Phân lập và đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh yên bái

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI” Giảng viên hướng dẫn: TS Phí Quyết Tiến NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hồng Nhung Lớp : 11-03 Hà Nội -2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cộng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết thí nghiệm trình bày luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Một số thông tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày , tháng 05, năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Nhung LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu luận văn này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cô cán khoa học Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Xin trân trọng cảm ơn thầy, cô thuộc Viện đại học Mở Hà Nội giúp đỡ, bảo trình học tập Xin chân thành cảm ơn TS Phí Quyết Tiến - Trưởng phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên - cán phòng Công nghệ lên men, người hướng dẫn cách tiếp cận vấn đề suốt thời gian thực đề tài Đồng thời xin cảm ơn ThS Quách Ngọc Tùng cán Phòng Công nghệ lên men bảo nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt trình thực tập tốt nghiệp Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho suốt trình thực tập Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ ACP Acyl carier protein AT Acyl transferase ATP Adenosine triphosphate CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin EPI Epirubicin 10 IDA Idarumycin 11 HV Humic acid-agar 12 KS Ketosynthase 13 LPS Lipopolysaccharide 14 NO Nitric oxide 15 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 16 PCR 17 PGE2 Phản ững chuỗi polymerase ( Polymerase chain reaction)E2 Prostaglandin 18 PKS-I Polyketide synthases I 18 PKS-II Polyketide synthases II 19 RA Raffinose-histidine agar 20 RNA Acid ribonucleic 21 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 22 VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số nghiên cứu giới xạ khuẩn nội cộng sinh 10 dược liệu 1.2 Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 13 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 3.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn nội cộng sinh điển 25 hình phân lập từ mẫu quế 3.2 Thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 29 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Minh họa trình xâm nhập vào lỗ khí gian bào Streptomyces galbus MBR-5 đỗ quyên sau 60 ngày quan sát 1.2 Cấu trúc số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA 17 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc đại diện chủng xạ khuẩn nội cộng sinh bốn môi trường đặc hiệu sau tuần nuôi cấy 24 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh phân bố phận quế 26 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh phân theo môi trường phân lập 27 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nôi cộng sinh phân theo nhóm màu 28 3.5 Hoạt tính kháng Proteus vulgaris (A), Staphylococus epdermidis ATTC 12228 (B) chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 30 3.6 Các chủng xạ khuẩn trước (A, C) sau (B, D) thử phản ứng màu 31 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện 32 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện 33 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện 33 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 1.1.2 Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 1.1.3 Cơ chế cộng sinh xạ khuẩn thực vật 1.1.4 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh Việt Nam 11 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 12 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh 12 1.3.2 Một số gen chức tham gia trình tổng hợp kháng sinh 14 1.3.3 Khả sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 16 1.4 Cây quế tiềm phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh 17 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Chủng giống 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Thiết bị 19 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Lấy mẫu 21 2.2.2 Xử lý bề mặt mẫu 21 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21 2.2.4 Đánh giá khả sinh anthracycline 22 2.2.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn nội cộng sinh 22 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh quế tỉnh Yên Bái 23 3.2 Một số đặc tính sinh học xạ khuẩn nội cộng sinh quế 26 3.2.1 Phân bố xạ khuẩn nội cộng sinh theo phận quế 26 3.2.2 Xạ khuẩn nội cộng sinh theo môi trường phân lập 27 3.2.3 Phân nhóm xạ khuẩn nội cộng sinh theo nhóm màu 28 3.3 Đánh giá khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn 29 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 29 3.3.2 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 31 3.3.3 Khuếch đại số gen chức tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 MỞ ĐẦU Ngày nay, người đối mặt với nhiều dịch bệnh gây vi khuẩn, nấm, virus vi sinh vật khác Để điều trị bệnh truyền nhiễm gây vi sinh vật, kháng sinh chất kháng vi sinh vật sử dụng chủ yếu Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc kháng sinh số loại vi khuẩn vi sinh vật khác ngày phổ biến Nên tìm kiếm tác nhân kháng vi sinh vật từ tự nhiên có hoạt tính cao ưu tiên hàng đầu nhà khoa học giới Ngoài ra, công ty, trường học, viện nghiên cứu giới không ngừng tìm kiếm phát triển loại kháng sinh nhằm giảm thiểu vấn đề kháng kháng sinh tác dụng phụ số thuốc hóa học gây Theo nghiên cứu Bérdy, 2005 ước tính khoảng 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên sử dụng y học lâm sàng sản sinh xạ khuẩn [11] Một nguồn phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật, đặc biệt dược liệu Gần đây, số nghiên cứu Đại học Vân Nam, Trung Quốc cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu sinh đa dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống ô xi hóa, chống sốt rét kiểm soát sinh học Tuy nhiên, so với đa dạng giới thực vật, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật hạn chế Vì hội để phân lập loài xạ khuẩn nội cộng sinh từ dược liệu hứa hẹn nhiều tiềm khai thác y học, nông nghiệp ngành công nghiệp Quế loài dược liệu trồng phổ biến nước ta Từ xa xưa, ông cha ta sử dụng quế vào nhiều mục đích khác như: chữa bệnh đường tiêu hoá, đường hô hấp, kích thích tuần hoàn máu, lưu thông thuyết mạch, làm cho thể ấm lên Hiện nay, giới Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh hợp chất sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh quế Vì vậy, tiến hành thực đề tài: “Phân lập đánh giá khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh quế thu thập tỉnh Yên Bái” Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 Đề tài thực phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam gồm nội dung sau: - Phân lập đánh giá đặc trưng xạ khuẩn nội cộng sinh mẫu quế thu thập tỉnh Yên Bái - Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân lập - Đánh giá có mặt số gen chức tham gia tổng hợp chất kháng sinh Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 3.2.2 Xạ khuẩn nội cộng sinh theo môi trường phân lập Kết đánh giá đa dạng chủng xạ khuẩn phân lập dựa loại môi trường đặc hiệu thể hình 3.3 Theo nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh, thành phần môi trường yếu tố định đến kết phân lập, đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh tìm loài xạ khuẩn Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh phân theo môi trường phân lập Kết hình 3.3 cho thấy, tỷ lệ phân lập chủng xạ khuẩn cao môi trường CA (21,9%); môi trường STA, SA đạt 19,05% 15,24% Số lượng chủng xạ khuẩn phân lập môi trường lại thấp, 6,4% tổng số chủng xạ khuẩn Năm 2015, Ajit K cộng tiến hành phân lập 42 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ loài dược liệu Mizoram, Ấn Độ Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh mọc loại môi trường khác nhau, tỷ lệ mọc môi trường starch casein nitrate agar (SCNA), actinomycetes isolation agar (AIA), tap water yeast extract agar (TWYE), glycerol asparagines agar (ISP5) malt yeast extract agar (ISP2) 13 chủng, 10 chủng, 10 chủng, chủng chủng [6] Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 27 3.2.3 Phân nhóm xạ khuẩn nội cộng sinh theo nhóm màu Mỗi loài xạ khuẩn đặc trưng màu sắc riêng Vì thế, màu sắc khuẩn ty coi tiêu chí để chọn lọc chủng xạ khuẩn nội cộng sinh môi trường phân lập, tránh chọn lọc chủng có đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau… Kết phân lập nhóm xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập mẫu quế nghiên cứu thể hình 3.4 Hình 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nôi cộng sinh phân theo nhóm màu Trên sở 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập loại môi trường khác có mùa sắc hệ khuẩn ty thuộc 4/7 nhóm màu xuất với tỷ lệ khác (Hình 3.4) Trong đó, xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc nhóm màu xám đạt tỷ lệ cao (53,33%) màu vàng (32,38%) không phát xạ khuẩn thuộc nhóm màu xanh, tím nâu Kết phù hợp với số nghiên cứu số tác giả phân lập từ đất số thực vật Ajit cộng (2015) tiến hành quan sát màu sắc khuẩn lạc 42 chủng xạ khuẩn phân lập từ loài dược liệu Kết cho thấy có 19 chủng có khuẩn lạc thuộc nhóm màu nâu (45,2%), 11 chủng có màu vàng (26,3%), chủng có màu xám (9,5%) chủng có màu trắng (19%) [6] Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 28 3.3 Đánh giá khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn Kết tổng hợp hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập quế thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Chủng vi sinh vật kiểm định ≤ 10 10-20 ≥20 Tổng số Tỷ lệ (%) Gram (-) Escherichia coli ATCC 11105 8,57 Proteus vulgaris CNLM 12 20 19,05 Salmonella enterica ATCC 14028 16 19 18,10 Pseudomonas aeruginosa CNLM 7,62 7 16 15,24 Sarcina lutea CNLM 3,1 Staphylococus epidermidis ATCC 12228 14 22 20,95 Bacillus cereus ATCC 11778 15 14,29 13 12,38 Enterobacter 13048 aerogenes ATCC Gram (+) Nấm men Candida albicans ATCC 10231 Từ kết cho thấy, 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ quế tỉnh Yên Bái, có 36 chủng kháng loại vi sinh vật kiểm định, chiếm 34,29% với mức độ kháng vi sinh vật kiểm định khác Trong đó, 20 chủng kháng Proteus vulgaris CNLM (19,05%) gây bệnh viêm màng não Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 29 tỷ lệ kháng thấp Sarcina lutea CNLM (3,81%) gây nhiễm trùng da Đặc biệt, 22 chủng kháng Staphylococus epidermidis ATCC 12228 (20,95%), 13 chủng kháng Candida albicans ATCC 10231 (12,38%) Đây số vi khuẩn gây bệnh động vật người như: viêm loét, viêm nhiễm da Một số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thể phổ kháng khuẩn rộng như: YBQ80 kháng chủng vi sinh vật kiểm định, YBQ 121 YBQ125 kháng chủng vi sinh vật kiểm định Trong đó, chủng có khả kháng Escherichia coli ATCC 11105 Salmonela enterica ATCC 14028 gây bệnh thương hàn A B Hình 3.5 Hoạt tính kháng Proteus vulgaris (A), Staphylococus epdermidis ATTC 12228 (B) chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Các kết cho thấy tính đa dạng khả kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn nội cộng sinh quế Nhiều công bố giới chứng minh khả kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Năm 2011, Abdul Kafur cộng phân lập 38 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ hải đằng (Catharanthes roseus) Trong có 20 chủng khác thể khả kháng Bacillus subtilis, Aeruginosa Pseudomonas, Proteus vulgaris, Candida albicans, Botrytis cinerea, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum, Fusarium solani Rhizoctonia solani [5] Zhao cộng phân lập 560 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ 26 dược liệu cao nguyên Panxi, Trung Quốc có 60 chủng thuộc chi Streptomyces thể hoạt tính kháng loại Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 30 vi sinh vật kiểm định (chiếm 10,7%), có 15 chủng có khả kháng mạnh với S Aureus [59] 3.3.2 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline Một nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư anthracycline 36 chủng xạ khuẩn phân lập tỉnh Yên Bái có hoạt tính kháng loại vi sinh vật kiểm định xác định khả anthracycline dựa vào phản ứng màu đặc hiệu nhóm hợp chất với thay đổi pH Kết cho thấy, 36 chủng nghiên cứu có 30 chủng thể phản ứng tức chuyển màu vàng cam có pH acid màu tím có pH base (Hình 3.6) Như vậy, hợp chất chủng xạ khuẩn thuộc nhóm kháng sinh anthracycline A B C D Hình 3.6 Các chủng xạ khuẩn trước (A, C) sau (B, D) thử phản ứng màu Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 31 3.3.3 Khuếch đại số gen chức tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Theo số nghiên cứu giới công bố, số sản phẩm trao đổi chất bậc hai có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư… xạ khuẩn nội cộng sinh tổng hợp nhóm enzyme chính: PKS-I, PKS-II NRPS Do đó, đánh giá gen liên quan đến trình sinh tổng hợp kháng sinh phân tích trình tự gen dự đoán cấu trúc nhóm kháng sinh xạ khuẩn sinh [27] DNA tổng số 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh kháng chủng vi sinh vật kiểm định sau xử lý với RNase kiểm tra điện di gel agarose 1,0% sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II NRPS Kết thể hình 3.7, hình 3.8 hình 3.9 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện Ghi chú: Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific); Băng 1: Đối chứng; Băng 2-8: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA hệ gen chủng xạ khuẩn YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ80, YBQ88, YBQ92, YBQ94 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 32 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện Ghi chú: Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific); Băng 15: Đối chứng; Băng 114: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA hệ gen chủng xạ khuẩn: YBQ2, YBQ19, YBQ21, YBQ25, YBQ36, YBQ40, YBQ44, YBQ46, YBQ47, YBQ50, YBQ56, YBQ59, YBQ63, YBQ65 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen NRPS số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện Ghi chú: Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific), băng 1: đối chứng, băng 2-6 sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA hệ gen chủng: YBQ 47, YBQ 46, YBQ 59, YBQ 75, YBQ 80 Kết hình 3.7, hình 3.8 hình 3.9 cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cho băng DNA có kích thước khoảng 1400 bp (đối với gen pks-I), 600 bp (pks-II) 750 bp Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 33 (nrps), tương ứng với kích thước mong đợi thiết kế mồi khuếch đại gen pks-I, pks-II nrps Điều cho thấy cặp mồi thiết kế thí nghiệm phù hợp Theo số liệu thống kê, có chủng mang gen pks-I (chiếm 25%), 19 chủng mang gen pks-II (chiếm 52,8%) 13 chủng mang gen nrps (chiếm 36,11 %) Trong số 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có khả kháng VSV kiểm định, có 13 chủng chưa khuếch đại gen pks-I, pks-II nrps Một số chủng có khả kháng khuẩn thấp, đồng thời không khuếch đại gen pks nrps YBQ44, YBQ50, YBQ101, YBQ106 Điều gen pks nrps chủng cặp mồi suy biến sử dụng nghiên cứu chưa phù hợp có đột biến điểm bắt cặp mồi Hơn nữa, tất gen nrps tham gia vào trình chuyển hóa thứ cấp, thay đó, gen có tham gia vào trình trao đổi sắt cảm biến quorum [23] Trong nghiên cứu, Li cộng (2012) công bố việc phân lập 228 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ hao hoa vàng Trong đó, tỷ lệ phát gen mã hóa PKS-I, PKS-II NRPS 21,1%; 45,2%; 32,5% [37] Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã phân lập 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ mẫu quế thu thập tỉnh Yên Bái loại môi trường phân lập khác Tỷ lệ xạ khuẩn phân lập từ thân, rễ, đạt tỷ lệ 38,1%, 35,2%, 26,7% Môi trường CA, STA, SA cho khả phân lập tỷ lệ xạ khuẩn cao nhất, đạt 21,9% đạt 19,0% 15,2% Các xạ khuẩn thu có khuẩn ty khí sinh thuộc nhóm màu xám (52,3%), vàng (32,4), trắng (8,6%), đỏ (5,7%) Sàng lọc 36 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV số loại VSV kiểm định: tỷ lệ kháng Escherichia coli ATCC 11105, Proteus vulgaris CNLM, Salmonella enterica CNLM, Enterobacter aerogenes ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 13048, Sarcina lutea CNLM, Staphylococus epidermidis ATCC 12228, Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231 đạt 8,6; 19,1; 18,1; 7,6; 15,2; 3,1; 21,1; 14,3; 12,4% Trong 36 chủng xạ khuẩn kháng sinh: 30 chủng tổng hợp kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin; tỷ lệ chủng mang gen pks-I, pks-II, nrps đạt 25%, 52,8%, 36,1% 4.2 Kiến nghị So sánh đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh quế thu thập Yên Bái với xạ khuẩn thu thập từ số tỉnh khác Việt Nam Phân loại chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hoàng Hoa Long, Dorothea M, Ian TB (2013): Vi khuẩn nội cộng sinh Bacillus sp.B55 phân lập từ Nicotiana attenuata kích thích sinh trưởng tăng khả thích nghi chủ điều kiện tự nhiên; Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc; 2: 329-333 Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng, Trần Huy Thái, Dương Đức Huyến (2005): Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội ký sinh thực vật từ số vườn quốc gia phía bắc Việt Nam; Tạp chí hóa học; 352: 20-23 Lê Trần Đức (1997): Cây thuốc Việt Nam; Nhà xuất Nông nghiệp; 263 Nguyễn Minh Khởi, Đào Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trần Minh Ngọc: Chiết xuất phân lập số phenolic glycosid từ quế chì Việt Nam (Cinnamomum cassia blume) TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abdul K, Anisa BK (2011) Isolation of endophytic actinomycetes from Catharanthes roseus (L) G Don leaves and their antimicrobial activity Iranian journal of biotechnology, 9: 302-306 Ajit K, Vineet K, Ratul S, Vijai K and Singh P (2015) Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthesis potential Original reseach, 6: 1-13 Aparicio JF, Fouces R, Mendes MV, Olivera N, and Martin JF (2000) A complex multienzyme system encoded by five polyketide synthase genes is involved in the biosynthesis of the 26-membered polyene macrolide pimaricin in Streptomyces natalensis Chem Biol, 11: 895-905 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 36 Ayuso A, Sacido and Genilloud O (2004) New PCR primer for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups, 49: 10-24 Baby J, Sankarganesh P, Biby T and Justin SR (2012) Endophytic Streptomycetes from plants with novel green chemistry: review International journal of biological chemistry, (2): 42-52 10 Bacon CW, White JF (2000) Microbial endophytes New York Marce Dekker 11 Bérdy J (2005) Bioactive microbial metabolites J Antibiot, 58:1–26 12 Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005) Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots FEMS Microbiol, 247:147–152 13 Caruso M, Colombo AL, Fedeli L, Pavesi A, Quaroni S, Saracchi M, Ventrella G (2000) Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers Ann Microbiol, 50:3–13 14 Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ, Hess WM, Porter H, Jensen JB, Albert H, Robison R, Condron MAM, Teplow DB, Stevens D, Yaver D (2002) Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans Microbiology, 148:2675–2685 15 Clark CA, Matthews SW (1987) Histopathology of sweet potato root infection by Streptomyce sipomoea Phytopatholog, 77:1418–1423 16 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005) Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects Appl Environ Microbiol, 71:4951– 4959 17 Coombs JT, Franco CMM (2003) Isolation and identification of actinobacteria isolated from surface-sterilized wheat roots Appl Environ Microbiol, 69: 5603– 5608 18 El- Tarabily KA, Sivasithamparam K (2006) Non- streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil- borne fungal plant pathogens and as plants growth promoters Soil Biol Biochem, 38: 1505-1520 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 37 19 El-Bondkly AM, El-Gendy MM (2010) Keratinolytic activity from new recombinant fusant AYA2000, derived from endophytic Micromonospora strains Can J Microbiol, 56: 748-760 20 El-Tarabily KA, Hardy GESJ, Sivasithamparam K, Hussein AM, Kurtboke DI (1997) The potential for the biological control of cavity-spot disease of carrots, caused by Pythium coloratum, by streptomycete and non-streptomycete actinomycetes New Phytol, 137:495–507 21 Fatema Jariwala, Ravi Ranjan (2013) Endophytic actinomyces and their role in protection Biological sciences, 1:73-78 22 Franco C, Michelsen P, Percy N, Conn V, Listiana E, Moll S, Loria R, Coombs J (2007) Actinobacterial endophytes for improved crop performance.;Australas Plant Pathol, 36:524–531 23 Finking R and Marahiel MA (2004) Biosynthesis of nonribosomal peptides Annu Rev Microbiol, 58: 453–488 24 Gewirtz DA (1999) A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics Adriamycin and daunorubicin Biochem pharmacol, 57 (7):727 25 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, luca G (2004) Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity Pharmacol Rew, 56: 185-229 26 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010) Sequense-based analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria Appl Environ Microbiol, 76(8): 2487-2499 27 Gonzalez I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O (2005) Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences FEMS Microbiol Ecol, 54: 401-415 28 Gu Q, Luo HL, Zheng W, Liu ZH, Huang Y (2006) Pseudonocardia oroxyli sp nov, isolated from Oroxylum indicum root Int J Syst Evol Microbiol, 56: 2193– 2197 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 38 29 Gunter Brader, Stéphane Compant, Birgit Mitter, Friederike Trognitz and Angela Sesitsch (2014) Metabolic potential of endophytic bacteria Science Direct, 27: 30-37 30 Hisayuki K, Natsuko I, Akira H, Takahashi-Nakaguchi A, Tetsuhiro M, Kenichiro S, Nobuyuki Fujita and Tohru Gonoi (2014) Genome based analysis of type-I polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase gene clusters in seven strains of five representative Nocardia species BMC Genomics, 15: 323 31 Huang JS (1986) Ultrastructure of bacteria lpenetration in plants Annu Rev Phytopathol, 24:141–157 32 Kaewkla O, Franco CMM (2010a) Nocardia callitridis sp.nov; an endophytic actinobacterium isolated from a suface-sterilized root of an Australian native pine tree Int J Syst Evol Microbiol, 60: 1532-1536 33 Kunoh H (2001a) Disease resistance of tissue-cultured seedlings of rhododendron after treatment with Streptomyces sp R-5 J Gen Plant Pathl, 67: 325–332 34 Kunoh H (2002) Endophytic actinomycetes: attractive biocontrol agents J Gen Plant Pathol 68: 249–252 35 Kupchan SM, Komoda Y, Court WA, Thomas GJ, Smith RM, Karim A, Gilmore CJ, Haltiwanger RC, Bryan RF (1972) Maytansine, a novel antileukaemic ansa macrolide from Maytenus ovatus J Am Chem Soc, 94:1355– 1356 36 Li GH, Yu ZF, Li X, Wang XB, Zheng LJ, Zhang KQ (2007) Nematicidal metabolites produced by the endophytic fungus Geotrichum sp AL4 Chem Biodivers, 4: 1520-1524 37 Li J, Zhao GH, Huang HY, Qin S, Zhu WY, Zhao LX, Xu LH, Zhang S, Li WJ, Strobel G (2012) Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua L Original paper,101: 515:527 38 Madhurama G, Sonam D, Gupta UP and Kharwar RN (2014) Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India African Journal of Microbiology Research, (2): 184-191 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 39 39 Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013) Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia Life Sci J, 10(4): 974-980 40 Meguro A, Ohmura Y, Hasegawa S, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006) An endophytic actinomycete, Streptomyces sp MBR-52, that accelerates emergence and elongation of plant adventitious roots Actinomycetologica, 20: 1– 41 Merzaeva Shirokikh (2010) The production of auxins by the endophytic bacteria of Winter Rye Appl Biochem and Microbiol, 3: 44-50 42 Qin S, Chen HH, Klenk HP, Zhao GZ, Li J, Xu LH, Li WJ (2009a) Glucomyces scopariae sp Nov and Glycomyces mayteni sp Nov; isolated from two medicinal plants in China Int J Syst Evol Microbiol, 59: 1023-1027 43 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011) Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-asociated endophytic actinobacteria Appl Microbiol Biotechnol, 89: 457-473 44 Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ (2009d) Nonomuraea antimicrobica sp nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis Int J Syst Evol Microbiol, 59: 2453–2457 45 Sardi P, Saracchi M, Quaroni S, Petrolini B, Borgonovi GE, Merli S (1992) Isolation of endophytic Streptomyces strains from surface-sterilized roots Appl Environ Microbiol, 58: 2691–2693 46 Shimizu M, Yazawa S, Ushijima Y (2009) A promising strain of endophytic Streptomyces sp for biological control of Cucumber anthracnose J Gen Plant Pathol, 75: 27–36 47 Smith GE (1957) Inhibition of Fusarium oxysporum f Sp Lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato Phytopathology, 47: 429-432 48 Snipes CE, Duebelbeis DO, Olson M, Hahn DR, Dent WH, Gilbert JR, Werk TL, Davis GE, Lee-Lu R, Graupner PR (2007) The endophytes in the stems and roots of rice Microb Ecol, 53: 700 – 707 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 40 49 Sri P, Yulin L, Antonius Su, Sri B, Latifah KD (2012) Alpha- glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal, plant IJPSR, 4(3): 327-333 50 Strobel G, Daisy B (2003) Endophytes as sources of bioactive products Microbes Infect, 5: 535-544 51 Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004) Natural products from endophytic microorganisms J Nat Prod, 67: 257–268 52 Suzuli T, Shimizu M, Meguro A, Hasegawa S, Nishimura T, Kunoh H (2005) Visualization of infection of an endophytic actinomyces Streptomyces galbus in leaves of tissue-cultured rhododendron, 19: 7-12 53 Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S (2005) Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity Microbiology, 151: 1691–1695 54 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b) Antitumor activity of 4arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 J Cancer Res Trer, 3: 86–91 55 Tang L, Shah S, Chung L, Carney J, Katz L, Khosla C, and Julien B (2000) Cloning and heterologous expression of the epothilone gene cluster Science, 287: 640-642 56 Thongsandee W, Matsuda Y, Shimizu M, Ehara H, Ito S (2013) Isolation of endophytic Streptomyces from above- and below- ground organs of Querous serrada J For Res, 18: 179-189 57 Verma VC, Gond SK, Kumar A, Mishra A, Kharwar RN and Gange AC (2009) Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity Microb Ecol, 57: 749–756 58 Zhang HW, Song YC, Tan RX (2006) Biology and chemistry of endophytes Nat Prod Rep, 23: 753-771 59 Zhao PJ, Fan LM, Li GH, Zhu N, Shen YM (2005) Antibacterial and antitumor macrolides from Sreptomyces sp Is91131 Arch Pharm Res, 28: 1228-1232 Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 41 [...]... cây hồi, quế, atiso… Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh, cũng như đánh giá đa dạng xạ khuẩn trên cây quế 1.3 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng trong việc đẩy lùi bệnh tật do vi khuẩn hay nấm gây ra như thương hàn,... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại tỉnh Yên Bái Kết quả quan sát mẫu phân lập cho thấy, các chủng xạ khuẩn phát triển khá chậm trên 9 loại môi trường thạch, số lượng xạ khuẩn không nhiều, đạt 2-3 chủng/mẫu Theo các công bố, tinh dầu trên cây dược liệu nói chung và quế nói riêng có khả năng kháng vi sinh vật nên số lượng vi sinh vật nội cộng sinh trên các cây dược... trường phân lập Kết quả đánh giá đa dạng các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên 9 loại môi trường đặc hiệu được thể hiện trên hình 3.3 Theo các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, thành phần môi trường là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh giá sự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh và tìm ra các loài xạ khuẩn mới Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh phân theo các môi trường phân lập Kết... (2014) đã phân lập được 40 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ 3 cây thu c tại Ấn Độ là lô hội, cây hương nhu tía và cây bạc hà Tỷ lệ phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cao nhất ở rễ (70%), thân (17,2%) và lá (12,5%) [38] Năm 2009, Verma và cộng sự đã phân lập từ 20 cây sầu đâu, bắc Italia cho kết quả rễ đạt 55%, thân 24% và lá 21% [57] Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03 26 3.2.2 Xạ khuẩn nội cộng sinh. .. Phân bố xạ khuẩn nội cộng sinh theo bộ phận cây quế Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh được phân bố trên các bộ phận của cây quế Kết quả hình 3.2 cho thấy, xạ khuẩn nội cộng sinh có mặt trên tất cả các bộ phận của cây, trong đó số chủng xạ khuẩn phân lập từ thân là cao nhất (38,1%), tiếp theo là rễ (35,23%) và thấp nhất là lá (26,67%) Theo một số nghiên cứu, giả thuyết được đưa ra là rễ và thân được... chủng xạ khuẩn trên môi trường phân lập, tránh chọn lọc các chủng có cùng đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau So sánh với kết quả nghiên cứu của Oliveira và cộng sự (2012) đã phân lập được 70 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây cà chua cho thấy tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trong nghiên cứu là tương đối cao Điều này chứng tỏ, mức độ đa dạng của các chủng xạ khuẩn trên mẫu phụ thu c vào phương... trong y học và đời sống như chất kháng sinh, chất kháng ung thư, chất kích thích tăng trưởng,… Kháng sinh, kháng ung thư, kháng viêm Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế cao hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Do đó, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng để phát triển các loại thu c kháng sinh mới... sinh được chú ý bởi khả năng tổng hợp chất kháng sinh ức chế VSV gây bệnh Bên cạnh việc nghiên cứu tác dụng dược phẩm thu nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh, một số nhà nghiên cứu đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh trong suốt hai thập kỷ qua [33, 34] Kunoh cũng đã cho thấy khả năng kiểm soát sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh trước tác nhân gây bệnh của đất qua rễ các... tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là chìa khóa để khai thác những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội cộng sinh trong kích thích sinh trưởng ở thực vật Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò quan trọng của xạ khuẩn nội cộng sinh trong việc tổng hợp chất kháng sinh Tiềm năng khai thác của các hợp chất có hoạt tính sinh học mà xạ khuẩn nội cộng sinh sinh ra càng lớn do sự đa dạng của chúng... nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên thế giới Trong vài thập kỷ qua, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các loài xạ khuẩn nội cộng sinh cũng như các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong mô tế bào thưc vật Rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh cũng như các hợp chất mới đã được tìm thấy từ xạ khuẩn nội cộng sinh Sơ lược về