit 1.5.1 Oligosaccarit 1.5.2 Polisaccarit 1.6 Vai trò sinh học tác dụng polisaccarit thực vật 12 1.6.1 Vai trò sinh học ý nghĩa kinh tế 12 1.6.2 Tác dụng chữa bệnh số polisaccarit thực vật 12 1.7 Những nghiên cứu Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum 14 1.7.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 14 1.7.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 15 1.7.3 Những nghiên cứu in vitro dược tính 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 20 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Xử lý nguyên liệu 20 2.2.2 Định lượng polisaccarit phương pháp phenol - sunfuric axit (Dubois, 1956) 21 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc 2.2.3 Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit 22 2.2.3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết rút polisaccarit 22 2.2.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết rút polisaccharit 22 2.2.3.3 Xác định thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 23 2.2.3.4 Xác định tỷ lệ ngun liệu dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 23 2.2.4 Phương pháp tinh polisaccarit 24 2.2.5 Đo độ hấp thụ quang phổ dung dịch polisaccarit 25 2.2.6 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC xác định độ trọng lượng phân tử polisaccarit 25 2.2.7 Phương pháp xác định mức ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống sót đại thực bào 25 2.2.8 Phương pháp định lượng nồng độ cytokine IL-6 TNF-α 26 2.2.9 Phân tích thống kê 27 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit 28 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết rút polisaccarit 28 3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết rút polisaccarit 29 3.1.3 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 30 3.1.4 Tỷ lệ ngun liệu dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 31 3.2 Tinh polisaccarit 32 3.3 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit 34 3.4 Kiểm tra độ trọng lượng phân tử chế phẩm polisaccarit 35 3.5 Đánh giá hoạt tính độc tố polisaccarit tới khả sống tế bào macrophage 37 3.6 Đánh giá ảnh hưởng polisaccarit đến giải phóng cytokine 37 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 48 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz 21 Bảng 3.1 Hoạt tính polisaccarit phân đoạn qua cột Sephadex G100 33 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Xn Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất 29 Hình 3.3 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 30 Hình 3.4 Tỷ lệ dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 31 Hình 3.5 Sắc ký qua cột Sephadex G100 32 Hình 3.6 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit 34 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa 35 Hình 3.8 Phổ sắc ký thẩm thấu gel GPC polisaccarit tinh từ Xuân Hoa P palatiferum 36 Hình 3.9 Ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống chết tế bào RAW264.7 37 Hình 3.10 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng 38 IL-6 38 Hình 3.11 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng TNF-α39 Hình 1: Đồ thị chuẩn glucoz theo phương pháp DuBoietal 48 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT A490 : bước sóng 490nm A585 : bước sóng 585nm BSA : albumin huyết bò OD : optical density TCA : axit tricloaxetic IL-6 : interleukin-6 Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tại Việt Nam, bệnh viêm thường sử dụng thuốc tổng hợp Các thuốc điều trị viêm glucocorticoid, phenylbutazol, dielofenac…cần phải sử dụng dài ngày thường gây hiệu phụ cho sức khỏe người bệnh Vì vậy, hướng nghiên cứu sử dụng hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Y, Dược thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược giảm tác dụng phụ chi phí điều trị Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy dùng phổ biến tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa P palatiferum chứa hàm lượng cao polisaccarit có tác dụng tăng cường miễn dịch chuột tiêm chất gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ơrơ Acanthaceae dùng dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn tiêu hoá, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ vết thương…Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết Tuy nhiên, việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý tập trung vào nhóm chất như: flavonoids, phytol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid…Cho đến chưa có cơng bố nghiên cứu sâu đặc tính sinh hóa, tác dụng kháng viêm Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa Trong khóa luận chúng tơi tinh xác định ảnh hưởng polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa P palatiferum cytokine tiền viêm mơ hình in vitro Các kết nghiên cứu đề tài góp phần bổ sung thơng tin khoa học thuốc quý Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Tinh polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa P Palatiferum (Ness) Radlk có độ 95% - Xác định độ trọng lượng phân tử polisaccarit - Đánh giá ảnh hưởng polisaccarit tinh cytokine tiền viêm mơ hình in vitro Nguyễn Thanh Thủy Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc 3.3 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit Lá xuân hoa nguyên liệu Loại bỏ hư hỏng, dập nát, héo úa Sấy khô (50-60oC ;4-5h) Xay—> nguyên liệu bột thô(30g) Rửa, làm khô, cắt cuống Dịch hỗn hợp chứa polisaccarit (1) Chiết etanol 25% (tỷ lệ 1g:10 V (ml) dung môi) ; 70oC 12h Dịch chứa polisaccarit (2) Li tâm 8.000 vòng 30 phút 8oC Loại cặn bã Tủa ethanol Tủa trắng (chế phẩm sơ tinh sạch) (3) (1V dịch: V etanol 100%) , để qua đêm 4oC Li tâm 8.000 vòng 30 phút 8°C Dịch chứa chế phẩm polisaccarit tinh sơ (4) Hòa tủa, xử lý TCA 10% qua đêm Li tâm 8.000 vòng 30 phút 8oC Loại tủa protein thu dịch Chế phẩm XH có độ đạt 77,8 % Tủa etanol tỉ lệ (1 dịch :3 etanol 100%) Chế phẩm XH tinh qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 Hòa tủa chế phẩm polisaccarit bán tinh Cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 199,64 mg Chế phẩm XH tinh 97±2,1% Hình 3.6 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit Nguyễn Thanh Thủy 34 Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hoài Bắc 3.4 Kiểm tra độ trọng lượng phân tử chế phẩm polisaccarit Để khảo sát độ chế phẩm polisaccarit chiết từ Xuân Hoa P palatiferum Trong trình chiết rút, chúng tơi đo độ hấp thụ quang phổ từ 200-700nm Khi tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ dịch chiết dung dịch polisaccarit qua giai đoạn tinh sạch, nhận thấy chế phẩm polisaccarit đạt độ cao đường hấp thụ ánh sáng dung dịch đỉnh bước sóng từ 200-220nm (hình 3.7) Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa Nguyễn Thanh Thủy 35 Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc Độ trọng lượng phân tử polisaccarit sau tinh qua cột Sephadex G100 đánh giá qua sắc ký thẩm thấu gel GPC Hệ thống sắc ký lỏng thẩm thấu/lọc gel dùng để xác định xác cỡ trọng lượng phân tử sinh học hay đặc tính polymer Kết từ sắc ký GPC cho thấy phân bố trọng lượng phân tử hẹp, chất thu có độ cao, trọng lượng phân tử (Mw = 2321 g/mol) (hình 3.8) Kết hợp đánh giá chế phẩm tinh phương pháp phenol-sunfuric axit (Dubois, 1956), chế phẩm polisaccarit tinh sau qua cột sephadex G100 có độ tinh đạt (97 ± 2,1 %) Hình 3.8 Phổ sắc ký thẩm thấu gel GPC polysaccharit tinh từ Xuân Hoa P palatiferum Do cấu trúc polisaccarit phức tạp việc nghiên cứu cấu trúc polisaccarit khó khăn, đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu sâu Nguyễn Thanh Thủy 36 Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc 3.5 Đánh giá hoạt tính độc tố polisaccarit tới khả sống tế bào macrophage Ảnh hưởng polisaccarit tinh từ Xuân Hoa P Palatiferum (XH) (lên khả sống xót đại thực bào RAW264.7 xác định thí nghiệm MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium bromide) Khả sống xót tế bào giếng tra thuốc XH nồng độ 10, 20, 30 µg/ml khơng có khác biệt đáng kể so với khả sống xót tế bào giếng đối chứng sinh học (giếng tế bào ni mơi trường ni cấy) (Hình 3.9) Kết cho thấy polisaccarit tinh khơng có khả gây độc với đại thực bào Nồng độ sử dụng cho thí nghiệm Hình 3.9 Ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống chết tế bào RAW264.7 P> 0,05 ( khơng có sai khác nhóm ) 3.6 Đánh giá ảnh hưởng polisaccarit đến giải phóng cytokine Trong năm gần polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, chống ung thư, chống oxi hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy polisaccarit từ thực vật có khả điều hòa miễn Nguyễn Thanh Thủy 37 Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc dịch (Indranil, 2011), kháng viêm Kết nghiên cứu trước cho thấy chế phẩm polisaccarit tinh phần (độ 77,8%) từ Xuân Hoa có khả phục hồi số chức quan tuyến ức, lách điều hòa miễn dịch chuột tiêm chất gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamide (luận văn Vũ Thị Thu Trang, sinh viên K19, Viện Đại học Mở) Trong luận văn này, đánh giá ảnh hưởng polisaccarit tinh hồn tồn đến giải phóng cytokine tiền viêm mơ hình in vitro Để đánh giá hiệu polisaccarit tinh từ Xuân Hoa Hoa P Palatiferum trình này, Polisaccarit nồng độ 5, 10 µg/ml mơi trường ni cấy tra vào giếng tế bào RAW 264.7 Cảm ứng đại thực bào RAW 264.7 LPS với nồng độ µg/ml 24 theo mô tả chi tiết phần phương pháp Lần lượt thu dịch nồng độ để phục vụ cho bước thí nghiệm phân tích cytokine Hình 3.10 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng IL-6 #: khác có ý nghĩa nhóm gây cảm ứng LPS (+) so với nhóm đối chứng khơng gây LPS (-); *: khác có ý nghĩa nhóm LPS điều trị XH (10µg) so với nhóm LPS khơng điều trị LPS điều trị XH (5µg) Nguyễn Thanh Thủy 38 Lớp: 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS Võ Hồi Bắc Từ hình 3.10 cho thấy tất nhóm đại thực bào RAW 264.7 gây cảm ứng giải phóng cao hàm lượng IL-6 Polisaccarit tinh từ Xuân Hoa P Palatiferum với nồng độ 10µg/ml ức chế q trình sản xuất cytokine tiền viêm IL-6 so với nhóm tế bào gây đáp ứng viêm LPS không điều trị (p