Đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh yên bái có khả năng sinh kháng sinh cao

1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết thí nghiệm trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Nếu phát có gian lận xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2016 Đinh Thị Mỹ Linh LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thu Trang, Viện Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, TS Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Chu Kỳ Sơn, Viện Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, tới ThS Vũ Hạnh Nguyên, ThS Quách Ngọc Tùng cán Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, giảng dạy bảo trình tích luỹ kiến thức nghiên cứu khoa học Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi làm việc, tạo điều kiện cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện khóa luận Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người động viên khích lệ, giúp vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2016 Đinh Thị Mỹ Linh DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ STT Từ viết tắt BP (bp) Cặp bazơ (base pair) DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethydium bromide Kb Kilo bazơ KDa Kilo Dalton VSV Vi sinh vật ppm parts per million 10 PKS-I Polyketide synthases I 11 PKS-II Polyketide synthases II 12 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 13 RF Khung đọc (Reading Frame) 14 PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) 15 rDNA Ribosomal DNA 16 SDS Sodium đoecyl sulfate 17 SDS- Điện di gel polyacrylamide có chứa PAGE sodium doecyl sulfate TAE Tris-acetat EDTA 18 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Bảng 1.1 Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược Trang 20 liệu Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch 31 đại gen 16S rDNA Bảng 3.1 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 33 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ quế Bảng 3.2 Bảng số liệu khả kháng loại vi sinh vật kiểm định 36 36 chủng xạ khuẩn Bảng 3.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả 41 sinh anthracycline 436 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Bảng 3.4 Màu sắc khuẩn lạc chủng YBQ75 nuôi cấy 45 môi trường khác Bảng 3.5 Khả đồng hóa nguồn carbon sử dụng nguồn nitơ 48 chủng xạ khuẩn YBQ75 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30oC Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng 49 chủng YBQ75 Bảng 3.7 Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng TBQ75 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Ảnh quét hiển vi điện tử bề mặt dưa chuột sau ngày 13 gây nhiễm với Streptomyces sp Hình 3.1 Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228 34 (B) số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Hình 3.2 Phổ kháng khuẩn 36 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng 38 khuẩn Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I số 39 chủng xạ khuẩn đại diện HÌnh 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II số 40 chủng xạ khuẩn đại diện Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số 40 chủng xạ khuẩn đại diện Hình 3.6 Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường chủng YB50 43 thời điểm trước (A) sau (B) thử phản ứng màu Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II 44 nrps chủng YBQ75 Hình 3.8 Đặc điểm hình thái chủng YBQ75 môi trường 46 nuôi cấy khác (A) Khuẩn ty khí sinh, (B) Khuẩn ty chất Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc môi trường ISP2 47 Hình 3.10 Hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử (A) kính hiển vi điện tử 47 quét có độ phóng đại 2.500 lần 20.000 lần (B) Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen 16s rDNA gel agarose 1,0% 50 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 10 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật dƣợc liệu 12 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh mối tương tác xạ khuẩn với thực vật.……………………………………………………………………….12 1.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn nội cộng sinh 14 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh 16 1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 18 1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh giới 18 1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 1.2 Khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh dƣợc liệu số gen chức liên quan 20 1.2.1 Đánh giá khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh 20 1.2.2 Gen mã hoá enzyme polyketide (PKS-I, PKS-II) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) sinh tổng hợp kháng sinh 21 1.2.2.1 Gen chức gen pks-I, pks-II 22 1.2.2.2 Gen chức NRPS 22 1.2.3 Chất kháng sinh kháng ung thư nhóm anthracycline 23 1.3 Tác dụng quế tiềm khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh quế 24 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Chủng giống 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 27 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 28 2.2.3 Khuếch đại gen mã hoá PKS-I, PKS-II, NRPS 28 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn YBQ75 29 2.2.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả sinh melanin 29 2.2.4.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử bề mặt bào tử 30 2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 30 2.2.5 Phân loại chủng xạ khuẩn HBQ75 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA ……………………………………………………………………… 31 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân lập từ Quế…… .………………………………………………………… 33 3.1.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân lập từ Quế……… ………………………………………………………… 33 3.1.2 Xác định gen mã hoá polyketide synthase (PKS-I, PKS-II) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hhợp kháng sinh chủng xạ khuẩn……………….………………………………………39 3.1.3 Khả sinh hợp chất thuộc nhóm anthracyline chủng xạ khuẩn…………………… ………………………………………………… 43 3.2 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn YBQ 075 44 3.2.1 Đặc điểm hình thái bề mặt chuỗi bào tử 45 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa 48 3.2.2.1 Khả đồng hóa nguồn cacbon sử dụng nguồn nito 48 3.2.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn 49 3.2.3 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hoá 16s rDNA chủng xạ khuẩn YBQ75…………… ……………………………………………… 50 3.2.3.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 50 3.2.3.2 Phân tích trình tự gen 16S rDNA 51 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 PHỤ LỤC 60 MỞ ĐẦU Kể từ Fleming khám phá kháng sinh giới Penicillin vào năm 1929, nhiều chất kháng sinh khác phát ứng dụng Y học, nhiều bệnh gây vi sinh vật điều trị thành công Trải qua gần thiên niên kỷ, người sử dụng kháng sinh ngày rộng rãi, dẫn đến việc vi sinh vật (VSV) kháng lại thuốc kháng sinh trở nên phổ biến nghiêm trọng Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên nhận quan tâm mạnh mẽ từ nhà khoa học Việc phát triển loại thuốc kháng sinh giúp giảm thiểu khả gây bệnh vi sinh vật xa tiềm phát hoạt chất cho điều trị ung thư Trong số 8.000 chất kháng sinh biết đến giới 80% xạ khuẩn sinh Nhiều loại thuốc kháng sinh phát từ xạ khuẩn munumbicins A-D, celastramycins A-B, kakadumycins hay demethylnovobiocins Bên cạnh khả sinh sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học chất kháng sinh Một số công bố cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội cộng sinh tạo dược liệu đa dạng chức chống ôxi hóa kiểm soát sinh học Trong 15 năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu công bố kết khai thác chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh loại dược liệu khác như: Năm 2002, kháng sinh munumbicins AD sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.NRRL 30562 mộc lan; Năm 2007, chất chống ung thư Naphthomycin K sinh chủng Steptomyces sp.CS nội cộng sinh mỹ đăng mộc Cây Quế (Cinnamomum sp.) loài dược liệu phổ biến Việt Nam, biết đến vị thuốc bổ sử dụng rộng rãi đông y cổ truyền thực phẩm Các nghiên cứu chứng minh, tinh dầu quế có tính chất chống co mạch, làm tăng tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu 55,94% 66,9% dùng nồng độ 100 ppm 200 ppm (parts per million) Hoạt chất cinnamaldehyde tinh dầu quế có hoạt tính kháng khuẩn cao vi 10 Theo công bố, Streptomyces cavourensis phát lần vào năm 1958 [20] Streptomyces cavourensis nhóm xạ khuẩn phổ biến tự nhiên, thường phân lập từ đất vùng rễ loại thực vật hay môi trường nước Chủng xạ khuẩn có khả sinh chromomycin, flavensomycin - loại kháng sinh sử dụng rộng rãi điều trị bệnh gây vi khuẩn nấm, ung thư [20] Theo kết nghiên cứu Skarbek Brady (1978), phân lập tuyển chọn chủng Streptomyces cavourensis AUW-83 có khả kháng mạnh chủng Staphylococcus aureus NRRL B-313 thuộc chi Staphylococcus [44] báo cáo khả kháng chi Pseudomonas chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 Tại Việt Nam, nghiên cứu khả kháng vi sinh vật xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu công bố, đặc biệt quế Từ hứa hẹn xạ khuẩn phân lập từ quế nguồn sinh kháng sinh tiềm ứng dụng tương lai Gen pks-I, pks-II nrps mã hóa enzyme PKS-I, PKS-II NRPS chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 khuếch đại thành công phản ứng PCR từ khuôn DNA, sử dụng ba cặp mồi cho gen K1F⁄M6R, KsaF/KSaR A3F/A7R (Hình 3.7) Sau tinh để gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific, Mỹ) Tuy nhiên, trình biến nạp vào tế bào khả biến E coli XL1-blue chưa thành công Vì vậy, nghiên cứu cần tiếp tục tách dòng phân tích trình tự gen mã hoá PKS-I, PKS-II NRPS chủng S cavourensis YBQ75 52 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã đánh giá khả kháng VSV kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh quế Từ đó, tuyển chọn 36 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV số loại VSV kiểm định Đã xác định gen pks-I, pks-II, nrps tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 36 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Trong đó, chủng mang gen pks-I (chiếm 25%), 19 chủng mang gen pks-II (chiếm 52,8%), 13 chủng xuất gen nrps (chiếm 36,1%) Và bốn chủng xạ khuẩn ký hiệu: YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94 mang ba gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS Đã xác định 30 36 chủng xạ khuẩn sinh hợp chất có khả thuộc nhóm kháng sinh anthracyline Đã lựa chọn chủng YBQ75 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, kháng chủng VSV kiểm định, gồm kháng Pseudomonas aeruginosa CNLM Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Proteus vulgaris CNLM; Salmonella enterica ATCC 14028; Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Chủng YBQ75 định danh thuộc loài Streptomyces cavourensis dựa phân tích đặc điểm sinh học trình tự gen 16S rDNA KIẾN NGHỊ Tách dòng phân tích trình tự gen mã hoá PKS-I, PKS-II NRPS chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 Tiếp tục nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men nhằm thu nhận kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 Nghiên cứu xác định cấu trúc hoá học hợp chất có tiềm sinh học sinh tổng hợp chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Minh Khởi, Đào Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trần Minh Ngọc (2014), “Chiết xuất phân lập số phenollic glycosid từ quế chi Việt Nam (cinnamomum cassia blume)” Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học Hà Nội 38 Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tính vi khuẩn nội cộng sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, 2, pp 450-454 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sang lọc xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(2), 365-371 Tiếng Anh Adhikari A., Basnyat R (1999), “Phenotypic characteristics of Xanthomonas campestris pv campestris from Nepal,” EJPP, 105(3), pp 303-305 Bacon C.W., White J.F (2000), Microbial endophytes, Marcel Dekker, New York Berdy J (2005) “Bioactive microbial metabolites”, J Antibiot, 58, pp 1-26 10 Birch A.J., Donovan F.W (1953), “Studies in relation to biosynthesis I Some possible routes to derivatives of orcinol and phloroglucinol,” Australian Journal of Chemistry, 6, pp 360-368 54 11 Bizuye A., Moges F., Andualen B (2013), “Isolation and screening of antibiotic producing antinomycetes from soils in Gondar town, North West Ethiopia”, Asian Pac J Trop Dis, 3(5), pp 375-381 12 Castillo U.F., Strobel G.A., Ford E.J., Hess W.M., Porter H., Jensen J.B., Albert H., Robison R., Condron M.A.M., Teplow D.B., Stevens D., Yaver D (2002), “Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces (NRRL 30562) endophytic on Kennedia nigriscans,” Microbiology 148, pp 2675–2685 13 Chen H.H., Qin S., Lee J.C., Kim C.J., Xu L.H., Jiang C.L., Li W.J (2009), “Streptomyces mayteni sp nov., a novel endophytic actinomycete isolated from Chinese medicinal plant”, Antonie Leeuwenhoek, 95:47–53 14 Denmain A., Davies J (1999), Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM, Washington DC 15 Douglas J., Futuyma (2009), “Macroevolution and the biological diversity of plants and herbivores,” Plant and Insect Biodiversity Special Feature, 106(43), pp 18054–18061 16 Duong Minh Lam, Nguyen Dinh Viet and Tong Thi Mo (2014), “Screening for anticancer producing endophytic actinomycetes in three mangrove plant species”, Chemical and Biological Sci, 59(9), pp 114-122 17 Franco C., Michelsen P., Percy N., Conn V., Listiana E., Moll S., Loria R., Coombs J (2007), “Actinobacterial endophytes for improved crop performance,” Australas Plant Pathol, 36, pp 524-531 18 Gangwar M.S., Dogra S., Sharma N (2011), “Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants”, Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 2(4), pp 154-157 19 Gewirtz D.A (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”, Biochem Pharmacol, 57, pp 727 – 741 55 20 Giolitti G (1958), “ Studies on two strains of Streptomyces producers of flavensomycin, an antibiotic with fungicidal and insecticidal activity”, The VII International Congress of Microbiology, Almqvist and Wiksells, Uppsala, Sweden , pp 382-383 21 Giorgio M., Pierantonio M., Emanuela S., Gaetano C., Luca G (2004), “Anthracycline: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotixicity”, Pharmacol Rew, 56, pp 185-229 22 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequence-based analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl Environ Microbiol, 76(8), pp 2487-2499 23 Gonzalez I., Ayuso-Sacido A., Anderson A., Genilloud O (2005), “Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences”, FEMS Microbiol Ecol, 54, pp 401-415 24 Higashide E., Asai M., Ootsu T.S., Kozay Y., Hasegawa T., Kishi T., Sugino Y., Yoneda M (1977), “Ansamitocins, a group of novel maytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocardia,” Nature, 270, pp 721– 722 25 Janso J.E., Carter G.T (2010), “Biosynthetic potential of phylogenetically unique endophytic actinomycetes from tropical plants,” Applied and Environmental Microbiology, 76(13), pp 4377–4386 26 Kupchan S.M., Komoda Y., Court W.A., Thomas G.J., Smith R.M., Karim A., Gilmore C.J., Haltiwanger R.C., Bryan R.F (1972), “Maytansine, a novel antileukaemic ansa macrolide from Maytenus ovatus”, J Am Chem Soc, 94, pp 1355–1356 27 Li J., Zhao G.Z., Chen H.H., Wang H.B., Qin S., Zhu W.Y., Xu L.H., Jiang C.L., Li W.J (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl Microbiol, (47), pp 574-580 56 28 Li J., Zhao G.Z., Huang H.Y., Qin S., Zhu W.Y, Zhao L.X., Xu L.H., Zhang S., Li W.J., Strobel G (2012), “Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua L”, Antonie van Leeuwenhoek, (101), pp 515-527 29 Li Y., Kam S.L., Wang H., Wong E.Y., Ooi V.E (2006), “Antimicrobial activities of cinnamon oil and cinnamaldehyde from the Chinese medicinal herb Cinnamomum cassia Blume”, Am J Chin Med, 34(3), pp 511-522 30 Loria R., Bukhalid R.A., Fry B.A., King R.R (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces,” Plant Dis, 81, pp 836-846 31 Lu C.H., Shen Y.M (2007), “A novel ansamycin, naphthomycin K from Streptomyces sp,”J Antibiot, 60, pp 649–653 32 Mahera M.S., Sulaiman A.A., Ismet A (2013), “Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia”, Life Sci J, 10(4),pp 974-980 33 Marahiel M.A., Stachelhaus T., Mootz H D (1997) “Modular pep-tide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis”, Chem Rev, 97, pp 2651-2673 34 Meguro A., Ohmura Y., Hasegawa S., Shimizu M., Nishimura T., Kunoh H (2006), “An endophytic actinomycete, Streptomyces sp MBR-52, that accelerates emergence and elongation of plant adventitious roots”, Actinomycetologica, 20, pp 1–9 35 Nduka O (2007), “Modern Industrial Microbiology and Biotechnology”, Science, Enfield, pp 429 - 453 36 Nomomura H (1974), “Key for Classification and Identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP”, J Ferment, Technol, 52(2), pp 78-92 37 Passari A.K (2015), “Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for 57 their in vitro antimicrobial biosynthetic potential,” Frontiers Microbiology, 273(6), pp 1-13 38 Priham T.G., Tenser H.D (1974), “Streptomyces Waksman and first and second studies”, Int J Syst Bacteriol, 18, pp 279-392 39 Qin S., Xing K., Jiang J.H., Xu L.H., Li W.J (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol, 89, pp 457-473 40 Sambrook J., Russell DW (2001,) Molecular cloning A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 41 Shimizu M., Sachiko Y., Yusuke U (2009), “A promising strain of endophytic Streptomyces sp For biological control of cucumber anthracnose,” J Gen Plant Pathol, 75 pp 57-65 42 Shirling E.G., Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, Int J Syst Bacteriol, 16, pp 313-340 43 Sirisha B., Harith R., Jagan M., Siva K., Ramana T (2013), “Bioactive compounds from marine actinomycetes isolated from the sediments of bay of Bengal”, IJPCBS, 3(2), pp 257-264 44 Skarbek J.D., Brady L.R (1978), “Streptomyces cavourensis sp nov (nom Rev.) and Streptomyces cavourensis subsp Washingtonensis subsp Nov., a Chromomycin-producing subspecies”, International Journal of Systematic Bacteriology, 28(1), pp 45-53 45 Smith G.E (1957), “Inhibition of Fusarium oxysporum f sp lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato,” Phytopathology, 47, pp 429–432 46 Sun Y., Cheng Z., Glick B.R (2009), “The presence of a 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth promoting bacterium”, Burkholderia phytofirmans PsJN FEMS Microbiol Lett, 296, pp 131–136 58 47 Suzuki T., Shimizu M., Meguro A., Hasegawa S., Nishimura T., Kunoh H (2005), “Visualization Streptomyces galbus of infection in leaves of of an endophytic tissue-cultured actinomycete rhododendron,” Actinomycetologica (19), pp 7-12 48 Trease G.E., Evans W.C (1996), A textbook of Pharmacognosy Bailliere Tindall Ltd, London 49 Trenser H.D., Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol, 76, pp 239 50 Tuntiwachwuttikul P., Taechowisan T., Wanbanjob A., Thadaniti S., Taylor WC (2008), “Lansai A–D, secondary metabolites from Streptomyces sp SUC1”, Tetrahedron, 64, pp 7583–7586 51 Vangalapati M., Sree S.N., Surya P (2012), “A review on pharmacological activities and clinical effects of cinnamon species,” Research Journal of Pharmaceuti- cal, Biological and Chemical Sciences, 3(1), pp 653–663 52 Zhao P.J., Fan L.M., Li G.H., Zhu N., Shen Y.M (2005), “Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp ls9131”, Arch Pharm Res, 28, pp.1228–1232 59 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường nuôi cấy  Môi trường Hansen (g/l): Glucose: 50g; Pepton : 10g; KH2PO4: 3g; MgSO4.7H2O: 2g; H2O 1000 mL; agar 15-20g; pH 5-6  Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 5g; NaCl 5g; Pepton 5g; agar 20g; H2O 1000 mL; pH-7-7,2  Môi trường Yim 38 (g/l): cao malt 4,0; cao men 4,0; glucose 4,0; agar 20,0; H2O 1000 ml, pH 7,2  Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20,0; K2HPO4 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; NaCl 0,5; (NH4)2SO4 2; KNO3 0,5; FeSO4 0,01; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,4  Môi trường Gause II (g/L): nước chiết thịt 30,0mL; peptone 5,0; NaCl 5,0; glucose 10,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,4  Môi trường ISP1 (g/l): Tryptone 5,0, cao nấm men 3,0; agar 18,0; H 2O 1000 mL; pH 7,0  Môi trường ISP2 (g/L): cao nấm men 3,0; cao malt 10,0; dextrose 4,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2  Môi trường ISP3 (g/L): Bột kiều mạch 20,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH7,2  Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0; (NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2  Môi trường ISP5 (g/l): L-Asparagin monohydrate 1,0; glycerol 10,0; K2HPO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7,0-7,4  Môi trường ISP6 (g/L): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; xitrat sắt 0,5; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 60  Môi trường ISP7 (g/L): Glycerol 15,0; L-tyrosine 0,5; L-Asparagin monohydrate 1,0; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; Nacl 0,5; agar 20; H2O 1000 mL; pH 7,2-7,4  Môi trường ISP9-1 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0   Môi trường ISP9-2(g/L): Glucose 10; (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0 Phụ lục 2: DNA tổng số chủng xạ khuẩn sử dụng nghiên cứu PCR Hình Điện di đồ sản phẩm tách chiết DNA tổng số số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh gel agarose 1% Trong đó: 1:YBQ 075; 2:YBQ 056; 3:YBQ 040; 4:YBQ108; 5:YBQ 026; 6:YBQ 044; 7:YBQ 080; 8:YBQ 059; 9: YBQ 118; 10: 61 YBQ 107; 11: YBQ 088; 12: YBQ 021; 13: YBQ 019; 14: YBQ 047; 15: YBQ 065; 16: YBQ 050; 17: YBQ 001 Phụ lục 3: Trình tự 16S rDNA chủng YBQ 075 GCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGC AATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCG GATAATACTCCTGCCTGCATGGGTGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAA GGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAA GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGC CTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTA CCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAG GCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTG CATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAG GCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACT AGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAG TT 62 Phụ lục 4: Các gen tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn Ghi chú: C: Condensation; A: Adenylation; PCP: Peptidyl carrier protein; MT: Methyltransferase; E: Epimerase; AT: Acyltransferase; ACP: Acyl carrier protein; KS: Ketosynthase; KR: Ketoreductase; DH: Dehydratase; ER: Enoyl reductase; TE: Thioesterase Phụ lục 5: 63 Giếng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific); Giếng 1-4: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA hệ gen chủng 1-YBQ59, 2-YBQ63, 3-YBQ75, 4YBQ94 Phụ lục 6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng YBQ75 Ghi chú: 7-15ºC; 8-20ºC; 9-25ºC; 19-30ºC; 11-35ºC; 12- 40ºC Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng YBQ75 Ghi chú: 1-0%; 2-0,5%; 3-1%; 4-2%; 5-2,5%; 6-3% 64 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng YBQ75 Ghi chú: pH từ 4-12 từ trái sang phải 65 ... cứu xạ khuẩn nội cộng sinh quế Nối tiếp thành công nhóm tác giả xuất phát từ định hướng trên, thực nghiên cứu đề tài: "Đánh giá lựa chọn chủng xạ khuẩn nội cộng sinh quế thu thập tỉnh Yên Bái có. .. 1.2 Khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh dƣợc liệu số gen chức liên quan 1.2.1 Đánh giá khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh Phần lớn chất kháng sinh sử dụng y học có nguồn gốc từ xạ. .. Hà Nội, gồm nội dung chính: Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập Tỉnh Yên Bái Đánh giá có mặt ba gen mã hóa enzyme tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh