Nghiên cứu tách chiết, thử tác dụng thủy phân proteoglycan của chymopapain

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** VŨ QUANG THÁI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, THỬ TÁC DỤNG THỦY PHÂN PROTEOGLYCAN CỦA CHYMOPAPAIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** VŨ QUANG THÁI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, THỬ TÁC DỤNG THỦY PHÂN PROTEOGLYCAN CỦA CHYMOPAPAIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ : 60.73.25 Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Rư TS Nguyễn Huy Bạo HÀ NỘI, 2012 LỜI CẢM ƠN! Bản luận án thành công nhờ giúp đỡ q báu tận tình Thầy hướng dẫn, Tập thể quan, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Thầy giáo, Cô giáo bạn đồng nghiệp có liên quan đến nội dung luận án.: Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Văn Rư – Trưởng Bộ mơn Hóa Sinh trường Đại Học Dược Hà Nội TS Nguyễn Huy Bạo , người thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, động viên trình học tập hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo sau Đại học trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giúp tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cám ơn tập thể Bộ môn Hóa Sinh trường Đại Học Dược Hà Nội tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn bố mẹ gia đình thơng cảm, chia sẻ, giúp đỡ động viên suốt trình nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tác giả MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN……………………………………………… 1.1 Tổng quan đu đủ chymopapain ……………………… 1.1.1 Đặc điểm đu đủ 1.1.2 Đặc điểm chymopapain………………………………………… 1.2 Đại cương protease thực vật………………………………… 1.2.1 Khái niệm protease………………………………………………… 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc protease thực vật……………………… 1.2.3 Đặc tính protease thực vật làm thuốc………………………… 10 1.2.4 Phương pháp chiết tách tinh chế enzyme………………………… 11 1.3 Thoát vị đĩa đệm cột sống proteoglycan………………………… 16 1.3.1 Bệnh thoát vị đĩa đệm cột sống……………………………………… 16 1.3.2 Proteoglycan………………………………………………………… 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 24 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị……………………………………………… 24 2.1.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 24 2.1.2 Hố chất……………………………………………………………… 24 2.1.3 Dụng cụ máy móc…………………………………………………… 24 2.2 Các phương pháp nghiên cứu……………… ……………………… 25 2.2.1 Tinh chế chymopapain……………………………………………… 25 2.2.2 Đánh giá chất lượng chế phẩm…………………………………… 31 2.2.3 Đánh giá tác dụng thủy phân proteoglycan chymopapain……… 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ………………………………………………… 41 3.1 Tách chiết chymopapain tinh khiết từ hỗn hợp protease có 41 nhựa đu đủ…………………………………………………………… 3.1.1 Xây dựng đường chuẩn protein …………………………………… 41 3.1.2 Kết tinh chế chymopapain…………………………………… 42 3.2 Kết tác dụng thủy phân proteoglycan chymopapain… 51 3.2.1 Khảo sát thời gian thủy phân proteoglycan chymopapain……… 51 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ chymopapain chất…… 52 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân proteoglycan chymopapain…………………………………………… 53 3.2.4 Sự thủy phân chymopapain chất biến tính nhiệt độ… 54 3.2.5 Sự thủy phân proteoglycan biến tính acid HCL 5% chymopapain………………………………………………………………… 55 3.2.6 Sự thủy phân proteoglycan biến tính NaOH 5% 56 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN………………………………………………… 57 4.1 Về chiết tách, tinh chế chymopapain từ đu đủ xanh………… 57 4.1.1 Kết q trình tinh chế chymopapain…………………………… 57 4.1.2 Lọc gel, đơng khô chế phẩm chymopapain…………………………… 59 4.1.3 Một số tiêu chuẩn chất luợng chymopapain-HS……………… 61 4.2 Đánh giá tác dụng thủy phân chymopapain…………………… 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………………………………………………… 68 CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Chữ viết tắt bh Bão hòa ChP Chymopapain ChP-HS Chymopapain-HS DĐVN Dược điển Việt Nam xuất lần thứ HđCP hoạt độ đặc hiệu HđP hoạt độ protease riêng HS High Standard / Tinh cao IU U đơn vị enzym quốc tế MW Molecular weight / khối lượng phân tử nK nanoKatal (đơn vị xúc tác enzym) Ve Elution volume / thể tích rửa giải USP 36 –NF31 Dược điển Mỹ lần thứ 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Số lượng amino acid phân tử chymopapain Bảng 3.1: Kết HđP nguyên liệu sản phẩm giai đoạn 42 Bảng 3.2: Kết HđP HđCP giai đoạn 2, 43 Bảng 3.3: Kết HđP HđCP sản phẩm B1 B2 44 Bảng 3.4: Kết HđP HđCP trình tinh chế chymopapain-HS 45 Bảng 3.5: Hiệu suất HđP giai đoạn trình tinh chế tạo chymopapain-HS 46 Bảng 3.6: Kết rửa giải protein phương pháp lọc gel 47 Bảng 3.7: Kết đánh giá số tiêu chuẩn chymopapain-HS 50 Bảng 3.8: Tỷ lệ proteoglycan bị thủy phân theo thời gian 51 Bảng 3.9: Tỷ lệ proteoglycan bị thủy phân theo pH 52 Bảng 3.10: Tỷ lệ proteoglycan bị thủy phân theo nhiệt độ 53 Bảng 3.11: Sự thủy phân protein biến tính nhiệt độ chymopapain 54 Bảng 3.12: Sự thủy phân protein biến tính acid chymopapain 55 Bảng 3.13: Sự thủy phân protein biến tính NaOH chymopapain 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây đu đủ (Carica papaya L., Caricaceae) Hình 1.2: Cấu tạo đĩa đệm 17 Hình 1.3: Chất dịch đĩa đệm chèn ép vào rễ thần kinh 17 Hình 2.1: Giai đoạn hoà tan, loại tạp tạo kết tủa A1 27 Hình 2.2: Giai đoạn chiết tách tạo tủa A2 bột kết tinh B1 28 Hình 2.3: Hoạt động lọc phân tử sephadex 29 Hình 2.4: Giai đoạn lọc gel tinh chế chymopapain 31 Hình 3.1: Đường chuẩn phụ thuộc mật độ quang nồng độ protein 41 Hình 3.2: Hình ảnh bột đơng khơ chymopapain-HS 44 Hình 3.3: Kết lọc gel sephadex G75 dung dịch protein 48 Hình 3.4: Kết điện di gel polyacrylamid phân đoạn trình tinh chế chymopapain 49 Hình 3.5: Tỷ lệ proteoglycan bị thủy phân theo thời gian 51 Hình 3.6: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ chymopapain 52 Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chymopapain 53 Hình 3.8: Sự thủy phân protein biến tính nhiệt độ 54 Hình 3.9: Sự thủy phân protein biến tính acid chymopapain 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực Protease – đặc biệt protease thực vật – nghiên cứu góp phần tạo ứng dụng thiết thực sống, y - dược Người ta tách từ nhựa khô đu đủ chymopapain dạng tinh cao phát có khả đặc biệt tiêu viêm nhân nhầy đĩa đệm cột sống lưng mà không ảnh hưởng tới phận khác thể Ở Mỹ người ta nghiên cứu thành công việc tinh chế chymopapain nghiên cứu dạng bào chế thử nghiệm sinh học lâm sàng để ứng dụng điều trị bệnh khớp xương, đặc biệt khô khớp cột sống lưng cổ cách tiêm đắp chế phẩm chymopapain mà không cần phải giải phẫu, sau thời gian dịch nhày khớp xương phục hồi [4], [15], [19] Ở Việt Nam, tình trạng bệnh đau khớp sống lưng, thần kinh tọa, cong cứng xương sống xảy phổ biến quy luật lão hóa tuổi tác, cường độ làm việc nặng nhọc, vất vả với chế độ nghỉ ngơi chưa đảm bảo, kèm theo chế độ dinh dưỡng thấp mà hậu đến tuổi cao lỗng xương, đau thần kinh tọa thối hóa khơ cứng khớp xương Đặc biệt số bệnh lý người: thoát vị đĩa đệm nguyên nhân phổ biến gây nên tình trạng bệnh lý Trong y học có nhiều phương pháp điều trị vị đĩa đệm cột sống, cơng trình nghiên cứu giới khẳng định vai trò tích cực chymopapain điều trị vị đĩa đệm có khả làm tiêu nhân nhầy đĩa đệm Chymopapain protease có nhựa đu đủ - Carica papaya L., Caricaceae [50], loài phong phú số lượng, chủng loại chất lượng (hoạt tính enzyme) Cây đu đủ (Carica papaya L., Caricaceae) loài cho quả, trồng phổ biến nước ta, thời gian trồng đến hái ngắn [3], [5], với nhiều công dụng đời sống y học [4], [10], [17] Điều chứng tỏ nguồn nguyên liệu thuận lợi nước ta nước nơng nghiệp, phải nhập chế phẩm đắt tiền Tuy vậy, Việt Nam, nghiên cứu chymopapain bước đầu thực Để góp phần nghiên cứu sớm ứng dụng chymopapain y-dược, thực đề tài “Nghiên cứu tách chiết, thử tác dụng thủy phân proteoglycan Chymopapain” với mục tiêu sau: Tách chiết chymopapain tinh khiết từ hỗn hợp protease có nhựa đu đủ Thử tác dụng thủy phân proteoglycan chymopapain chất sống - Xác định khối lượng phân tử độ tinh khiết ChP- HS lọc gel Sephadex G75 (sàng phân tử) Kết trình bày bảng 3.6 hình 3.4 cho thấy Ve ml xác định protein có Log MW= 1,383 giá trị tương ứng với khối lượng phân tử từ 24.300 – 24.800 Da, chymopapain-HS Giá trị xác định xuất protein hoạt độ protease phân đoạn rửa giải Ngồi phân đoạn vitamin B12 có màu hồng riêng phân đoạn lên màu xanh tím với thuốc thử Gornall, khơng thấy xuất thêm màu vị trí rửa giải khác, chứng tỏ chế phẩm chymopapain-HS khơng có protein tạp khác xuất trình lọc gel - Kết đánh giá số tiêu chuẩn chymopapain-HS Sản phẩm tinh chế nghiên cứu (chymopapain-HS nghiên cứu) qua đánh giá kiểm tra kết cho thấy chế phẩm chymopapain-HS đạt tiêu chuẩn sở dự kiến Trong đạt tiêu chuẩn sở dự kiến tương đương tiêu chuẩn chymopapain chế phẩm Chymodiactin Mỹ, cụ thể: Độ tinh khiết: vạch, Ve (PĐ 8) so với vạch nhất, Ve (PĐ 8); khối lượng phân tử: 24.300 – 24.800 Da so với 24.700 Da; tính chất cảm quan, pH, độ nhiễm khuẩn: tất đạt yêu cầu; định lượng đạt tương đương HđP Chymodiactin (1717,8 nK/mg so với 1500,0 nK/mg); xác định hoạt độ đặc hiệu chymopapain (đạt 0,65–0,75 U/mg so với 0,75 – 1,5 U/mg) (kết trình bày bảng 3.7) Các tiêu chuẩn độ tan, độ nhiễm khuẩn chymopapain-HS đạt thực qua kỹ thuật đặc biệt hoá sinh học kỹ thuật lọc gel Sephadex G75 mức độ sàng phân tử, đông khô điều kiện áp xuất giảm nhiệt độ xuống tới -45oC nước bốc điều kiện không qua trạng thái lỏng kỹ thuật làm khơ chế phẩm sinh học, chế phẩm enzym phù hợp vào bậc 62 Các tiêu chuẩn sàng lọc tương đương với tiêu chuẩn chế phẩm enzym khác nước giới Nhật, Anh, Châu Âu tiêu chuẩn chymopapain USP 36-NF31 [7], [14], [50] Ngoài tiêu chuẩn chung chế phẩm enzym dược dụng chymopapain-HS có tiêu chuẩn riêng đặc thù có hàm lượng hoạt độ protease riêng đạt 1717,8 nK/mg chế phẩm khả enzym chế phẩm đạt cao đưa chúng tiến hành thuỷ phân chất ví dụ casein hoạt lực protease chymopapain-HS mạnh gấp gần 1,5 lần so với chymotrypsin USP 36-NF31 (chỉ đạt tối đa 1200 nK/mg chế phẩm) [14] Các kết thu tiến hành thử nghiệm nhiều lần giá trị có ý nghĩa thực tế Điều khẳng định đu đủ trồng Việt Nam, phương tiện kỹ thuật khéo léo người Việt Nam thực kỹ thuật đòi hỏi phải khéo léo kỹ thuật enzym Tuy nhiên, tiêu chuẩn cảm quan, độ tan, pH, hoạt độ chymopapain kiểm tra [21], tiêu chuẩn khác nội độc tố, độ vô khuẩn… chưa thử nghiệm [47], đề tài lần đầu tiến hành Viêt Nam, tiêu chí tiếp tục nghiên cứu đánh giá thời gian sớm để chế phẩm triển khai vào thực tế Tuy vậy, với kết bước đầu cho sở quan trọng để có nghiên cứu tiếp tạo chế phẩm chymopapain có đủ khoa học ứng dụng thực tế phục vụ công tác chữa loại bệnh không nguy hiểm, cấp thiết lại phổ biến người độ tuổi lao động có hiệu suất cao cho xã hội Đó loại bệnh khô cứng khớp xương đặc biệt khớp sống lưng cổ, tuổi cao, chế độ dinh dưỡng kéo dài, thoát vị đĩa đệm, thần kinh tọa 63 4.2 Đánh giá tác dụng thủy phân chymopapain Để xác định mức độ thủy phân proteoglycan enzym chymopapain, áp dụng phương pháp xác định hoạt độ protease theo phương pháp Biuret chất dung dịch nhân nhầy đĩa đệm cột sống 2% (proteoglycan thành phần nhân nhầy đĩa đệm cột sống) - Kết khảo sát thời gian thủy phân proteoglycan chymopapain Sau thời gian thủy phân giờ; 1,5 giờ; 2,5 Thí nghiệm tiến hành lượng chất enzym định, điều kiện nhiệt độ nhau, chất sử dụng tự nhiên Kết cho thấy: Tỷ lệ proteoglycan bị thủy phân sau 7,45%, sau 1,5 11,29%, sau 17,25%, sau 2,5 17,83% Trong đó, kéo dài thời gian thủy phân 2,5 cao lượng proteoglycan bị thủy phân không tăng lên đáng kể so với 2giờ (17,25% so với 17,83%) Do chúng tơi chọn thời gian thích hợp để tiến hành thủy phân proteoglycan chymopapain thí nghiệm sau 2giờ (kết trình bày bảng 3.8 hình 3.5) - Kết khảo sát pH đến hoạt độ chymopapain chất proteoglycan Ở hệ đệm phosphat pH đến pH Thí nghiệm tiến hành lượng chất enzym định, điều kiện nhiệt độ Sử dụng chất biến tính nhiệt độ Kết cho thấy: lượng proteoglycan bị thủy phân cao khoảng pH 6-8 (21,50%; 30,10%; 28,30%; 23,40% 20,09%.Trong khoảng pH 8 lượng proteoglycan bị thủy phân giảm (16,50% pH =5,5; 17,40% pH =8,5 14,70% pH = Do nhận thấy khoảng pH thích hợp để thủy phân glycoprotein chymopapain 6-8, pH tối ưu 6,5 (kết trình bày bảng 3.9 hình 3.6) Với pH pH sinh lý thể người, chế phẩm chymopapain đạt tác dụng thủy phân cao, pH tối ưu 64 6,5 chế phẩm tinh chế chymopapain từ nhựa đu đủ Việt Nam đạt phần điều kiện để dùng cho thử nghiệm sâu nữa, ứng dụng điều trị sản phẩm Chymodiactin Mỹ - Kết khảo sát nhiệt độ đến khả thủy phân proteoglycan Chymopapain Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân glycoprotein Chymopapain Chúng tiến hành xác định mức độ thủy phân proteoglycan Chymopapain nhiệt độ: 36oC, 37oC, 38oC, 39oC Tiến hành thí nghiệm lượng chất enzym định, điều kiện pH Cơ chất sử dụng chất biến tính nhiệt độ Kết cho thấy: Khi thay đổi nhiệt độ từ 36oC đến 39oC hoạt tính xúc tác chymopapain thay đổi, theo thứ tự 29,34%; 31,4%; 32,9% 32,7% Do chọn to 37oC nhiệt độ sinh lý thể làm nhiệt độ thủy phân cho thí nghiệm sau (kết trình bày bảng 3.10 hình 3.7) Từ nhận thấy chế phẩm tinh chế nghiên cứu có tác dụng tốt điều kiện sống, nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm sâu - Kết khảo sát thủy phân cChymopapain chất biến tính nhiệt độ Biến tính protein nhiệt độ 70OC khoảng thời gian khác tiến hành xác định mức độ thủy phân proteoglycan chymopapain.Thí nghiệm tiến hành lượng chất enzyme định, điều kiện nhiệt độ Kết nghiên cứu cho thấy: Trong khoảng thời gian gây biến tính từ 15 đến 150 phút lượng proteoglycan bị thủy phân tăng lên thời gian tăng Thứ tự tăng dần theo thời gian sau (23,4%;28,3%; 36,4%; 40,7%; 41,3%; 41,8%) 65 Thời gian dài 150 phút, lượng proteoglycan bị thủy phân tăng cao 41,8% Tuy nhiên sau thời gian biến tính 90 phút lượng protein bị thủy phân tăng lên khơng đáng kể Do kết luận biến tính 70oC cần để 90 phút (kết trình bày bảng 3.11 hình 3.8) - Kết thủy phân chymopapain chất biến tính acid HCL 5% Biến tính chất HCL 5% khoảng thời gian khác Và tiến hành xác định mức độ thủy phân proteoglycan chymopapain Thí nghiệm tiến hành lượng chất enzyme định, điều kiện nhiệt độ Kết nghiên cứu cho thấy: chymopapain có khả thủy phân proteoglycan biến tính acid Lượng proteoglycan bị thủy phân tăng dần tăng thời gian gây biến tính, thời gian gây biến tính lâu lượng proteoglycan bị thủy phân lớn: 30 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 23,2%; 60 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 26,8%; 90 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 29,4%; 120 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 30,7%; 150 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 31,4%; Sau thời gian 120 phút lượng chất bị thủy phân không tăng thêm đáng kể Do kết luận biến tính tác nhân acid HCl 5% cần thời gian 120 phút Tác nhân acid gây biến tính proteoglycan tác nhân nhiệt độ (kết trình bày bảng 3.12 hình 3.9) - Kết thủy phân chymopapain chất biến tính NaOH 5% Để khảo sát hoạt tính chymopapain chất biến tính kiềm Chúng tơi tiến hành biến tính chất NaOH 5% khoảng thời gian khác tiến hành xác định mức độ thủy phân proteoglycan chymopapain Thí nghiệm tiến hành lượng chất enzyme định, điều kiện nhiệt độ 66 Kết nghiên cứu cho thấy: Lượng chất bị thủy phân phụ thuộc vào thời gian gây biến tính Thời gian gây biến tính dài lượng proteoglycan bị thủy phân nhiều: 30 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 21,70%; 60 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 24,30%; 90 phút lượng proteoglycan bị thủy phân 26,70% (kết trình bày bảng 3.13 hình 3.10) Do thấy hoạt tính enzyme phụ thuộc vào trạng thái chất: Trên chất bị biến tính, hoạt độ enzym cao hơn: mức độ thủy phân chymopapain 2giờ: với chất tự nhiên 17,25%; chất bị biến tính 70oC (để 90 phút) 40,7%; chất bị biến tính tác nhân acid HCl 5% (trong thời gian 120 phút) 30,7%; chất bị biến tính NaOH 5% (ở 90 phút) 26,70% Trên chất bị gây biến tính, chymopapain đạt hoạt tính cao hơn, điều cho thấy đánh giá khả ảnh hưởng chymopapain nhân nhầy đĩa đệm đốt sống bị gây viêm (tương đương chất bị biến tính) mạnh so với nhân nhầy đĩa đệm đốt sống bình thường (tương đương chất tự nhiên) Từ có sở để đánh giá tác dụng chymopapain đốt sống bị viêm so với đốt sống lành Các giá trị sở khoa học thực tế để ứng dụng điều trị chế phẩm chymopapain 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Tách chiết chymopapain tinh khiết từ hỗn hợp protease có nhựa đu đủ - Đã thu nhận nhựa đu đủ sấy khô từ nhựa tươi, lấy đu đủ xanh - Xây dựng quy trình chiết tách tạo chymopapain thơ từ nhựa đu đủ khô: HđP tổng 760200,0 nK so với 1282676,0 nK; HđP riêng kết tủa giai đoạn tăng từ 636,3 nK/mg lên 1267,8 nK/mg độ tinh tăng lên khoảng 1,99 lần - Tinh chế chymopapain thơ thành chế phẩm chymopapain-HS có độ tinh cao: tăng gấp 2,70 lần so với nhựa đu đủ khô ban đầu loại tạp chất (HđP riêng 1717,8 nK/mg so với 636,3 nK/mg) HđCP từ 0,2 U/mg tăng lên 0,65 – 0,75 U/mg (tương đương với tiêu chuẩn nước giới hạn (0,75 – 1,50 U/mg chế phẩm) - Bước đầu xây dựng số tiêu chuẩn sở bột chymopapain- HS hàm lượng hoạt chất tính chất khác hình thức cảm quan, độ tan, pH hoạt độ protease tương đươmg với chế phẩm chymopapain chuẩn đáp ứng điều kiện thực tế: Độ tinh khiết (1 vạch, Ve (PĐ 8) so với vạch nhất, Ve (PĐ 8); Khối lượng phân tử (24.300 – 24.800 Da so với 24.700 Da) Định lượng đạt tương đương HđP chymopapain chế phẩm Chymodiatin (1717,8nK/mg so với 1500,0nK/mg) Hoạt độ đặc hiệu chymopapain (đạt 0,65–0,75 U/mg so với 0,75 – 1,5 U/mg) 68 Tác dụng thủy phân proteoglycan chymopapain Thử tác dụng thủy phân proteoglycan chymopapain chất sống để xem xét tác dụng tiêu nhân nhầy cột sống (đốt sống bị gây viêm tương tự chất sống bị biến tính) đạt số kết quả: Thời gian thích hợp để thủy phân proteoglycan chymopapain 2giờ (17,25%) pH tối ưu để thủy phân proteoglycan chymopapain 6,5 (30,10%) 37oC nhiệt độ sinh lý thể làm nhiệt độ thủy phân cho thí nghiệm Khả thủy phân proteoglycan nhân nhày đĩa đệm thực chất sống 2% với tác nhân gây biến tính khác là: - Với nhiệt độ thời gian cần để 90 phút, lượng proteoglycan bị thủy phân tăng cao 40,7% - Với HCl 5% 30,7% cần thời gian - Với NaOH 26,70% cần thời gian 1,5 ĐỀ XUẤT Để ứng dụng vào thực tế sản xuất chế phẩm, đề tài cần: Được tiếp tục tiến hành thêm thử nghiệm, cụ thể: - Nghiên cứu thử nghiệm để xây dựng quy trình hồn thiện - Xây dựng tiêu chuẩn sở đầy đủ thẩm định tiêu chuẩn - Nghiên cứu độ bền, độ giảm hoạt tính chế phẩm tinh chế để ứng dụng bảo quản, sử dụng Thực thử nghiệm để đánh giá tác dụng phụ, sốc phản vệ chế phẩm 69 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ mơn chấn thương, Đại học Y Thái Bình (2008), Thốt vị đĩa đệm, Bài giảng chấn thương Bộ môn chấn thương, Đại học Y Hà Nội (2006), Bệnh học ngoại khoa, Phẫu thuật thoát vị đĩa đệm, năm 2009 Bộ mơn sinh hóa, Trường Đại học dược Hà Nội (2004), Hóa sinh I, tr.51-86, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzym, NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục Hội đồng Dược điển Việt Nam, Trung tâm Dược điển - Dược thư Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzym, tr.216-227, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Nhị (2010), Bước đầu tinh chế nghiên cứu số đặc tính chymopapain ứng dụng dược, Tài liệu khóa luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 10 Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Thu Sang (2006), “Khảo sát tinh enzym chymopapain mủ trái đu đủ Việt Nam”, tạp chí Phát triển KH&CN, tập 9(số -2006), tr.59-65 11 Nguyễn Hạnh Phúc, Nguyễn Thị Hảo, Đoàn Thị Thuỷ, Nguyễn Thị Hoà (1984), “Tinh chế papain từ mủ đu đủ tươi dùng nuôi cấy tế bào”, Tạp chí y dược học (số 2),tr.12-14 12 Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng, tr.3-37, tr.80-82, Trường Đại học Dược Hà Nội 13 Nguyễn Xuân Thắng (1995), “Đặc tính protease thực vật dùng làm thuốc”, Tạp chí dược học, số 6, tr.19-21 TIẾNG ANH 14 Arnon, R (1970), The cysteine proteases, papain Meth Enzymol 19, pp 226-244 15 Azarkan, M., Moussaoui, A E., Wuytswinkel, D V., Geraldine, D and Looze, Y (2003), Fractionation and purification of the enzym stored in the latex of Carica papaya J Chromatogr B., 790, pp 229-238 16 Bradford, M M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding”, Anal Biochem., 72, pp 248-254 17 Bradford, D S., Oegema, T R., Cooper, K M., Wakano, K., Chao, E Y (1984), “Chymopapain, Chemonucleolysis, and Nucleus Pulposus Regeneration.” A Biochem Biomechan Study Spine, 9: pp 135-147 18 Bradford D S., Oegema, T R., Cooper, K M (1983), “Chymopapain, chemonucleolysis, and nucleus pulposus regeneration”, J Bone Joint Surg Am., 65(9): pp 1220–1231 19 Barrett, A J., Buttle, D J., Rich, D H (1997), “Pharmaceutical composition of purified chymopapain”, Biotechnol Advanc., 15, pp 226-227 20 Colowick, S P., Kaplan, N O (2008), Methods in Ezymology, McCollum-Pratt Institute, the John Hopkins university, Baltimore, Maryland 21 Dando P M., Sharp S L., Buttle D J., Barrett A J (1995), Immunoglobin E antibodies to papaya proteinases and their relevance to chemonucleolysis, Spine Department of Biochem., 20(9): pp 981-5 22 Dekeyser, P M., Buttle, D J., Devreese, B., Van Beeumen, J., Demeester, J., Lauwer, A (1995), “Kinetic constants for the hydrolysis of aggrecan by the papaya proteinases and their relevance for chemonucleolysis”, Arch Biochem Biophys., 320 (2): pp 375-379 23 Dekeyser, P M., Corveleyn, S, Demeester, J., Remon, J P (1997), “Stabilization of fully active chymopapain by lyophilization”, Journal of Pharmaceutics, 159(1): pp 19-25 24 Dennison C (2002) A Guide To Protein Isolation, Kluwer Academic Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Lodon, Moscow 25 Desnuelle, P (1960), Chymotripsin, the enzyme, Academic Press Inc., 4, pp 93-118 26 Ebata, M., and Yasunobu, K T (1962), "Chymopapain: isolation, crystallization and preliminary characterization”, J Biol Chem., 237(4): pp 1086-1094 27 Fersht A (1998), Structure and Mechanism in Protein Science, W H Freeman, 3rd Rev Edit 28 Goodenough, P W and Owen J (1986), “Chromatographic and electrophoretic analyses of papaya proteinases”, Phytochem 26: pp 75-79 29 Huet, J., Looze, Y., Bartik, K., Raussens, V., Wintjens, R., Boussard, P (2006), “Structural characterization of the papaya cystein proteinases at low pH”, Biochem Biophys Res Commun., 341(2): pp 620-626 30 Jaivoot, P., Palivanich, M., Theppakorn, T., Nitsawang, S and Kanasawud, P (2002), Separation of proteases from papaya peel In: 14th Annual Meeting Thai Soc Biotechnol: Biotechnology for better living in the new economy, November 12-15, Khon Kaen, Thailand 31 Kapsalis, A A., Stern, I J., Bornstein, I (1974), “The fate of chymopapain injected for therapy of intervertebral disc disease”, J Lab Clin Med., 83(4): pp 532–540 32 Khan, I U and Polgar, L (1983), “Purification and characterization of a novel proteinase, chymopapain”, Biochem Biophys Acta., 760, pp 350-356 33 Knox, D L (1986), “Efficacy of Chymopapain Chemonucleolysis”, J Neurosurg., 64(1): pp 162-163 34 Merck Index, 11th ed., Merck & Co., Inc., Rahway, USA 35 Monti, R., Basilio, C A., Trevisan, H C., Contiero, J (2000), “Purification of papain from fresh latex of Carica papaya”, Brazil Arch Biol Technol., 43(5): pp 501-507 36 Moussaoui, A E., Nijs, M., Paul, C., Wintjens, R., Vincentelli, J., Azarkan, M and Looze, Y (2001), “Revisiting the enzymes stored in the laticifers of Carica papaya in the context of their possible participation in the plant defence mechanism”, Cell Mol Life Sci., 58: pp 556-570 37 Moutim, V., Silva, L G., Lopes, M T P., Fernandes, G W and Salas, C E (1999), “Spontaneous processing of peptides during coagulation of latex from Carica papaya”, Plant Sci., 142: pp 115-121 38 Pettei, M J., Leonidas, J C., Levine, J J., Gorvoy, J D (1994), “Pancolonic disease in cystic fibrosis and high-does pancreatic enzyme therapy”, J Pediatr., 125(4): pp 587-9 39 Polgár, L (1984), “Problems of classification of papaya latex proteinases”, Biochem J., 221(2):pp 555–556 40 Poulter, N H., and Caygill, J C (1985), “Production and utilization of papain-a proteolytic enzym from Carica papaya L”, Trop Sci., 25: pp 123-137 41 Rao, M B., Tanksale, A M., Ghatge, M S., and Deshpande, V V (1998), “Sources of proteases”, Microbiol Mol Biol Rev., 62(3): pp 597-635 42 Rose, I A (1996), “Machanism of enzyme action”, Ann Rev Biochem, 58: pp 731-750 43 Sawin, P D., Tranelis, V C., Rich, G., Smith, B A, Maves, T J., Follet, K A., Moore, S A., Neurosurg, J (1997), “Chymopapaininduced reduction of proinflammatory phospholipase A2 activity and amelioration of neuropathic behavioral changes in an in vivo model of acute sciatica”, J Neurosurg., 86(6): pp 998-1006 44 The Americal Chemical Society Committee (1993), Reagent Chemicals ACS Specification, Society, Washington DC Americal Chemical 45 Ulrich, H B (1974) Methods of Enzymatic Analysis Academic Press Inc., New York, San Francisco and London, 2, pp 569-573 46 United State Pharmacopeia (2012), USP 36 - NF 31 47 Vellard, M (2003), “The enzyme as drug: The application of enzymes as pharmaceuticals”, Curr Opin Biotechnol., 14(4): pp 444-50 48 Watson, D C., Yaguchi, M., Lynn, K R (1990), “The amino acid sequence of chymopapain from Carica papaya”, Biochem J., 266, pp 75-81 49 World intellectual property organization (2006), Chymopapain isoenzymes, compositions, and uses thereof, patent no 017456 50 Zucker, S., Buttle, D J., Nicklin, M J., Barrett, A J (1985), “The proteolytic activities of chymopapain, papain and papaya proteinase III”, Biochim Biophys Acta., 828, pp 196-204 ... thực Để góp phần nghiên cứu sớm ứng dụng chymopapain y-dược, thực đề tài Nghiên cứu tách chiết, thử tác dụng thủy phân proteoglycan Chymopapain với mục tiêu sau: Tách chiết chymopapain tinh... TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** VŨ QUANG THÁI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, THỬ TÁC DỤNG THỦY PHÂN PROTEOGLYCAN CỦA CHYMOPAPAIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ... độ đến khả thủy phân proteoglycan chymopapain ………………………………………… 53 3.2.4 Sự thủy phân chymopapain chất biến tính nhiệt độ… 54 3.2.5 Sự thủy phân proteoglycan biến tính acid HCL 5% chymopapain ………………………………………………………………