Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên

1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn. 3 1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn. 5

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới côgiáo - TS Vi Thị Đoan Chính - người đã định hướng nghiên cứu, tận tìnhgiúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Trịnh Ngọc Hoàng, CN Đỗ ThịTuyến cùng toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Phòng thínghiệm Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học đã tận tình giúpđỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này.

Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, ngườithân, cùng toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh K6 đã động viên và giúp đỡem rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này.

Thái Nguyên, ngày 23 tháng 8 năm 2011

Sinh viên

Lương Thị Hương Giang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 3

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

1.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5

1.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn 6

1.2 Đại cương về chất kháng sinh 7

1.3.2 Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y 13

1.4 Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật 15

1.4.1 Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme 15

1.4.2 Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên 17

1.4.3 Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 192.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.3.3 Môi trường nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu đất 21

2.4.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 21

2.4.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 21

2.4.2.2 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch 22

2.4.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 23

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 23

2.4.5 Phương pháp lên men xạ khuẩn 24

2.4.6 Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên

đĩa thạch 24

2.4.7 Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme 25

2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn 26

3.1.1 Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất 26

3.1.2 Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 27

3.2 Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân lập 29

3.2.1 Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu 29

3.2.2 Phổ kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập 30

3.2.3 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKS cao 32

3.3 Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính enzyme 37

3.3.1 Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn 37

3.3.2 Khả năng chịu nhiệt của enzyme 39

VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định

DANH MỤC CÁC BẢNG

Kháng sinh được phát hiện qua các năm 9

Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau 26

Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 27

Khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định 30

Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập 32

HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch 33

HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 34

HT kháng nấm gây bệnh trên chè của 3 chủng XK lựa chọn 36

Hoạt tính enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 37

Hoạt tính enzyme của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 38

Khả năng bền nhiệt của dịch enzyme chủng HT12.7 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.2 Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng

3.1 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu 28

3.3 Tỷ lệ các chủng XK có HTKS phân theo nhóm màu 303.4 Tỷ lệ XK có HT với các nhóm VSV kiểm định 313.5 Khả năng đối kháng của các chủng XK với các VSV kiểm định 32

3.7 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn lựa chọn 353.8 HT kháng nấm gây bệnh chè của 3 chủng xạ khuẩn 363.9 HT enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 38

3.13 Vòng phân giải cơ chất của enzyme sau khi đã xử lí với nhiệt độ

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1 Tên đề tài

Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạkhuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên.

2 Đối tượng

70 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khuvực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên được dùng để tuyển chọn và nghiên cứuhoạt tính sinh học.

 Phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khácnhau: đất trồng chè, đất trồng keo, đất trồng màu, đất trồng lúa, đấtvườn, đất đồi trọc.

 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn với các vi sinhvật kiểm định bao gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấmmốc, đặc biệt có sử dụng các chủng nấm gây bệnh trên cây chè là loạicây trồng chủ đạo ở tỉnh Thái Nguyên.

 Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có hoạtphổ rộng, có khả năng kháng được các vi sinh vật kiểm định thuộc cácnhóm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm mốc và nấmgây bệnh trên chè Các chủng xạ khuẩn này được ký hiệu: HT17.8,

HT19.1 và HT 12.2 Đây là các chủng có nhiều khả năng ứng dụngtrong thực tiễn.

 Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, protease và cellulase của cácchủng xạ khuẩn và đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzymecao được ký hiệu là: HT12.7 và HT10.6 Đồng thời đã nghiên cứuđược khả năng chịu nhiệt của các enzyme.

MỞ ĐẦU1 Đặt vấn đề

Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinhhoàng đối với con người Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trênthế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị cácbệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, A Fleming phát hiện ra penicillin - CKS có

nguồn gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941,

penicillin mới chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnhnhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu Đây làmột trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX.

Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiệntượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng Việc sửdụng một số chất đặc hiệu để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lạihiệu quả như mong muốn Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinhngày càng gia tăng Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thuhút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Cho đến nay, con người đã phát hiệnkhoảng 17.000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn 3.000 CKS bán tổng hợp và mỗinăm vẫn có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện Trong số các VSVsinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các chất

kháng sinh được mô tả, trong đó chủ yếu thuộc chi Streptomyces [11], [19].

Hiện nay, có hai xu hướng nghiên cứu để điều chỉnh sinh tổng hợp chấtkháng sinh của xạ khuẩn là tuyển chọn tạo ra các chủng xạ khuẩn công nghiệpcó khả năng siêu tổng hợp chất kháng sinh và tối ưu hóa các thành phần môitrường, thiết bị và điều kiện lên men Tuy các loại chất kháng sinh rất phổ biếntrên thị trường nhưng công nghệ sản xuất chất kháng sinh lại chủ yếu tập trungvào một số nước, một số tập đoàn dược phẩm của Mỹ, Anh, Đức, Hà Lan… vàđược bảo hộ chặt chẽ dưới dạng các sáng chế độc quyền, lưu giữ trong từng cơsở sản xuất công nghiệp và được xem như những bí mật thương mại [24].

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên cókhu hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài xạ khuẩn sinh chấtkháng sinh Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiềuloại hình khoáng sản phân bố tập trung Điển hình là khu vực núi Pháo thuộcxã Hà Thượng - huyện Đại Từ, là nơi đã và đang diễn ra các hoạt động khaithác khoáng sản mạnh mẽ.Trong đó chủ yếu là khai thác quặng vonfram Cáchoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trườngđất, nước và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của hệ VSV.Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động khaikhoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhưng lại chưacó nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạttính sinh học đến hệ VSV đất

Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩnphân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vựcnúi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực đã vàđang chịu ảnh hưởng của các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm.

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của xạ khuẩn để từ đó có thể tuyểnchọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt làtrong công tác bảo vệ thực vật và môi trường.

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất.

- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với cácVSV kiểm định để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao.

- Kiểm tra khả năng sinh enzyme ngoại bào để chọn ra các chủng cóhoạt tính enzyme cao.

- Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzyme.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi

khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) vàsiêu giới nhân sơ (Prokaryota) [34].

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộActinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đócó 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại đượcxếp vào nhóm XK hiếm [12], [42] Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi

chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzymengoại bào Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong

điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó được biết đến nhất là

streptomycin, erythromycin, tetracyclin [40].

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinhtrưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn

– actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và

ban đầu xạ khuẩn được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với nấm.Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn(tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [27] Đâylà một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.

Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA Đa số xạkhuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước và xác thựcvật Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàntự nhiên Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy nhưhumic acid trong đất [42] Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhinbằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và cácpeoxidase ngoại bào [33] Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trường

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

giàu chất hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịunhiệt (thermophilic) [39], và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứamycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định, đặctrưng [37].

Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và pH trung tính là điều kiệntối ưu cho xạ khuẩn phát triển Mặc dầu vậy, nhiều loài đã được phân lập ở

các môi trường khắc nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được

phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và

Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộcvào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Đây là một trong những đặc điểm phân biệtkhuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc cóđường kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường.

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi,dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đadạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiệnngoại cảnh.

Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùyvào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đườngkính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tớiđường kính 1cm hoặc lớn hơn.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tươngđối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn [43]

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sảnphẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzyme, vitamin, axithữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay đượctiết ra môi trường.

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi

Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh

sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng [8].

1.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩnty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng choxạ khuẩn Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử, đôi khi có thểmang tới 200 bào tử Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểmquan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản cóhình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài củacuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thànhdạng lông [10].

Bào tử xạ khuẩn được baobọc bởi màng mucopolysaccharidegiàu protein với độ dày khoảng 300- 400Aº chia làm 3 lớp Các lớp nàytránh cho bào tử khỏi những tácđộng bất lợi của điều kiện ngoạicảnh như nhiệt độ, pH… Hìnhdạng, kích thước chuỗi bào tử vàcấu trúc màng bào tử là những tínhtrạng tương đối ổn định và là đặcđiểm quan trọng dùng trong phânloại xạ khuẩn Tuy nhiên nhữngtính trạng này có thể có những thay

đổi nhất định khi nuôi cấy trên môitrường có nguồn nitơ khác nhau[14].

Hình 1.2 Hình dạng cuống sinh bào

1.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ làmột tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.

Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có cấutạo tương tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucantạo nên một lớp vách tế bào tương đối vững chắc Phân tích dưới kính hiển viđiện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong vàlớp giữa dày 50Aº Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩnđược chia thành 4 nhóm chính [5], [9]:

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic

(L - ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6

diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin Thuộc nhóm này gồm các chi:

Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6

-diaminopimelic Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus,Geodermatophilus, Frankia…

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6

-diaminopimelic, arabinose và galactose Thuộc nhóm này gồm các chi:

Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…

Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, có tác dụng duy trì hình dáng củakhuẩn ty và bảo vệ tế bào Ngoài ra thành tế bào XK có thể cho phép nhiềuchất như: Chất kháng sinh, axit amin và nhiều hợp chất khác có kích thướctương đối lớn đi qua một cách dễ dàng Các chất dinh dưỡng từ môi trườngcũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.

Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dưới thành tế bào, dàykhoảng 7,5 - 10 nm, chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh

dưỡng vào tế bào, tham gia vào quá trình hình thành bào tử Tế bào chất củaXK gồm một số thành phần chủ yếu như: thể nhân, không bào và thể ẩnnhập.

Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là nhiễm sắc thểkhông có màng bao bọc Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắcthể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.

1.2 Đại cương về chất kháng sinh

1.2.1 Chất kháng sinh (Antibiotic)

Theo khái niệm cũ, CKS là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật màngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinhvật khác một cách chọn lọc (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…) Thuật ngữ

antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hi Lạp: “anti” là kháng lại, “bios” là sự

sống Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phânbiệt penicillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930 Thuậtngữ này được thay đổi sau khi penicillin và các chất kháng khuẩn khác đãđược cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm Ngày nay, thuật ngữnày được sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổnghợp hoặc bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp Nhiều chấtkháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus,tế bào ung thư… Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc, mỗi CKS thườngchỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [10].

1.2.2 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh

Kháng sinh là thuốc được con người dùng chủ yếu để chống các bệnhtruyền nhiễm Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh củacon người và động vật Cho đến nửa sau thế kỷ 19 người ta đã phát hiện rằngvi sinh vật chính là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm Do đóliệu pháp hóa học nhằm vào các VSV gây bệnh đã được phát triển thành liệupháp điều trị chính.

Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh đã đượcdùng trong điều trị vào những năm 1940 Ngay sau đó penicillin đã trở thànhmột kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranhthế giới II [36].

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mớiđược xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóaliệu pháp kháng sinh (bảng 1.1).

Bảng 1.1 Kháng sinh được phát hiện qua các năm [6]NămCKS được phát hiệnNướcNămCKS được phát

1943 Streptomycin, Bacitracin Mỹ 1945 Cephalosporin Italia

Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ởthế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn Tuy nhiên từ năm1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí phát triểnvà thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn Bên cạnh đó, một hiện trạng đángbáo động là ngày càng tăng các VSV gây bệnh kháng với các kháng sinhhiện có Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào để vượtqua tính kháng thuốc kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới cócơ chế hoạt động khác nhau [29].

1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hìnhthành chất kháng sinh Đa số các CKS đang dùng trong y học hiện nay cónguồn gốc từ XK, trong khoảng 5.500 CKS đã biết đến hiện nay, có tới hơn4000 chất từ XK [2].

Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổkháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển củanhiều loài VSV khác nhau.

Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi thứ cấp của visinh vật Dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đốivới XK Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chếgiúp xạ khuẩn tồn tại trong môi trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sựcạnh tranh môi trường dinh dưỡng Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ làsản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào… [17], [23].

Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn:

 CKS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, thông qua một chuỗi cácphản ứng enzyme.

 CKS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.

 CKS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I,sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiềuCKS có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau [6], [7].

1.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn

Đa số các CKS được dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn,trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối phổ biếntrong thực tiễn.

Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc từ

xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các VK G(+) khá mạnh.

Streptomycin được sử dụng rất hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, hogà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chữa các bệnh lao [10].

Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ khuẩn

Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả VK G(+) và G(-) Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penicillin vàstreptomycin [10].

Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ

kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả VK G(+) như tụ cầu, phế cầu đãkháng lại penicillin và VK G(-) như màng não cầu, lậu cầu Trong y học,

chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [10].

Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ

khuẩn thuộc chi Streptomyces, các CKS này có phổ kháng sinh rộng, chống

được cả VK G(+) và G(-), ricketsia và một vài loài virus lớn Ngoài sử dụngtrong y học, tetracyclin còn được sử dụng trong chăn nuôi - thú y [2], [10].

Cloramphenicol: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, được

phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống được nhiều VK G(+) và G(-).Ngoài sử dụng trong y học, CKS này còn được dùng trong chăn nuôi - thú yvà thủy sản [32].

Erythromycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces erythreus, là CKS có phổ

rộng đối với VK G(+), được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm

phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [10], [23].

Novobicin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces spheroides và Streptomyces

niverus, có hoạt tính mạnh với các VK G(+) Đặc biệt có khả năng chống

các tụ cầu đã kháng với penicillin và một số CKS khác [21].

Amphoterycin B: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces nodosus, được dùng để

điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [23].

Dactinomycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces antibiticus, có hoạt tính

kìm hãm phát triển các khối u ác tính Được dùng để điều trị một số bệnhung thư [23].

Daunorubixin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces coeruleorubidus, được

dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [23].

1.3 Ứng dụng của chất kháng sinh

1.3.1 Ứng dụng trong y học

Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bịnhiễm trùng máu năm 1941 [22], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiệnvà ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tácphòng và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người Nhờcó các loại thuốc kháng sinh mà con người đã khống chế và loại bỏ được

nhiều bệnh nguy hiểm như dịch tả, thương hàn v.v…

Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôitrực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống Có nhiều loại thuốcđược sử dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin,rimocyclin…

Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra Trong yhọc, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinhnhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại khángsinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lựccủa CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [22].

Căn bệnh ung thư là một trong số những bệnh rất nguy hiểm đối vớicon người Trước đây thường sử dụng biện pháp xạ trị và phẫu thuật để điềutrị thì ngày nay y học đã biết sử dụng thuốc KS trong trường hợp bệnh đãchuyển sang giai đoạn di căn Hiện nay y học đã sử dụng thuốc kháng sinh

trong điều trị ung thư như daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạchcầu cấp tính, đối với việc phòng loại bệnh này người ta đã dùng penicillin G

hay erythromycin Các thuốc kháng sinh như mitomycin (do S cacspitosus

sinh ra) được dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, phổi, đại tràng [22].Tuy nhiên, cho đến nay chưa có CKS nào có thể điều trị các bệnh dovirus gây ra một cách có hiệu quả do virus không chịu tác động của CKS.

1.3.2 Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y

Chất kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học để chữa bệnhcho con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khácnhư: bảo vệ thực vật, chăn nuôi, bảo quản thực phẩm…

Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để phòng chữa bệnh và kíchthích tăng trọng cho gia súc, gia cầm.

Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loạibỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóavà hô hấp trên động vật non, làm cho chúng khỏe mạnh, tăng trưởng tốt Rấtnhiều KS được dùng với mục đích này như tetracyclin, bacitraxin,monelzin… Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravittrên quy mô 12 tấn/năm Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăngtrọng 15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 -7% [1].

Hiện nay, biện pháp thường được sử dụng trong công tác bảo vệ thựcvật chống lại sâu bệnh là sử dụng các thuốc hóa học Nhưng thuốc hóa họccó nhiều nhược điểm như hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, mặt khác lạigây ô nhiễm môi trường và nhiều chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gâyđộc cho con người v.v… Để khắc phục những nhược điểm trên thì việc sửdụng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, cótính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định màkhông ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có

khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học Các kháng sinhđược dùng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như cácbệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ… Ngoài raCKS còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độnhất định như kích thích sự nảy mầm của hạt Các CKS được dùng trongcông tác bảo vệ thực vật thường ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung cácchất độn để tăng độ bền của CKS Các CKS có thể được trộn lẫn vào đất,phun trực tiếp lên thực vật hoặc dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiêudiệt các mầm bệnh ở bên trong và bên ngoài hạt.

Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong công tác bảo vệ thực vật đượcphổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc,

Ấn Độ… Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomycessp 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum

gây thối rễ ở bông non [19] Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng

Streptomyces sp 201 có khả năng sinh CKS mới là z – methylheptyl iso –

nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như

Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusariummoniliforme…[17].

Hiện nay, nước ta cũng bắt đầu sử dụng các CKS có nguồn gốc từTrung Quốc, Nhật Bản để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa họcđộc hại trong công tác bảo vệ thực vật Năm 2002, Trung tâm công nghệ

sinh học – ĐHQGHN đã phân lập được từ đất chủng XK Streptomyces sp LD30 có khả năng sinh CKS phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnhnhất là chống chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây

trồng [4]

Ngoài công tác bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y thì CKS còn đượcsử dụng trong công nghệ thực phẩm Dùng kháng sinh để bảo quản thựcphẩm vừa rẻ vừa đơn giản, vừa không cần trang thiết bị đặc biệt nhưng vẫn

đảm bảo chất lượng thực phẩm Một số CKS được sử dụng trong bảo quảnthực phẩm như: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin… Tuynhiên, việc sử dụng CKS trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồntại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gâyra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật cókhả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị.Vì vậy, để khắc phục tồn tại trên việc sử dụng chất kháng sinh trong bảoquản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc.

1.4 Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật

1.4.1 Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme

Enzyme là những protein được sản xuất tự nhiên từ thực vật, động vật, visinh vật, có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào Chúng là nhữngchất xúc tác thúc đẩy tốc độ các phản ứng hóa học mà không làm thay đổi tínhchất của chúng Việc sản xuất và sử dụng enzyme đã có từ lâu ở nhiều nước trênthế giới Tuy nhiên, chỉ sau khi con người chứng minh được khả năng xúc táccủa enzyme ngoài tế bào thì việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme mớithực sự phát triển mạnh mẽ Ngày nay, nhiều loại enzyme đã được sản xuất ravới sản lượng lớn và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhaunhư: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con ngườiđã tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme từ động, thực vật với khối lượng lớn(vạn tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, dolượng enzyme trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế VSV trái lại có thể tổnghợp được một lượng lớn các enzyme khác nhau Do vậy VSV là đối tượng chínhđược sử dụng để sản xuất enzyme trong vòng 30 năm trở lại đây [25].

Hệ enzyme ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầuhết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N2, S, Fe, CO2,CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin,cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzyme

tương ứng [3] Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọnlựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khácnhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác được từ nguồn động vậtvà thực vật.

Enzyme VSV có hoạt tính cao hơn enzyme từ các sinh vật khác do VSVcó tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanhchóng, hàm lượng enzyme trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuấtcông nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất đượclượng lớn chế phẩm enzyme.

Việc lên men sản xuất enzyme có thể triển khai trên quy mô sản xuấtcông nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khíhậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơngiản, rẻ tiền và dễ kiếm Trong thực tiễn sản xuất enzyme hiện nay thường dùngcác nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngànhsản xuất khác và một số muối vô cơ Do đó việc sản xuất enzyme nhờ VSV cókhả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao.

VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điềuchỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hayđiều chỉnh hoạt lực của enzyme) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môitrường Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hayđiều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có khả năng điềuchỉnh phổ các enzyme sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng lực sinh tổng hợpenzyme hay làm thay đổi hoạt tính của chúng.

Ngoài ra, so với nguồn enzyme động vật và thực vật, đối với nhómenzyme ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sửdụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thuenzyme ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn.

1.4.2 Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên

VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh đểduy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi VSV có hệ enzymeđa dạng và phong phú Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năngsinh enzyme như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùnghoạt tính sinh tổng hợp enzyme Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựachọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốnlà cần thiết Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nênlựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh enzymechịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủngsinh amylase thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh enzymechịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn chủng sinhcellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy Nhưvậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi hỏicác bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức Tuy hiện nay có nhiềuchủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tụcnghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người.

1.4.3 Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật

Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhưng cũng chỉ các enzymethủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau, đólà các enzyme amylase, cellulase và protease Lượng các enzyme sản xuất hàngnăm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease từ nấm mốc là 10 tấn/năm,pectinase là 10 tấn/năm… [26] Các enzyme này có ứng dụng nhiều trong nôngnghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng,tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Các enzyme được dùng ngàycàng nhiều ở các nước trên thế giới.

* Enzyme amylase: Amylase là các enzyme đường hóa, có khả năng phân

hủy amylose và amylopectin và các polysaccharit tương tự giải phóng glucose.

Các enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa cácnguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sảnngô, khoai, sắn Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylase có thể dùngđể sản xuất alcohol Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylase vàglucoamylase, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quytrình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quanghọc và sinh học [31].

* Enzyme cellulase: Trong thập kỷ qua, enzyme thuỷ phân cellulose ngày

càng được quan tâm Sự quan tâm này là do các enzyme này có khả năng thủyphân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose vàcellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩmđường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác Thídụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thểthu nguồn năng lượng ethanol [32]

* Enzyme protease: Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá vàthịt Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất cácdung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi.Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúngđược hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kếtlỏng trên bề mặt Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độchậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ranhững phần nhỏ Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt đểtận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là cáctác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải protein tồnđọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối[35].

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định

Vi sinh vật kiểm địnhCơ quan cung cấp

VK G (+)

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế

Bacillus subtilis VTCC-B-888 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV ViệtNam

VK G (-)

Escherichia coli VTCC-B-883 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV ViệtNamPseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt

Fusarium oxysporum VTCC-F-1301 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt

ĐH Thái Nguyên

N2 Khoa KHSS – Trường ĐH Khoa học –ĐH Thái Nguyên

ĐH Thái Nguyên

ĐH Thái Nguyên

2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

- Các loại đường chuẩn: glucose, saccharose, lactose, fructose, mantose… của

hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl,FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc.

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck(Đức)

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl MethylCellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

- KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)- KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật)- Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton

- Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam…

2.3.3 Môi trường nghiên cứu

* Môi trường Gause I (g/l): Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn

Tinh bột tan: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5;KNO3: 0,5; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít, pH: 7,0 - 7,4.

* Môi trường MPA (g/l): Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; thạch: 18; Nước máy vừa đủ 1 lít;pH: 7,0 - 7,2.