Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh yên bái

Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội công sinh phân lập trên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

HOÀNG THỊ TRÒN

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015

Thái Nguyên - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

HOÀNG THỊ TRÒN

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Phí Quyết Tiến

2 TS Trần Văn Chí

Thái Nguyên - 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và các cán bộ khoa học Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo

TS Phí Quyết Tiến - Trưởng phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, người đã hướng dẫn và chỉ cách tiếp cận vấn đề trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn ThS Vũ Hạnh Nguyên, ThS Quách Ngọc Tùng cùng các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, những người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn thầy giáo TS Trần Văn Chí cùng các thầy

cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các thầy cô, các cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ trang

bị kiến thức hữu ích và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè, những người đã giúp

đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập này

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 6 năm 2014

Sinh viên

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu 11 Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 24 Bảng 4.1: Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 26 Bảng 4.2: Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh anthracyline của 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 31 Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của chủng YBQ75 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 34 Bảng 4.4: Khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ của chủng YBQ75 sau 7-10 ngày nuôi cấy ở 30ºC 36 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của chủng YBQ75 37 Bảng 4.6: Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn YBQ75 40

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi trên bề mặt lá (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dưới bề mặt của lớp biểu bì 6 Hình 4.1: Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228 (B) của một số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 28

Hình 4.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I của một số chủng

xạ khuẩn đại diện 29

Hình 4.3: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II của một số chủng

xạ khuẩn đại diện 29

Hình 4.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ

khuẩn đại diện 30 Hình 4.5: Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của chủng YB50 và YB80 tại thời điểm trước (A, C) và sau (B, D) khi thử phản ứng màu Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường ISP2 và hình ảnh bề mặt 20.000 lần (C) của chủng YBQ75 35 Hình 4.7: Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,0% 38

iv

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

11 NRPS Nonribosomal peptide synthetase

12 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase

chain reaction)

13 PKS-II Polyketide synthase II

14 PKS-I Polyketide synthases I

v

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật 4

2.1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ 4

2.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 6

2.1.3 Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh 8

2.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh và một số gen chức năng liên quan 11

2.2.1 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh 11

2.2.2 Một số gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh 12

2.2.3 Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 13

2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 14

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16

2.4 Cây quế và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế 17

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 18

3.1.2 Hóa chất 18

3.1.3 Thiết bị 18

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 19

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 19

vi

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 20

3.4.2 Xác định khả năng sinh anthracyline 21

3.4.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn 21

3.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một chủng xạ khuẩn 22

3.4.5 Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 24

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 26

4.2 Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 28

4.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline 33

4.4 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn YBQ75 33

4.4.1 Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn YBQ75 34

4.4.2 Đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn YBQ75 35

4.4.3 Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn YBQ75 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc là một vấn đề vô cùng nghiêm trọng và là mối quan tâm rất lớn của cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới Để đáp ứng nhu cầu hiện tại, các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các nguồn phân lập mới nhằm thu nhận các hợp chất tự nhiên mới để phát triển, bào chế các loại kháng sinh mới chống lại bệnh do vi sinh vật gây ra

Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật Một trong số các loài thực vật

được sử dụng phổ biến là cây quế và tinh dầu của quế Cây quế (Cinamomum

loureirii) chứa dược chất trong tinh dầu của lá, vỏ cây và quả với 90% là

cinnamaldehyde có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+)

và vi khuẩn Gram (-) (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Enterobacter)

Các nghiên cứu đã chứng minh tinh dầu của cây quế còn có tính chất chống đau, co mạch, làm tăng bài tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu quả 55,94 và 66,9% khi dùng nồng độ 100 và 200 ppm [2] Ngoài ra một số hoạt chất như eugenol, cinnamaldehyde, carvacrol trong tinh dầu quế có khả

năng kháng vi sinh vật gây bệnh như: methicillin-resistant Staphylococcus

aureus, Klebsiella pneumoniae Ngoài giá trị dược lý do thành phần của cây mang lại, cây quế còn là môi trường sinh trưởng của xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn nội cộng sinh là các xạ khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ, thân, lá cây

mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với cây chủ [24] Các hợp chất

có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh được chứng minh là rất đa

Cho đến nay, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế nói riêng và cây dược liệu nói chung còn rất hạn chế Đồng thời, những nghiên cứu về gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS nhằm sàng lọc, đánh giá khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp từ xạ khuẩn nội cộng sinh tại Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi

thực hiện nghiên cứu đề tài: "Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ

khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái"

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội

công sinh phân lập trên cây quế tại tỉnh Yên Bái

1.3 Ý nghĩa của đề tài

* Ý nghĩa khoa học

Đề tài kế thừa kết quả của một số nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu, kế thừa những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư mới Đề tài chọn đối tượng thực vật nghiên cứu là cây quế đã được nhiều nghiên cứu trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu

3

hoặc tách chiết các hợp chất tự nhiên có tiềm năng kháng vi sinh vật, kháng tế bào ung thư Từ đó, đưa ra một số cơ sở khoa học về mặt lý thuyết về tác dụng và cơ chế cộng sinh của các chủng xạ khuẩn trên mô tế bào cây quế Đồng thời đánh giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ

khuẩn nhằm tìm ra chất kháng sinh, kháng ung thư mới

* Ý nghĩa trong thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực y dược, hóa dược

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học, tác phong làm việc cũng như kỹ năng làm việc sau này

- Biết cách đặt vấn đề, xử lý vần đề, phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày đề tài khoa học

4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật

2.1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với cây chủ

Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu công bố về mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất [11] Kể từ

khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp có khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không

nhiễm bệnh, đã có nhiều định nghĩa về VSV nội cộng sinh Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): "VSV nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, mà không gây ra những hiệu ứng xấu nào tới cây chủ" đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [8] Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất [14]

Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cây dược liệu là vô cùng phong phú, hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng

về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng khối u, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt

cỏ, chất kích thích sinh trưởng [47] Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp

5

chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới

Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi

trên, các nhà khoa học đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt

củ khoai tây Sau 4-6 ngày, chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới

phủ trên bề mặt củ khoai tây và xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn phát triển Nối tiếp thí

nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng S ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho

kết quả tương tự Từ kết quả nghiên cứu trên các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn thương do côn trùng [26]

Xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến

sự phát triển của vật chủ Gần đây, Franco (2007) đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, các vết nứt xung quanh rễ hình thành bào tử trong 3-4 tuần [13] Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô tế bào Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng

sự đã ủ Streptomyces sp MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển

Ban đầu, khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào biểu bì khác (Hình 2.1) Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự tăng trưởng ở nội bào trong lớp

biểu bì [30]

6

Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào

mô lá cây đỗ quyên của chủng S galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của

chủng xâm nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulase, xylanase và pectinase Hỗn hợp enzyme từ khuẩn

ty tăng cường khả năng bám dính [46]

2.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryota, thuộc giới Monera trong hệ 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryota [1] Xạ khuẩn nội cộng sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh

7

2.1.2.1 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

* Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử

Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [41]

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh

và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

2.1.2.2 Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA

Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có

độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3

Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân

sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [44] Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau

2.1.3 Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh

* Kháng ung thư và kháng viêm

9

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng và

ức chế tế bào ung thư từ chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng sinh sống có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ [43] Một giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa vi sinh vật và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT) Do đó, có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế

bào ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết

từ chủng xạ khuẩn Kitasatospora sp [34] Đây là báo cáo đầu tiên về nghiên

cứu tách chiết và sản xuất thuốc kháng tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội cộng sinh Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật Chẳng hạn như chất kháng u mạnh-maytansinoid

được tìm thấy ở nhóm thực vật bậc cao như Celastraceae, Rhamnaceae và

Euphorbiaceae, cũng như một số loài rêu và đặc biệt từ xạ khuẩn

Actinosynnema pretiosum [19, 23, 45] Đáng chú ý, chất ansamycin có thêm

nhóm chức chlorine mới còn gọi là naphthomycin K, được tìm thấy từ

Streptomyces sp CS nội cộng sinh trong cây thuốc Maytenus hookeri [27]

* Kích thích sinh trưởng

Hiện nay, xạ khuẩn nội cộng sinh được quan tâm đặc biệt vì chúng có nhiều đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật bao gồm: kiểm soát sinh học; sản xuất chất kích thích tăng trưởng thực vật như auxin, cytokinin và giberelin; sản xuất siderophore để liên kết với Fe3+ từ môi trường và cải thiện

sự hấp thu chất dinh dưỡng; cung cấp chất dinh dưỡng (nitơ, phosphate, khoáng) hoặc ức chế sản xuất ethylene nhờ 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) [44]

10

Năm 2006, Meguro và cộng sự đã công bố chủng Streptomyces sp

MBR-52 làm tăng khối lượng và chiều dài rễ Khi nuôi cấy mô cây đỗ quyên

được xử lý bằng Streptomyces sp MBR-52 trong bình tam giác, chủng này đã

xâm nhập vào các cây con và phát triển ở đó ngay cả sau khi trồng chúng trong đất Sự phát triển của rễ đã tăng nhanh trong cây nuôi cấy mô có bổ sung thêm MBR-52, điều này cho thấy chủng này sinh một số loại hormone trên thực vật [31]

* Kiểm soát sinh học

Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội cộng sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với cây mang mầm bệnh do đặc tính cư trú của chúng trong các cây chủ và hoạt tính kháng nấm Xạ khuẩn nội cộng sinh chiếm hữu các cơ quan bên trong để lấy chất dinh dưỡng và sự bảo vệ từ cây chủ Đổi lại, chúng tăng cường sức đề kháng cho các cây chủ bằng cách sản xuất một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học Chúng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng bằng cách cố định nitơ hoặc sản xuất phytohormones hay kiểm soát sinh học

Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch (ISR) đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào Chẳng hạn như chủng

Streptomyces galbus R-5 không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất

actinomycin X2 và fungichromin để tạo ra sức đề kháng trong cây đỗ quyên con, đồng thời tăng cường sản xuất jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [40] Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội cộng sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng, ứng dụng trong bảo vệ thực vật, tăng năng suất cây trồng

và kiểm soát sinh học

11

2.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh và một số gen chức năng liên quan

2.2.1 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh

Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập

từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Vì vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 2.1)

Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ

xạ khuẩn Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện như munumbicin AD [32], celastramycin AB [36], kakadumycin và demethylnovobiocin [20, 22]

Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây

dƣợc liệu

Xạ khuẩn Cây dƣợc liệu Kháng sinh Hoạt tính

Streptomyces

sp.NRRL 30562

Hoa mộc lan (Kenndia

Kháng sinh

Steptomyces

sp.TP-A0556 Hẹ (Allium tuberosum) 6- Prenylindole

Kháng nấm

12

Hai hợp chất mới cedarmycin A và B được tách chiết từ dịch lên men

chủng Streptomyces sp TP-A0456 cũng được tìm thấy từ dịch chiết cây tuyết tùng Cedarmycin A có hoạt tính kháng nấm đối với Candida glabrata với giá

trị MIC đạt 0,4 mg/ml Những nghiên cứu trên trên chứng minh và khẳng định xạ khuẩn nội cộng sinh là nguồn đầy hứa hẹn hợp chất kháng vi sinh vật gây bệnh

2.2.2 Một số gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh

Polyketide là nhóm đại diện cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao đổi chất bậc hai) được sản xuất bởi vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và thực vật Các kháng sinh dạng polyketide được sử dụng nhiều trong sản xuất thuốc điều trị các bệnh lâm sàng như tetracycline, daunorubicin, erythromycin, rapamycin

và lovastatin… Polyketide định nghĩa là các liên kết dạng polymer được cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất này được chia thành 2 loại gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) [28] NRPS và PKS được tổng hợp bởi một hoặc nhiều nhóm enzyme chuyên biệt,

đa chức năng, có tác dụng xúc tác kéo dài, phát triển chuỗi và đóng vòng từ cấu trúc đơn giản ban đầu để tạo thành các sản phẩm tự nhiên

2.2.2.1 Gen chức năng pks-I, pks-II

Hiện nay, các nhà khoa học chú trọng và quan tâm đến sự có mặt của hai

gen pks-I, pks-II trong xạ khuẩn pks-II là gen mã hóa chịu trách nhiệm sinh

tổng hợp cấu trúc cơ bản của polyketide đa vòng thơm Hỗn hợp polyketide được hình thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn vị acetate, acyl butyrate và khử nhóm β-carbonyl PKS-I là các enzyme đa chức năng xúc tác cho quá trình kéo dài chuỗi polyketide trong quá trình sinh tổng hợp polyketide Một module PKS điển hình bao gồm tối thiểu một acyl transferase (AT) để lựa chọn vùng kéo dài và chuyển giao; protein vận chuyển acyl (ACP) cho các vùng kéo dài và ketosynthase (KS) ngưng tụ decarboxylative

13

giữa nhóm thioester acyl phù hợp để kéo dài chuỗi polyketide đang phát triển PKS-I có chức năng mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp tạo sản phẩm cuối cùng [28]

2.2.2.2 Gen chức năng nrps

NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn, có cấu trúc gồm các module và mỗi module có chức năng chịu trách nhiệm về việc thành lập và sửa đổi một đơn vị acid amin Một NRPS thông thường gồm có 4 phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa) chịu trách nhiệm kích hoạt acid amin; vùng T (thiolation) còn được gọi là protein vận chuyển peptidyl (PCP) của acid amin kích hoạt; vùng ngưng tụ (C) liên kết peptidyl và amino acyl để kéo dài chuỗi peptide phát triển; vùng E (epime hóa) tham gia sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bậc hai không thông qua ribosome tạo dạng peptide [10, 29] Nhóm enzyme NRPS cũng được tìm thấy phổ biến trong nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn, trong đó NRPS tham gia tổng hợp peptide không thông qua ribosome, bao gồm: kháng sinh, chất độc, chất kháng viêm, chất ức chế miễn dịch (cyclosporine A) [17]

Việc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự gen pks, nrps từ bộ

gen xạ khuẩn bằng cách sử dụng mồi suy biến, được thiết kế với độ đặc hiệu

cao Phân tích gen pks, nrps trong xạ khuẩn không chỉ để xác định các mối

quan hệ tiến hóa của gen mã hóa kháng sinh mà còn để nghiên cứu những đặc điểm di truyền sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất [17]

2.2.3 Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline

Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương tác hay liên hệ với các tế bào khác Đôi khi, tế bào mất liên

hệ với các tế bào xung quanh và phân chia một cách không ngừng để tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư Nhiều chất hóa học dùng trong hóa

Về tính năng, DOX là thành phần thiết yếu trong điều trị ung thư vú, hình thành các khối u, ung thư bạch huyết Trong khi đó, DNR có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính EPI được sử dụng trong điều trị ung thư

dạ dày, ung thư vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng và ung thư tuyến tiền liệt… IDA có nhiều ưu điểm hơn DNR trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tính Hiện tại, cơ chế mà nhóm anthracycline ức chế tế bào ung

thư vẫn chưa được làm sáng tỏ [16]

2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cơ thể thực vật rất phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng

xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cơ thể thực vật vẫn còn rất hạn chế, vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn mới hay kháng sinh mới trong các cây dược liệu hứa hẹn tiềm năng

khai thác trong y dược học là rất lớn

Trong hơn 10 năm (từ 2001-2012), nhóm các nhà khoa học thuộc Viện

Vi sinh vật học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu hóa các điều kiện phân lập và đã phân lập thành công, đưa vào bảo tàng

15

giống hơn 5.000 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [37] Zhao và cộng sự (2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc Các chủng

xạ khuẩn thuộc nhiều chi khác nhau như : Streptomyces, Micromonospora,

Oerskovia, Nonomuraes, Promicromonospora, Rhodococcus Trong đó, 60

chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm định (chiếm

10,7%) Theo thống kê có 15 chủng có khả năng kháng mạnh với S aureus,

38 chủng kháng ít nhất 5 loại vi sinh vật gây bệnh và tất cả các chủng có hoạt

tính đều thuộc chi Streptomyces Và tỷ lệ xạ khuẩn mang gen pks-I, pks-II,

nrps chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%; 82%; 53%

Li và cộng sự (2008) áp dụng phương pháp xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ đông khô trước khi phân lập đã phân lập được từ cây dược liệu có tên thanh hao hoa vàng 228 chủng xạ khuẩn Trong đó, 10 chủng có tiềm năng cho ứng cử loài mới, 31 chủng có hoạt tính phổ rộng kháng khuẩn,

7 chủng có hoạt tính amylase mạnh, 10 chủng có hoạt tính protease mạnh, 1 chủng có hoạt tính lipase mạnh và 19 chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cỏ dại Cũng trên đối tượng này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp xử lý bề mặt mẫu khác nhau cũng như sử dụng các loại môi trường khác nhau để phân lập được 312 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh tại Vân Nam, Trung Quốc Trong đó, 48 chủng thể hiện hoạt tính kháng đối với các vi khuẩn kiểm định

Tại rừng nhiệt đới Xishuangbama của trung quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ những cây dược liệu bằng các phương pháp phân lập khác nhau dựa trên quá trình xử lỹ mẫu, môi trường phân lập Các chủng này đại diện cho 10 bộ phụ khác nhau và 32 chi, đã phát hiện ít nhất 19 loài mới [37] Trong đó, một chi mới và hai loài mới được phân lập trên cây

dó bầu ( Maytenus austroyunnanesis)

Cũng từ những chủng xạ khuẩn được phân lập trên các cây dược liệu tại vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã được phát

16

hiện như: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine… [9]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nhóm nghiên cứu TS Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng vi khuẩn

nội cộng sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia, Enterobacter,

Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp indol-3-acetic acid

(IAA) tốt từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố

Tuy Hòa, Phú Yên Đây là nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn nội cộng sinh tại Việt Nam [5]

Dương Minh Lam và cộng sự (2014) đã phân lập 52 chủng xạ khuẩn nội

sinh trên cây bần chua (Sonneratia caseolaris), cây bần (Sonneratia paracaseolaris) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) tại tỉnh Nam Định, Việt Nam Ba mươi tám chủng ức chế với Aspergillus niger và 40 chủng ức chế Candida albicans [12]

Tại thời điểm trên, Quách Ngọc Tùng và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập, đánh giá đa dạng di truyền và sàng lọc xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập trên cây quế tại tỉnh Hòa Bình Các chủng thể hiện hoạt tính kháng mạnh với 9 loại vi

sinh vật kiểm định ở mức độ khác nhau; 13 chủng mang gen pks-I, 12 chủng mang gen pks-II và 4 chủng mang gen nrps [3, 4] Hai chủng xạ khuẩn tiềm năng được định danh: Streptomyces angustmyceticus HBQ19 và Streptomyces

graminisoli HBQ33

Tuy nhiên, hiện tại chưa có nhiều công trình công bố về xạ khuẩn nội cộng sinh cũng như thu nhận các chất có hoạt tính sinh học từ cây quế nói riêng và cây dược liệu nói chung Hi vọng trong thời gian tới sẽ có nhiều công

trình nghiên cứu về xạ khuẩn liên quan đến cây dược liệu

17

2.4 Cây quế và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế

Cây quế có tên khoa học là Cinnamomum loureirii Nees, thuộc lớp hai lá

mầm, ngành hạt kín, loại thân gỗ và sống lâu năm Vỏ quế có vị thơm, cay nồng dùng làm thuốc, hương liệu hay da vị Từ lâu đời nước ta đã hình thành

4 vùng trồng quế (Yên Bái, Quế Phong-Thường Xuân, Trà Mi-Trà Đồng, Quảng Ninh) và mỗi vùng có những sắc thái riêng về tự nhiên, nguồn lợi Trong quế chứa nhiều vitamin và khoáng chất như kali, canxi, sắt, mangan, kẽm, magiê, vitamin A, niacin…, ngoài ra còn giàu chất xơ và chất chống oxy hóa nên từ xưa, quế đã được dùng làm vị thuốc quý trong đông y Trong các bộ phận của cây quế như vỏ, lá, hoa, gỗ, rễ đều có chứa tinh dầu, đặc biệt trong vỏ có hàm lượng tinh dầu cao nhất, có khi đạt đến 4 – 5% Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hàm lượng cinnamaldehyde chiếm 85% trên tổng số các hợp chất trong tinh dầu quế và độ tinh khiết > 98%

Cinnamaldehyde có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại VSV gây bệnh: vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus); Gram âm (E coli,

Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris , Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Samonella typhymurium); nấm men (Candida albicans, C tropicalis, C glabrata và C krusei) [25] Ngoài ra, tinh

dầu của cây quế còn có tính chất chống đau, co mạch, làm tăng bài tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu quả 55,94% và 66,9% khi dùng nồng

độ 100 và 200 ppm [2]

Cho đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế được công bố Do vậy, nghiên cứu về vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham

khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài nước

18

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Tổng số 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu cây quế, thu thập tại tỉnh Yên Bái nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC

11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas auroginosa CNLM, Candida

albicans ATCC 10231, Staphylococus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của

Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.1.2 Hóa chất

Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn Độ); Raffinose (Trung Quốc); Trehalose (Trung Quốc); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol, Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin, Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); các nguồn đường, acid amin (Sigma, Mỹ); kit PureLinkTM

– DNA Purification (Invitrogen, Mỹ)

3.1.3 Thiết bị

Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 3.1

19

Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Cân điện tử, AB 201, Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy đo pH, 320pH Metter, Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy PCR, GeneAmp® PCR System 9700,

Máy soi gel, PowerPac Basic, Bio-Rad Nhật Bản

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn nội cộng sinh (Phụ lục 1)

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2014 đến 6/2015

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

20

- Đánh giá sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng

xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường YIM38 ở nhiệt độ

30oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày Môi trường thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và thỏi thạch Sau 5 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn với tốc độ 8.000-10.000 vòng/phút ở 4oC Bổ sung 100 μl dịch vào các giếng thạch và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 4-5 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra môi trường Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 30-37o

C trong 14 - 18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn tạo thành quanh thành giếng [18]:

Vkk = D - d (mm) Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm) Thí nghiệm được lặp lại ba lần và dịch môi trường ban đầu đã khử trùng được dùng làm đối chứng âm Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007

21

3.4.2 Xác định khả năng sinh anthracyline

Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn được sàng lọc bằng phép thử màu [48] Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo hóa học, các anthracycline thay đổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu da cam ở pH acid và màu tím khi ở

pH base

Cách tiến hành như sau: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch YIM38 ở nhiệt độ 30°C Sau 5 ngày, đục 2 giếng nhỏ trên đĩa thạch và nhỏ vào mỗi giếng 50 µl NaOH 2,0 N và 50 µl HCl 1,0 N Quan sát màu quanh giếng sau 30 phút, nếu thấy xung quanh giếng xuất hiện vòng tròn màu tím khi nhỏ NaOH 2,0 N và màu vàng cam khi nhỏ HCl 1,0 N thì chứng

tỏ chủng xạ khuẩn có khả năng sinh anthracycline

3.4.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường YIM38 trong 48 giờ, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và Russell [39]

Gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS được khuếch đại bằng phản ứng PCR dựa trên 3 bộ mồi đặc hiệu cho PKS-I (K1F: 5’-TSA AGT CSA ACA TCGGBC A-3’ và M6R: 5’-CGC AGG TTS CSG TAC CAGTA-3’); PKS-II (KSaF: 5’-TSG CST GCT TGG AYG CSA TC-3’ và KSaR: 5’-TGG AAN CCG CCG AAB CCG CT-3’); NRPS (A3F: 5’-GCS TACSYS ATS TAC ACS TCS GG-3’ và A7R: 5’-SAS GTCVCC SGT SCG GTA S-3’) theo chu trình nhiệt: 95oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 57oC (K1F/M6R, A3F/A7R) hay 58oC (KSaF/KSaR) trong 90 giây, 72oC trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [24] Sản phẩm của phản ứng PCR

được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%