xác định một số chủng vi khuẩn xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở một số tỉnh vùng đồng bằng sông hồng và đánh giá tính chống chịu của một số giống lúa địa phương

đánh giá khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của bộ giống lúa thử nghiệm tắnh kháng bạc lá của IRRI với 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh bạc láẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦ..ẦẦẦ..ẦẦẦ..... oryzae ở một số ñịa phươn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-* - NGUYỄN HUY MẠNH

XÁC ðỊNH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

XANTHOMONAS ORYZAE PV ORYZAE GÂY BỆNH

BẠC LÁ LÚA Ở MỘT SỐ TỈNH VÙNG ðỒNG BẰNG

SÔNG HỒNG VÀ ðÁNH GIÁ TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA

MỘT SỐ GIỐNG LÚA ðỊA PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số : 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học:PGS.TS Nguyễn Văn Viết

HÀ NỘI – 2009

LỜI CẢM ƠN!

Lời ñầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Viết người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS Trần Quang Tấn, TS Nguyễn Tất Khang, ThS ðặng Thị Phương Lan cùng toàn thể giáo viên và các anh, chị, em cán bộ Ban ñào tạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành ñề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám ñốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Môi trường Nông nghiệp cùng toàn thể bạn bè và ñồng nghiệp ñã ñộng viên và tạo ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Lời cuối cùng là lòng biết ơn vô hạn dành cho cha mẹ, cùng tất cả thành viên trong gia ñình ñã giúp sức và tạo ñiều kiện cho tôi ñược học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Huy Mạnh

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Viết Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người viết cam ñoan

Nguyễn Huy Mạnh

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cảm ơn ii

Lời cam ñoan iii

Mục lục……… iv

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vẽ, ñồ thị vii

MỞ ðẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU… 4

1.1 Cơ sở khoa học của ñế tài……… 4

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước 4

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35

2.2 Nội dung nghiên cứu 35

2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập và xác ñịnh ñộc tính của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên môi trường và xác ñịnh vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR……….……… ………

42 3.1.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh……….………… ………. 42

3.1.2 Kết quả phân lập trên môi trường, xác ñịnh bằng kỹ thuật PCR vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae và xác ñịnh ñộc tính của vi khuẩn …… ……… ……….……… ……… …

46

3.2 Xác ñịnh các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây 55

bệnh bạc lá lúa bằng bộ giống lúa chỉ thị nòi quốc tế và bằng phân

tắch ADNẦẦẦ

3.2.1 Phản ứng của bộ giống chỉ thị chuẩn nòi quốc tế với các nguồn vi khuẩnẦẦẦ.ẦẦẦ.

55 3.2.2 Xác ựịnh các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa bằng phân tắch ANDẦẦẦ

57 3.3 Nghiên cứu sự phân bố các chủng vi khuẩn bạc lá lúa ở ựồng bằng sông HồngẦẦẦ.ẦẦẦ

62 3.4 đánh giá khả năng chống chịu của nguồn gen lúa ựịa phương với các nhóm chủng gây hại phổ biếnẦẦẦẦ ẦẦẦẦ.ẦẦẦ

66 3.4.1 đánh giá khả năng chống chịu bệnh bạc lá của 31 giống lúa ựang trồng phổ biến trong sản xuấtẦẦẦ.ẦẦẦ

66 3.4.2 đánh giá khả năng chống chịu của một số giống lúa phổ biến trong sản xuất và một số dòng, giống lúa có triển vọng với 43 nguồn vi khuẩnẦẦ

68 3.4.3 đánh giá khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của một số nguồn gen lúa ựịa phương với 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh bạc láẦẦ

70 3.4.4 đánh giá khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của bộ giống lúa thử nghiệm tắnh kháng bạc lá của IRRI với 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh bạc láẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦ ẦẦẦ ẦẦẦ

72 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 80

1 Kết luận 80

2 đề nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

1 Tài liệu Tiếng ViệtẦẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦ.Ầ.ẦẦ. 82

2 Tài liệu Tiếng AnhẦẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦẦ. 85

PHỤ LỤC: MỘT SỐ HÌNH ẢNHẦẦẦ.ẦẦẦ.ẦẦẦ

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

STT Chữ cái viết tắt Nghĩa

3.2 Kết quả phân lập trên môi trường và xác ñịnh bằng kỹ thuật

PCR vi khuẩn Xanthomonas oryzae

46

3.3 ðộc tính của các isolate vi khuẩn thu thập ở một số vùng trồng

lúa ở miền Bắc Việt Nam

3.7 Sự phân bố của các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas

63

3.8 Tần suất xuất hiện của nhóm chủng vi khuẩn bạc lá lúa

(Xanthomonas oryzea pv oryzae) ở một số ñịa phương

64

3.9 Kết quả ñánh giá khả năng chống chịu bệnh bạc lá của 31

giống lúa ñang trồng phổ biến trong sản xuất

67

3.10 Khả năng chống chịu của một số giống lúa phổ biến trong sản

xuất và một số dòng, giống lúa có triển vọng với 43 nguồn vi

khuẩn

69

3.11 Kết quả ñánh giá khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của một

số nguồn gen lúa với 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh bạc lá

70 3.12 Kết quả ñánh giá khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của bộ 73

giống lúa thử nghiệm tính kháng bạc lá của IRRI với 3 nguồn vi

khuẩn gây bệnh bạc lá

3.13 Kết quả ñánh giá khả năng chống chịu bệnh bạc lá của một số

nguồn gen lúa với 3 nguồn vi khuẩn

3.8 Tỷ lệ (%) của các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là

một trong những bệnh nguy hiểm ñối với ngành sản xuất lúa của nhiều quốc gia vùng nhiệt ñới Bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, ñặc biệt gây hại nghiêm trọng trên các giống nhập nội từ Trung Quốc như: Khang Dân, Tạp Giao, Q5, Bắc Ưu, Nhị Ưu 838…trong cả vụ mùa lẫn vụ xuân Bệnh phá hại nặng vào giai ñoạn lúa làm ñòng ñến chín sữa, dẫn ñến giảm năng suất nghiêm trọng, thậm chí mất trắng, không cho thu hoạch Trong những năm gần ñây, ở miền Bắc Việt Nam bệnh trở nên nghiêm trọng và phá hại nặng hơn trong cả 2 vụ, do mức ñầu tư thâm canh cao, bón quá nhiều ñạm và bón phân không cân ñối, ñồng thời trồng nhiều giống lúa mới nhiễm bệnh ñược nhập nội từ Trung Quốc

Cho ñến nay, biện pháp phòng trừ chính vẫn là sử dụng các kỹ thuật canh tác và vệ sinh ñồng ruộng Biện pháp hoá học có hiệu quả không cao ñối với bệnh bạc lá lúa, thậm chí còn gây ra ô nhiễm môi trường Vì vậy, chọn tạo giống chống bệnh ñược coi là hướng ñi có hiệu quả nhiều mặt Sử dụng giống chống bệnh sẽ giảm bớt chi phí sản xuất, giảm lượng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm nông nghiệp sạch

ðể chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá hiệu quả cần phải nghiên cứu, xác ñịnh các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá và các gen kháng bệnh Vi khuẩn gây bệnh có tính ña dạng di truyền hình thành các nhóm nòi, các chủng có tính gây bệnh, tính ñộc rất khác nhau trên các giống lúa và ở các vùng sinh thái khác nhau Các nhà khoa học trên thế giới ñã phát hiện ñược

24 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau và ở mỗi vùng, thậm chí trong cùng một vết bệnh cùng tồn tại một số chủng nhất ñịnh Ở Philipin ñã phát hiện ñược 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn ðộ 9 chủng Việt Nam là vùng nhiệt ñới gió mùa, có ñiều kiện sinh thái ña dạng thường xuất hiện nhiều chủng

gây bệnh có ñộc tính cao và sự ña dạng về chủng rất lớn gây nhiều trở ngại cho công tác phòng trừ Ở Việt Nam cũng ñã có một số tác giả nghiên cứu

về bệnh bạc lá như: Lê Lương Tề, (1980); Nguyễn Hữu Thuỵ, (1980); Tạ Minh Sơn, (1987); Nguyễn Bá Trịnh, (1993); Hà Minh Trung, (1996); Nguyễn Văn Tuất, (1996); Lưu Văn Quyết, (1999); Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ, (2003); Nguyễn Văn Viết và CTV, (2005) [11], [16], [10], [19], [20], [21], [9], [18], [24]

ðể xác ñịnh ñược ña dạng di truyền một số chủng vi khuẩn

cũng như xác ñịnh ñược nguồn gen lúa cổ truyền có khả năng chống chịu với các chủng phổ biến làm vật liệu chọn tạo giống lúa kháng bệnh chúng tôi thực

hiện ñề tài: “Xác ñịnh một số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

gây bệnh bạc lá lúa ở một số tỉnh vùng ñồng bằng sông Hồng và ñánh giá tính

2 Mục tiêu của ñề tài

(1) Xác ñịnh ñược một số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

(2) Xác ñịnh ñược nguồn gen lúa ñịa phương có khả năng chống chịu với các chủng phổ biến làm vật liệu chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

(1) Ý nghĩa khoa học của ñề tài

Kết quả của ñề tài nhằm bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác

nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

gây ra và tìm ñược nguồn gen lúa kháng bệnh bạc lá từ nguồn giống lúa ñịa phương làm vật liệu cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh

(2) Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

Góp phần giải quyết ñược vấn ñề khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh bạc lá lúa trong sản xuất bằng con ñường sử dụng giống chống bệnh;

ñây là hướng có hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi trường: sử dụng giống chống bệnh sẽ giảm bớt chi phí sản xuất, giảm lượng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm nông nghiệp sạch

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu

(1) ðối tượng nghiên cứu

- Cây trồng: các giống lúa ñang trồng phổ biến ở một số tỉnh vùng ñồng bằng sông Hồng, một số nguồn gen lúa bản ñịa, nguồn gen lúa nhập nội, các giống lúa chỉ thị nòi, lúa thuần và lúa lai trong nước, lúa thuần và lúa lai Trung Quốc

- Vi khuẩn: các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở một số vùng trồng lúa

- Xác ñịnh các giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phân tích ADN tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- Các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo ñược thực hiện tại nhà lưới và ñồng ruộng của Viện Bảo vệ thực vật và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học của ựề tài

Thực tế sản xuất lúa cho thấy, có rất nhiều giống lúa hầu như không bị nhiễm bệnh bạc lá hoặc có nhiễm thì tỷ lệ cũng rất thấp, ựiều ựó khẳng ựịnh rằng ở những giống lúa ựó có những gen có khả năng chống bệnh bạc lá

Mặt khác, các kết quả nghiên cứu trên thế giới ựã phát hiện ựược 24 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau Tuy nhiên, mỗi gen kháng bệnh chỉ có thể kháng ựược một chủng hay một số chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá nhất ựịnh

Vì vậy, ựể chọn tạo ựược giống lúa kháng bệnh bạc lá hiệu quả ở miền Bắc Việt Nam cần phải nghiên cứu xem ở các tỉnh trồng lúa vùng ựồng bằng sông Hồng ựang tồn tại bao nhiêu chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá, trong ựó có bao nhiêu chủng phổ biến, giống lúa nào chống ựược chủng nào và chống ựược bao nhiêu chủng

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình bệnh bạc lá và thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra

Bệnh bạc lá gây hại nghiêm trọng ựối với cây lúa Bệnh xuất hiện trên phạm vi ựịa lý rất rộng và gây hại rất nặng ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới đã có rất nhiều các công trình ghi nhận về thiệt hại do bệnh bạc lá gây

ra Theo Mew và CTV (1987) [63] bệnh gây hại tới 60% năng suất mỗi năm

Ở các nước Châu Á nhiệt ựới, bệnh bạc lá ựược xem như một trong những bệnh hại lúa quan trọng nhất đặc biệt, trong những năm 1960 và ựầu những năm 1970, với việc mở rộng diện tắch giống IR8 cùng các giống thấp cây năng suất cao khác, bệnh ựã phát sinh thành dịch lớn ở Ấn độ, Philippines và nhiều nước khác

Mức ựộ gây hại của bệnh bạc lá còn tuỳ thuộc vào giai ựoạn nhiễm bệnh Khi theo dõi hai giai ựoạn làm ựòng và chắn sữa của giống lúa RD1 tại trại lúa Bang Khen, Bang Kok Ờ Thái Lan các nhà khoa học ựã kết luận rằng nếu lúa bị bệnh ở giai ựoạn làm ựòng bệnh không ảnh hưởng nhiều ựến trọng lượng hạt và tỷ lệ lép của hạt, nếu bệnh xuất hiện ở giai ựoạn chắn sữa tỷ lệ

lép tăng nên một cách rõ rệt theo mức ựộ nhiễm bệnh Ở Ấn độ ựã ựánh giá mức ựộ thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra và cho rằng năng suất lúa giảm theo tỷ

lệ thuận với mức ựộ nhiễm bệnh

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

bị bệnh có thể giảm từ 6Ờ60% năng suất Những thắ nghiệm của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam ựã khẳng ựịnh giống lúa Trân Châu lùn

bị bệnh 100%, vụ mùa năm 1969 ựạt năng suất 17,7tạ/ ha và vụ mùa năm

1970 chỉ ựạt 15tạ/ ha Năng suất lúa bị bệnh giảm so với ruộng bình thường không bị bệnh là 40-60% [8] Trong những năm 1970 Ờ 1975 bệnh tiếp tục phát triển và gây hại nghiêm trọng trên các giống lúa mới ngắn ngày có năng suất cao, ựặc biệt là giống NN8 cấy trong vụ mùa Bệnh gây hại nặng ở các tỉnh ựồng bằng ven biển như Hà Nam Ninh, Thái Bình với 18% diện tắch giống NN8 bị bệnh, năng suất giảm 30 Ờ 60% [4]

Vụ mùa năm 1996 ở các tỉnh phắa Bắc, bệnh ựã phát sinh gây hại trên diện rộng và ảnh hưởng nghiêm trọng ựến năng suất Tỷ lệ lá bị bệnh trên nhiều giống lên tới 90 Ờ 100% với cấp 7 Ờ 9 và gây cháy lá Vụ mùa năm

1996 là vụ bị bệnh bạc lá, ựốm sọc vi khuẩn nặng nhất trong vòng 5 năm (1993 - 1998), diện tắch bị nhiễm bệnh ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung là 304.700ha trong ựó có 125.400ha bị nhiễm nặng, có 1.850ha hầu như không cho thu hoạch Vụ đông Xuân năm 1997 sau ựợt mưa dông bệnh phát sinh mạnh, tỷ lệ bệnh trung bình 20%, nơi cao là 70-90%, chủ yếu trên các giống lúa lai, lúa thuần Trung Quốc, CR203 và một số giống khác

Theo Tạ Minh Sơn (1987) [10], bệnh bạc lá làm giảm năng suất lúa ựáng kể, cứ 1% chỉ số bệnh làm giảm 0,94tạ/ ha

Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc bệnh thường gây hại nặng và làm giảm năng suất 30-60% Ở phắa Nam, bệnh thường gây hại quanh năm, những vụ mùa mưa nhiều bệnh thường gây hại nặng hơn

Có thể khẳng ñịnh rằng: bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas

suất và phẩm chất lúa gạo cần phải có các biện pháp quản lý tổng hợp ñối với bệnh này

Theo Tạ Minh Sơn (1987) [10] triệu chứng bệnh bạc lá ñôi khi bị nhầm với triệu chứng khác như ñốm sọc vi khuẩn, khô ñầu lá sinh lý, bệnh lá già, có thể phân biệt dựa vào các ñặc ñiểm sau:

- ðốm sọc vi khuẩn: vết bệnh là các sọc ngắn, nhỏ, phần lớn giữa phiến lá, dịch khuẩn nhanh khô

- Khô ñầu lá: vết bệnh ở ñầu lá lan dần xuống mép lá, không phân biệt giữa phần bệnh và phần khoẻ, không có dịch vi khuẩn, khô hạn dễ phát sinh

- Bệnh bạc lá vi khuẩn: bệnh xuất hiện ñầu tiên ở mép lá hoặc ñầu lá, trên vết bệnh thường tiết ra những giọt dịch vi khuẩn như keo màu vàng mật ong

- Bệnh lá già: vết bệnh ở mép lá, màu trắng xám, không có giọt dịch, trên lá có những chấm ñen nhỏ

Trên mạ: triệu trứng bệnh không thể hiện ñặc trưng như trên lúa, vết bệnh trên mạ thường ở mép và ñầu mút lá với những vết bệnh có ñộ dài ngắn khác nhau, có màu xanh vàng, nâu nhạt rồi khô xác [6]

Trên lúa: bệnh thường xuất hiện từ thời kỳ ñứng cái trở ñi Bệnh xuất hiện ñầu tiên ở mép lá và ñầu lá, ñôi khi trong phiến lá xuất hiện những chấm

nhỏ xanh nhạt, trên vết bệnh thường tiết ra những giọt dịch vi khuẩn như keo màu vàng mật ong Các chấm nhỏ phát triển thành vết lớn, lá bạc màu và trở nên khô trắng

1.2.3 Tác nhân gây bệnh

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra và ñược ghi

nhận lần ñầu tiên vào năm 1908 bởi Takaishi và ñến năm 1911 Bokura ñã

phân lập vi khuẩn gây bệnh và ñặt tên là Bacillus oryzae Sau ñó Ishiyama nghiên cứu về hình thái và sinh lý ñã ñổi tên thành Pseudomonas oryzae theo

hệ thống phân loại của Imigula Sau lại ñược ñổi thành Bacterium oryzae và tiếp ñó ñổi thành Xanthomonas oryzae Năm 1980 ñược ñổi lại theo Hội bệnh học thực vật quốc tế là Xanthomonas campestris pv oryzae Dye Năm 1999 bệnh ñược ñặt tên theo loài và chuyển thành Xanthomonas oryzae pv oryzae

Vi khuẩn có dạng hình gậy, hai ñầu hơi tròn, có một lông roi ở một ñầu, kích thước từ 1-2 x 0,5-0,9µ Trên môi trường nhân tạo khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn, có màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, hảo khí, nhuộm gram âm Vi khuẩn có khả năng phân giải NO3-, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3+, Indon, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có ñường Nhiệt ñộ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng khoảng 26 – 300C, nhiệt ñộ tối thiểu 0 – 50C, tối ña 400C Nhiệt ñộ gây chết vi khuẩn 530C [6]

Vi khuẩn xâm nhập có tính thụ ñộng: xâm nhiễm qua khí khổng, qua vết thương, các lỗ khí khổng mở tự nhiên sau ñó theo bó mạch xâm nhập và lan rộng ra toàn cây Trong ñiều kiện mưa ẩm thích hợp cho sự phát triển của

vi khuẩn trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt dịch vi khuẩn có màu vàng

Nghiên cứu về phạm vi ký chủ của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

như; cỏ Leersia sayamaka Ohroi, Leersia oryzoides (L) SW, Leersia

L.filiformis và L.panacoa ở Philippines, cỏ Cyperus rotundus L và

Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây - ðại học Nông nghiệp I và một số tác giả ñã cho thấy nguồn bệnh bạc lá tồn tại trong hạt giống, chúng có thể tồn tại trên vỏ hạt, phôi nhũ Trong ñất vi khuẩn có thể tồn tại từ 1-3 tháng trong ñiều kiện bình thường, tàn dư cây trồng, cỏ dại

và lúa chét, trên ruộng bị bệnh vụ trước cũng là nguồn lưu dữ vi khuẩn, ñây là nguồn bệnh có ý nghĩa quan trọng lan truyền cho vụ sau [15], [6] Fang (1963) [39] cũng ghi nhận ñược kết quả tương tự

1.2.4 Quy luật phát sinh, phát triển

Theo một số tác giả ở miền Bắc Việt Nam bệnh có thể phát sinh, phát triển ở tất cả các vùng trồng lúa trong cả 2 vụ lúa Vụ Chiêm Xuân bệnh thường phát sinh vào tháng 3 – 4, phát triển mạnh hơn vào tháng 5 – 6 khi lúa Chiêm Xuân trỗ và chín Tuy nhiên, bệnh thường phát sinh và gây hại nặng trong vụ Mùa Bệnh có thể phát sinh sớm vào tháng 8 khi lúa ñẻ nhánh ñến khi lúa ñứng cái làm ñòng - trỗ - chín sữa với các trà lúa sớm ðối với các giống lúa mẫn cảm thường bị nhiễm bệnh rất sớm và nặng Các trà lúa cấy muộn trỗ vào tháng 10 thường bị bệnh nhẹ hơn nên tác hại cũng ít hơn Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai ñoạn lúc cây lúa làm ñòng ñến chín sữa [12]

Ở những nơi ñất chua, ngập úng hoặc mực nước sâu ñặc biệt, ở những vùng ñất hẩu nhiều mùn bị che bóng thì bệnh bạc lá phát triển rất mạnh Ngoài ra, kỹ thuật trồng trọt cũng là một trong những ñiều kiện quan trọng ảnh hưởng ñến sự phát sinh phát, phát triển của bệnh như việc bón ñạm quá nhiều, cây lúa xanh tốt, thân lá mềm yếu cũng là ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển

Vi khuẩn xâm nhập vào cây lúa thông qua khí khổng và vết thương cơ giới ðối với cây mạ khi nhổ cấy rễ bị ñứt nên vi khuẩn xâm nhập qua vết thương gây bệnh trên hệ thống mạch dẫn hoặc do lây nhiễm nhân tạo trước khi ñem cấy nên cây dễ bị héo rũ

Bệnh bạc lá gây hại nặng trong ñiều kiện nóng ẩm, nhiệt ñộ 25 – 300C, mưa nhiều, gió mạnh tạo ra các vết thương cơ giới Ngoài ra, bón nhiều phân ñạm, không cân ñối giữa phân lân và kali cũng làm cho bệnh dễ phát sinh thành dịch Bệnh có thể lây lan thông qua nước tưới, nước mưa, gió và thông qua tiếp xúc giữa cây khoẻ và cây bị bệnh Mặt khác, các thao tác, dụng cụ trong qúa trình cấy lúa cũng là các yếu tố truyền bệnh từ cây bị bệnh sang cây khỏe

1.2.5 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

Có nhiều phương pháp phòng trừ bệnh bạc lá Các biện pháp này bao gồm việc sử dụng các giống chống bệnh, dự tính, dự báo kịp thời và sử dụng các biện pháp nông học, hoá học hợp lý Tuy nhiên, cho ñến nay vẫn chưa có một biện pháp ñơn lẻ nào tỏ ra có hiệu quả hữu hiệu với bệnh Xuất phát từ cơ

sở về ñặc ñiểm sinh học của vi khuẩn gây bệnh người ta ñã ñề ra những biện pháp phòng trừ tổng hợp tỏ ra có ý nghĩa hơn Trong ñó, sử dụng các giống lúa chống chịu bệnh ñể gieo trồng là biện pháp chủ ñạo trong công tác phòng trừ bệnh bạc lá

chống bệnh bạc lá: có thể sử dụng phương pháp ñột biến nhân tạo, lai hữu tính hay chuyển gen ñể tạo ra các giống chống bệnh bạc lá Khi sử dụng các tác nhân vật lý và hoá học ñể gây ñột biến nhân tạo, Nakai và Goto ñã kết luận rằng: phản ứng hạt nhân nóng có tác dụng gây ñột biến hơn tia gama ñể tạo ra giống chống bệnh bạc lá vi khuẩn [36] Phương pháp lai hữu tính ñã ñược tiến hành ñầu tiên ở Nhật Bản từ cây lúa chống bệnh ñầu tiên ñược phát hiện năm 1926 [47] Lai hữu tính là biện pháp có hiệu quả và ñược sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trong việc chọn tạo giống chống bệnh bạc lá [51] Khoảng 71,6% số cặp lai của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) ñược tiến hành ñể chống bệnh bạc lá [36] Phương pháp phả hệ là phương pháp chọn lọc ñược sử dụng phổ biến hơn phương pháp hỗn hệ [54], [52]

Sử dụng giống kháng bệnh: ñây có thể coi là biện pháp chủ ñạo trong phòng trừ bệnh bạc lá, gieo trồng các giống kháng bệnh là biện pháp kinh tế

và hiệu quả nhất, hạn chế tác hại do bệnh bạc lá ñồng thời không gây ô nhiễm môi trường [76] Ở Nhật Bản từ những năm 1926 giống chống bệnh bạc lá ñầu tiên ñã ñược xác ñịnh [51] Giống lúa chống bệnh này ñược chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh Shikiriki và ñược ñặt tên là Kono 36 Giống lúa Kono

35 ñã cung cấp gen chống chịu bệnh cho nhiều giống lúa lai ở Nhật Bản Năm

1936, Kono 35 ñã ñược lai tạo với giống Asaschi tạo ra giống lúa mới Norin

27 và ñược ñưa vào sản xuất năm 1946 Tiếp theo ñó, giống Asakaze và Hayatomo cũng ñược ñưa vào sản xuất Phân tích di truyền tính chống chịu bệnh bạc lá, người ta thấy tất cả các giống tạo ra từ năm 1930 ñến năm 1972 ñều có gen chống chịu của Kono 35

Viện Nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã ñưa ra nhiều dòng, giống kháng bệnh Các dòng, giống này ñã ñược trồng rộng rãi ở Châu Á và cung cấp thực liệu chống chịu cho các nước Các giống IR579-48, Chandina, IR532-1-176 ñược sử dụng tại Ấn ðộ, giống IR272-4-1 ñược sử dụng ở Bangladesh, IR36

và IR83 ñược sử dụng ở Philippines và các giống IR22, 1-1,

IR1561-228 ñược sử dụng ở Việt Nam [51]

Nguồn gen chống bệnh bạc lá từ các giống BJ1, Malaykit sungsong, Zenith, TKM6, Sigadish, IR20, IR22, IR26, RP5-32, RP31-49 ñã ñược khai thác ở Ấn ðộ làm bố mẹ cho nhiều cặp lai Một số giống như IR20, Ratna và Palman 579 ñược ñưa vào sản xuất ñại trà [51], [36], [74] Indonesia ñã sử dụng giống Pelita 1/1 do họ tạo ra năm 1971 và một số giống khác nhập từ IRRI làm thực liệu cho nhiều cặp lai chống bệnh bạc lá Thái Lan ñã sử dụng giống Sigadish làm nguồn gen chống bệnh cho nhiều giống lúa Malaysia cũng

ñã dùng một số giống lúa của IRRI làm bố mẹ ñể lai tạo, nhưng chưa một giống nào có khả năng chống bệnh bạc lá và có năng suất cao như mong muốn [36] Philippines và Việt Nam là 2 nước sử dụng giống chống bệnh bạc lá vi khuẩn rộng rãi nhất Trước năm 1975, khoảng 30% diện tích lúa ở miền Nam

Việt Nam ñược trồng bằng các giống chống bệnh bạc lá Philippines có tới 65% diện tích trồng lúa ñược sử dụng các giống chống bệnh bạc lá [51]

Ở Việt Nam, trong những năm 1970 – 1975 giống chống chịu bệnh bạc

lá NN22 – NN75 – 10 ñược ñưa vào thay thế các giống nhiễm bệnh ñã góp phần hạn chế tích cực bệnh này [15]

trên ñồng ruộng là vô cùng quan trọng và cần thiết ñể có kế hoạch phòng trừ

Dự tính, dự báo bệnh có thể dựa vào sự xuất hiện của bệnh trên ñồng ruộng

hoặc trên cỏ Leersia cũng như dựa vào ñiều kiện khí hậu, hay dựa vào mức ñộ tăng lên của quần thể vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae ñể biết trước

ñược sự phát triển của bệnh Ngoài ra, các nhà nghiên cứu Nhật Bản còn dựa

vào thực khuẩn thể (Bacteriophage) của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

thể sử dụng một số loại thuốc hoá học nhằm hạn chế sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá như: Sasa 20WP, Xanthomix 20WP, Kasuran 0,1 – 0,2% hoặc rắc vôi bột 60 – 80kg/ ha lúc lúa mới chớm bệnh, khi bệnh nặng hơn có thể dùng thuốc: Bactocide 12WP, Kasumin, Staner 0,2% …[6]

Theo một số nhà khoa học Nhật Bản, dùng thuốc Boocñô (Bordeaux)

và các hợp chất chứa ñồng ñể phun ñã phần nào hạn chế ñược bệnh Nhưng ñồng có ñộc với lúa nên người ta phải pha thêm ñường và giảm nồng ñộ Boocñô [36]

chống chịu thì biện pháp canh tác là biện pháp ñược người dân thực hiện phổ biến hiện nay bao gồm: bố trí mùa vụ hợp lý; vệ sinh ñồng ruộng; dọn tàn dư cây bệnh; lá bệnh; cỏ dại là ký chủ phụ; xử lý hạt giống; ñiều tiết nước hợp lý; bón phân cân ñối ðây là biện pháp dễ thực hiện chủ yếu ñể phòng ngừa chứ không có khả năng ngăn chặn khi dịch bệnh xảy ra

Kỹ thuật bón phân cũng có nhiều ảnh hưởng ñến bệnh, phân Kali có tác dụng hạn chế bệnh, ñồng thời áp dụng bón phân cân ñối NPK cũng hạn chế ñược bệnh, ñiều quan trọng là tránh bón ñạm muộn [15]

1.2.6 Nòi gây bệnh

Với sự giảm khả năng chống chịu bệnh của giống kháng Assakeze (1957) một số nhà nghiên cứu ñã bắt ñầu chú ý tới sự khác biệt về khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ñối với ký chủ Từ ñó khái niệm về nòi vi khuẩn bạc lá ñược ñề cập dựa trên khả năng gây bệnh của chúng trên các giống lúa khác nhau Với kết quả này, nhiều các nhóm nòi vi khuẩn có khả năng nhiễm bệnh trên các giống khác nhau ñã ñược ghi nhận Dựa trên một số giống có phản ứng với vi khuẩn gây bệnh: phản ứng kháng, phản ứng trung gian, phản ứng nhiễm ñược ñánh giá trên cơ sở kích thước vết bệnh nhờ lây nhiễm nhân tạo mà hai nhóm nòi (I, II) khác nhau ñã ñược ghi nhận [56] Trong khi ñó, Washio ñã chia thành 3 nhóm (A, B, C) Ngoài ra, các tác giả

cũng chia các giống dùng ñể ñánh giá các isolates vi khuẩn Xanthomonas

tự, Ezuka và Hurino (1974) [38] ñã phân 19 giống thành 3 nhóm bằng việc sử dụng 3 isolates và chia thành 3 kiểu gây bệnh dựa trên 3 giống: Tẻ tép, Kogyoku và Kinmaze

Ở Nhật Bản, ñã lập ñược một bộ 19 giống với những phản ứng khác nhau ñối với vi khuẩn gây bệnh ñể phân loại thành các nòi vi khuẩn bạc lá lúa Các nòi vi khuẩn sẽ có ñộc tính cao hơn khi lây bệnh liên tục trên các giống chống chịu, nhưng không có sự sai khác về ñộc tính khi liên tục lây bệnh trên các giống nhiễm bệnh Kết quả này chứng tỏ có sự chọn lọc về môi trường ký chủ Nghiên cứu về sự khác biệt giữa các isolates ở các vùng sinh thái khác nhau, Buddenhagen va Reddy (1972) [34] nhận thấy rằng tính ñộc của vi khuẩn

bạc lá Xanthomonas oryzae pv oryzae thay ñổi giữa các nước khác nhau,

nhưng sự khác biệt này không ñủ ñể tạo ra sự khác biệt về tính gây bệnh

Trong khi ñó, Ou và CTV (1971) [73] thấy rằng các isolates thay ñổi khả năng gây bệnh trên bộ 20 giống ở Philippines Còn ở Ấn ðộ, Devadath và Padmanabhan (1969) [37] ghi nhận có sự khác nhau về ñộc tính khi thử 9 isolates trên 20 giống Kết quả tương tự cũng ñược Rao và CTV (1971) [78] thu ñược khi thử 13 isolates Kauffman và Parrutunu (1972) [48] ñã thu thập

160 isolates từ 38 vùng trồng lúa ở Ấn ðộ và ñánh giá chúng trên 4 giống khác nhau, kết quả cho thấy cũng có sự khác biệt về ñộc tính giữa các isolates này Buddenhagen và Reddy (1972) [34] ñã nghiên cứu hơn 120 isolates ñược thu từ 11 nước ở Châu Á và ở Úc cũng thu ñược sự khác biệt giữa các isolates này Bằng việc sử dụng các giống chuẩn nòi ñể ñánh giá và phân nhóm các nòi vi khuẩn ñược thu thập ở các ñịa ñiểm khác nhau, căn cứ vào mức ñộ phản ứng của các chủng nòi này với các giống trong bộ chuẩn nòi và phản ứng lây nhiễm của các dòng giống có mang các tổ hợp gen của 2, 3 và 4 gen kháng Reddy (1990) [80] ñã phân ra 5 nhóm nòi có ñộc tính khác nhau Ngoài

ra, bằng việc sử dụng các kháng thể ñơn dòng (Monoclonal antibodies) Granamanickam và CTV (1992; 1993) [42] ñã xác ñịnh ñược 5 nhóm huyết thanh trong tổng số 70 chủng nòi gây bệnh trong ñó nhóm I có 51 chủng nòi, còn lại 19 chủng nòi tạo thành 4 nhóm huyết thanh mới Iia, Iib, V và VII Những chủng nòi này chưa ñược biết trong quần thể vi khuẩn gây bệnh ở các nước Từ những kết quả ghi nhận ñược cho thấy, các chủng này có thể không

có quan hệ về ña dạng huyết thanh

Về khả năng gây bệnh, Mew và Vera Crus (1977,1979) [64] ñã sử dụng

4 giống có mang gen kháng khác nhau: IR20 mang gen kháng Xa4,

IR1545-339 với gen kháng xa5, DV85 với gen kháng xa5 và Xa7, IR8 không mang gen kháng ñể phân nòi 83 isolates thu thập ở Philippines thành 6 nhóm nòi trên kết quả phản ứng khác nhau với các giống này [63] Khi nghiên cứu về mối quan hệ giữa các nòi Mew và CTV ñã nhận thấy rằng nòi số 1 vẫn còn nhiều nhất ở vùng lúa nước Luzon của Philippines ngay cả khi giống lúa mang gen kháng Xa4 ñược gieo trồng trên diện rộng Kết quả khi chọn ra

giống có gen Xa4, thì nòi số 2 ñã trở thành nòi chủ lực Nòi số 2 không phải xuất phát từ nòi số 1, mà từ một dòng vô tính rất phổ biến ở vùng cao của Luzon Nòi số 3 tiếp hợp với gen Xa4 và nó xuất phát từ nòi số 1, nòi số 3 cũng ñã phát triển thành khu vực ở Luzon

Bên cạnh ñó, mối quan hệ giữa ñộc tính với sinh lý và sinh hoá của bệnh cũng ñược nghiên cứu Một số nghiên cứu chỉ ra sự khác biệt về tỷ lệ huyết thanh giữa các isolates có ñộc tính mạnh và các isolates có ñộc tính yếu Trong khi ñó, một số tác giả khác lại ghi nhận không có sự tương quan giữa các loại khuẩn lạc, các ñặc tính sinh lý và ñộc tính Choi và CTV ñã phân các isolates của vi khuẩn gây bạc lá thu từ các nước ở Châu Á thành 3 Serovar: A, B-I và B-II Mew và CTV ñã sử dụng một số kỹ thuật phân loại ñể xác ñịnh

sự tương ñồng giữa 52 isolates thuộc 6 nòi vi khuẩn bạc lá Xanthomonas

các isolates của vi khuẩn bạc lá là tương ñồng về môi trường, các ñặc trưng sinh lý và sinh hoá Ngoài ra, việc sử dụng chỉ thị phân tử cũng ñã và ñang mang lại những kết quả rất tốt trong nghiên cứu vi khuẩn bạc lá Bằng việc sử dụng các trình tự lặp lại ñơn giản, ngắn bao gồm từ 2 – 10bp và 10 – 40bp (microsatellites, minsatelite) trong kỹ thuật ñánh dấu AND, 5 nhóm với mức tương ñồng 56% ñã thu ñược trong các kiểu gen khác nhau ở Ấn ðộ Rajahosale và CTV (1997) [77] ñã phân tích 67 nòi từ 18 vùng ở Ấn ðộ bằng

kỹ thuật ñánh dấu phân tử với việc sử dụng 2 mẫu dò lặp lại ñộc lập của bộ

genome Xanthomonas oryzae pv oryzae Kết quả ñã cho thấy, 12 trong số 18

vùng có thể ñược nhóm vào trong liên kết ñơn gen Cũng tương tự như vậy,

Adhikari và CTV (1995) [27] ñã phân tích 308 chủng nòi Xanthomonas

thuật RFLPs và loại ñộc tính Kết quả là có 5 nhóm nòi ñược phân ra Trong

ñó, 3 trong số 5 nhóm bao gồm các nòi từ các nước khác nhau Tuy nhiên, các nòi ở trong các nhóm này có mức ñộ ñộc tính tương tự nhau

Với việc sử dụng AND Marker ñể phân tích cấu trúc quần thể của vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa, người ta ñã tạo ra ñược phân tử AND có tính chất

lặp lại rất cao ký hiệu pJEL101 từ Xanthomonas oryzae pv oryzae [58] ðể

xác ñịnh mức ñộ ña dạng và mức ñộ gần gũi và huyết thống của quần thể

nhiều chất thăm dò (multiple probes) Kearney và Staskawicz (1990) [49] sử dụng một véc tơ (transposon trapping) có 4 phân tử chuyển nạp ñã ñược xác ñịnh lấy từ genome của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Nó ñược

ký hiệu là TNX1, TNX6, TNX7 và TNX8 Tuy nhiên, theo Nelson (1993) [70] không phải tất cả các chất thăm dò ñều có khả năng cho biết mức ñộ biến

dị di truyền của nòi vi khuẩn Bên cạnh các chất thăm dò có tính chuyển nạp, một gen không ñộc tính ñược sử dụng như một chất thăm dò cho phân tích RELP của cùng một loại isolates Gen không ñộc tính là gen xác ñịnh sự chuyên tính của một giống lúa ñối với nòi vi khuẩn ký sinh Gen avrXa1-10 ñược Hopkin và CTV (1992) [44] phân lập từ Xanthomonas oryzae pv

giống với ñiện di của những chất thăm dò khác ðiều này khẳng ñịnh mối quan hệ về huyết thống giữa những isolates của những nòi này

Sự phân bố theo không gian của nguồn bệnh và sự biến dị AND của vi

khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae ñược ñánh giá trên 1000 isolates thu

thập ở miền Bắc và miền Trung Philippines Kết quả cho thấy, mức ñộ biến dị

di truyền rất cao Trên cơ sở phân tích enzym với PstI, 46 dạng ñơn bội PstI

ñã ñược tìm thấy Sử dụng chất thăm dò TNX1, người ta tìm thấy 14 dạng ñơn bội có từ 3 dòng vô tính Phân tích theo nhóm thứ tự về biến dị di truyền cho thấy, 6 trong 10 ñịa ñiểm thể hiện sự phân hoá Mức ñộ cao về sự phân hoá có tính di truyền giữa những ñịa ñiểm và hoạt ñộng gen cho thấy sự phân hoá có tính chất vùng ñịa lý giữa các quần thể ký sinh gây bệnh giữa các vùng sinh thái khác nhau là ñáng lưu ý Sự phân hoá có tính chất ñịa lý có thể là do

sự chọn lọc giống lúa hoặc do mức ñộ thấp của sự di truyền nguồn bệnh [70]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu bước ñầu về thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ñã ñược Tạ Minh Sơn (1987) [10] nghiên cứu cho thấy: vi khuẩn bạc lá có 4 nhóm nòi phổ biến nhất Nhóm I tập trung ở các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ Nhóm II tập trung ở các tỉnh ñồng bằng Nam Bộ Nhóm III và

IV có rải rác trong cả nước So với thành phần nòi ở Nhật Bản thì nòi tìm thấy

ở Việt Nam khác hẳn Một số nhóm nòi ở Philippines và Indonesia ñều tìm thấy ở Việt Nam Nhóm II ở Việt Nam tương tự nhóm IV ở Philippines, nhóm

IV ở Việt Nam tương tự nhóm I ở Philippines hay nhóm B ở Indonesia Như vậy, thành phần nhóm nòi ở Việt Nam ña dạng và phức tạp hơn ở các nước

Theo Lê Lương Tề (1998) [12] ở miền Bắc Việt Nam có ít nhất 4 nòi khác nhau phân bố theo cơ cấu giống lúa ở các vùng

Tác giả Nguyễn Văn Viết và CTV (1999) [23] kết luận: ở ñồng bằng

sông Hồng có 7 nhóm nòi sinh lý của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa với 90 nguồn vi khuẩn thu thập từ các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam Nguyễn Văn Viết và CTV (2001, 2002) [22], [24] ñã xác ñịnh ñược 7 nhóm nòi sinh lý khác nhau của vi khuẩn

II xuất hiện phổ biến nhất ở các ñịa phương thu thập mẫu

Bằng phương pháp nuôi cấy ñơn tế bào kết hợp với kỹ thuật PCR ñể

nhận diện loài vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, Phan Hữu Tôn,

(2004) [17] ñã phân lập 154 isolates và xác ñịnh chúng thuộc 10 chủng vi khuẩn khác nhau, ñánh số từ 1 ñến 10, trong ñó chủng 2 bao gồm 3 chủng phụ

là 3A, 3A’ và 3B; chủng 5 gồm 5A và 5B và chủng 7 gồm 7 và 7’ Dựa vào ñặc ñiểm hình thái của khuẩn lạc trên môi trường nhân tạo và phân tích bằng

kỹ thuật PCR Nguyễn Văn Viết và CTV (2008) [25] ñã xác ñịnh ñược 60

isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trong số 69 mẫu bệnh bạc lá

lúa thu thập từ một số vùng trồng lúa Phân tích 47 isolates vi khuẩn

Nam ñã xác ñịnh ñược 13 nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

ðối với phản ứng của 30 isolates vi khuẩn trên bộ giống lúa chỉ thị nòi

vi khuẩn bạc lá lúa thấy rằng khả năng gây bệnh của chúng trên bộ giống lúa chỉ thị rất khác nhau Các isolates thu cùng một tỉnh có khả năng gây bệnh khác nhau Trái lại có các isolates thu ở các tỉnh khác nhau lại gây bệnh tương

tự như nhau trên các giống lúa chỉ thị [23]

Bên cạnh ñó, khi nghiên cứu về thành phần nhóm nòi vi khuẩn bạc lá ở vùng ñồng bằng sông Hồng, Lưu Văn Quyết (1999) [9] ñã xác ñịnh có 7 nhóm nòi dựa trên phản ứng của các isolates ñược thu thập với bộ giống chuẩn nòi quốc tế bao gồm nhóm I ñến nhóm VII Trong 7 nhóm nòi trên, nhóm I lây nhiễm với các giống DV85, Zenith, BJ1, Nigeria và IR20 Nhóm

II gây nhiễm với các giống Kuntlan, IR1545, Chugoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm III gây nhiễm với các giống IR1545, Chugoku, Kogyoku, IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46

và Kinmaze Nhóm IV gây nhiễm ñược cho các giống Kogyoku, IR346, IR8,

Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm V gây nhiễm trên các giống IR346, IR8, Tẻ Tép, Cas209, IR24, Milyang46 và Kinmaze Nhóm VI nhiễm trên các giống Chugoku, IR24, Milyang46 và Kinmaze Ngoài ra, dựa trên cơ sở phản ứng của các isolates ñược thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau ñối với các dòng ñẳng gen có nền gen chung là IR24 có chứa các gen kháng là Xa1 Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ (2003) [18] ñã phân 64 isolates thành 10 chủng khác nhau: kiểu 1, kiểu 2A, kiểu 2A’, 3B, 3A’, 3B, 4, 5A, 5B, 6, 7, 8 và 10 Các tác giả cũng phân tích và cho biết kiểu 2(A’, A và B) phổ biến tại hầu hết các vùng trồng lúa với 73,8%, các chủng còn lại tuỳ vùng sinh thái mà tồn tại hoặc không

Trong số các nhóm chủng vi khuẩn gây bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam các tác giả ñều khẳng ñịnh: chủng II và III rất phổ biến và tồn tại ở hầu hết các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam [17], [5], [25] Mặt khác, các

nhóm chủng thường xuất hiện ñan xen, một ñịa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng lại có thể hiện diện ở nhiều ñịa phương [17], [25]

Như vậy, có thể thấy rằng các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

ở miền Bắc Việt Nam tăng dần theo thời gian Trước những năm 1990 [10] chỉ

có 4 chủng, nhưng ñến nay Nguyễn Văn Viết và CTV (2008) ñã xác ñịnh ñược

13 nhóm chủng sinh lý của vi khuẩn gây bạc lá lúa hiện diện ở các vùng trồng lúa miền Bắc Việt Nam ðiều này cho thấy sự nguy hiểm ngày càng tăng của vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ñối với các vùng trồng lúa ở Việt Nam

1.2.7 Cơ chế kháng bệnh và gen kháng bệnh

* Cơ chế kháng

+ Cơ sở sinh hoá và hình thái: phân tích các ñặc trưng hình thái của các giống kháng, giống trung gian và giống nhiễm, Kiryu và Mizuta (1955) [55] nhận thấy các giống có bản lá hẹp, ngắn, ñứng lá thường có phản ứng kháng Môi trường dinh dưỡng trong cây ký chủ cũng là một yếu tố rất quan trọng trong việc xác ñịnh tính kháng và nhiễm Vi khuẩn xâm nhập vào trong cây nhanh chóng nhân lên ở các giống nhiễm Nhưng ở các giống kháng bị trì hoãn và không hình thành vết bệnh hoặc chỉ có những vết bệnh rất nhỏ xuất hiện Với các giống nhiễm vi khuẩn sẽ nhân lên theo cấp số nhân, ñồng thời xuất hiện triệu chứng rất rõ ràng trên lá với vết bệnh to [67] Fang và CTV (1963) [39] nhận thấy rằng các giống nhiễm có hàm lượng amino acid tự do cao hơn, hàm lượng polyphenols thấp hơn và ñường thì giảm xuống Hàm lượng cao của polyphenols và ñường ñược ghi nhận là không thích hợp ñối với

sự phát triển của bệnh Những phân tích của IRRI ở Philippines cho thấy rằng, hàm lượng ñường giảm ñi ở mức cao ñối với ñạm tổng số ở các giống nhiễm

Sự tạo ra phytoalexin, chất kìm hãm sự nhân lên của vi khuẩn cũng ñã ñược xác ñịnh ở trong các giống kháng, nhưng không xác ñịnh ñược ở các giống nhiễm Ngoài ra, Misawa và Miyzaki (1972) [66] ghi nhận rằng có sự thay ñổi

về hàm lượng các hợp chất carbohydrates, nitrogenous và photpho trong lá

bệnh Purushoothaman (1974) [75] thấy rằng, ở các giống kháng có sự tăng quá trình tổng hợp Phenyls hơn các giống nhiễm Ngoài ra, còn có sự liên kết cao giữa sự hoạt hoá của các phynylalanine Khi nghiên cứu về tính kháng ñạt ñược Nakanishi và Watanabe (1977) [69] ñã nhận thấy rằng, nếu không có sự tương hợp giữa ký sinh và ký chủ thì lây nhiễm vi khuẩn vào ký chủ, ký chủ sẽ sản sinh ra các hợp chất chống lại vi khuẩn Các tác giả ñã xác ñịnh ñược các hợp chất kìm hãm chỉ trong 24h trong các giống kháng Trong khi ñó phải 5 ngày sau khi lây nhiễm những chất này mới ñược xác ñịnh ở các giống nhiễm khi vết bệnh ñã ñược thể hiện rõ ràng

Reimers và Leach (1991) [83] nghiên cứu và cũng nhận thấy, trong phản ứng không tương hợp giữa vi khuẩn gây bệnh và cây lúa chất kìm hàm sự phát triển của vi khuẩn (Bacteriostatis) tương quan với sự tích luỹ ban ñầu của các hợp chất huỳnh quang màu xanh vàng sáng và phản ứng tự chết của tế bào ký chủ Bên cạnh ñó, trong quá trình của phản ứng không tương hợp, các hợp chất cao phân tử như lignin cũng ñược hình thành rất nhanh ở các giống kháng Trong khi ñó, các hợp chất cao phân tử này không ñược sinh ra ở phản ứng tương hợp ñối với các giống nhiễm Sự tạo ra các chất kìm hàm sự phát triển của vi khuẩn và các hợp chất cao phân tử như lignin có tương quan với sự tăng lên khả năng hoạt ñộng của các hoạt chất peroxidase trong phản ứng không tương hợp [82] Hoạt chất peroxidase ñược hình thành trong bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp các enzime của lignin Bởi vì, vi khuẩn

tiếp vào tế bào ký chủ, do vậy hợp chất cao phân tử như lignin như là một rào cản vật lý ñể ngăn chặn sự lan rộng của vi khuẩn trong ký chủ Ngoài ra, sự hoạt ñộng của hoạt chất peroxidase, các hợp chất phenolic…ñược hình thành trong quá trình sinh tổng hợp lignin cũng ñóng một vai trò quan trọng trong quá

trình chống lại sự xâm nhập cũng như sự nhân lên của vi khuẩn Xanthomonas

+ Cơ sở phân tử: trong phản ứng với bệnh, cây ký chủ biểu hiện mức ñộ khác nhau ñối với sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh Phản ứng của cây lúa ñối với vi khuẩn bạc lá cũng tương tự như ký chủ ñối với nấm bệnh gây

ra Mức ñộ phản ứng thay ñổi theo mức ñộ kháng của ký chủ Hầu hết các ghi

nhận về tính kháng của các giống lúa ñối với vi khuẩn bạc lá Xanthomonas

tính kháng ngang

- Tính kháng dọc: nhiều giống cây trồng có khả năng kháng với một số nòi gây bệnh, trong khi ñó lại tỏ ra mẫn cảm ñối với nòi khác Tính kháng này phân biệt rõ ràng của các nòi của tác nhân gây bệnh Tính kháng này còn ñược coi là tính kháng mạnh hay tính kháng chính, tính kháng ñặc trưng, tính kháng chất lượng, tính kháng phân biệt Tính kháng dọc luôn ñược kiểm soát bởi một gen hay còn gọi là kháng ñơn gen hay vi gen Các gen này ñược gọi

là gen R, kiểm soát các bước chính trong quá trình nhận biết tác nhân gây bệnh từ cây chủ, do ñó nó ñóng vai trò chính trong sự biểu hiện tính kháng Trong tính kháng dọc này tác nhân gây bệnh và cây chủ thường là không tương hợp

- Tính kháng ngang: mức ñộ kháng không giống nhau ñối với mỗi chủng kháng của tác nhân gây bệnh, ñược gọi là tính kháng không ñặc trưng, tính kháng chung, tính kháng số lượng, tính kháng cây trưởng thành, tính kháng ngoài ñồng, tính kháng bền vững Tính kháng ngang ñược kiểm soát bởi nhiều gen nên còn ñược gọi là tính kháng ña gen Tính kháng ngang của một giống cây trồng này ñối với tất cả các nòi của một tác nhân gây bệnh có thể ít hoặc nhiều hơn tính kháng ngang của một giống cây trồng khác ñối với cùng một tác nhân gây bệnh ñó Nhưng sự khác nhau này thường là rất nhỏ không ñủ ñể phân biệt hàng loạt giữa các giống cây trồng nên còn gọi là tính kháng không phân biệt

Những phân tích về di truyền cơ sở của tính kháng bệnh ñã cho phép xác ñịnh các gen ñiều khiển tác nhân gây bệnh ở trên cả cây ký chủ và ký sinh

gây bệnh [40] Tương tác ñặc hiệu về nòi gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh bạc

lá lúa cũng tuân theo quy tắc gen ñối gen (gene for gene) mà ở ñây tương tác không tương hợp là kết quả của chức năng mã hoá các gen không mang ñộc tính (avirulence) và gen kháng của ký chủ [50] Trong những tương tác về gen ñối gen ñã ñược miêu tả một số cặp hại thực vật [60] Từ những nghiên cứu

về tương tác giữa một vài bệnh và ký chủ tương ứng của nó ñã chỉ ra rằng tính kháng bệnh của thực vật ñược biểu hiện bằng gen kháng ñơn lẻ (R) của ký chủ và gen không mang ñộc tính (arv) tương ứng của ký sinh Các gen kháng bệnh thực vật cho phép ký chủ ghi nhận tác nhân gây bệnh bằng việc tạo ra những phân tử ñặc hiệu Quá trình tạo ra các phân tử ñược ñiều khiển bằng gen không mang ñộc tính của ký sinh Các sự kiện ghi nhận ñặc hiệu ñược tương hợp bởi cặp gen kháng và gen không mang ñộc tính ñược tạo ra trong

sự cảm ứng của phản ứng bảo vệ của ký chủ và kết quả cuối cùng tạo ra tính kháng kiểu hình [57]

Hopkin và CTV (1992) [44] ñã xác ñịnh ñược 3 dòng vô tính riêng biệt

của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, mỗi dòng có mang gen không

ñộc tính (arv xa5, arv Xa7 và arv Xa10) ñiều khiển sự tương ứng của các gen xa5, Xa7 và Xa10 trên các giống lúa Hơn nữa, những dòng vô tính này là thành viên của một gia ñình bao gồm nhiều gen và ñộ tương ñồng cao với gen

arv Bs3, một gen của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv vasicatoria ñặc

hiệu với tính kháng bệnh trên các giống cà chua mang gen kháng Bs3 [31]

Với Xanthomonas oryzae pv oryzae gen arv Xa7 và arv Xa10 chứa ñựng 15

và 25 ñoạn lặp lại và việc loại bỏ những ñoạn lặp lại này tạo ra phản ứng tương hợp hoặc thay ñổi chủng ñặc hiệu

ñối với các nòi hoặc nhóm nòi của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

ñã ñược xác ñịnh trong ñó 10 gen chủ yếu ñã ñược lập bản ñồ gen bằng sử dụng RFLP, RADP và chuỗi lặp lại ñơn giản SSR [62], [85] Trong các gen

kháng ñược phát hiện, có một số gen trội ñiển hình kháng với Xanthomonas

Gen Xa1: ñây là gen kháng ñược phát hiện kháng với nòi I ở Nhật Bản [86] bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử (RFLP) và lập bản ñồ của nhiễm sắc thể số

4 Năm 1998, Yoshimura và CTV ñã phát hiện vị trí nhân bản của dòng

340-kb YAC (Y5212) mang gen Xa1 và ñã thấy gen Xa1 mã hoá nucleotite liên kết với một loại protein ở vị trí lặp lại nhiều leucine

Gen Xa21: là gen có phổ kháng rộng ñược chuyển từ một loài lúa dại

lại [53] Ronald và CTV (1992) [84] ñã ñánh dấu gen Xa21 với marker RAPD

248 Sau ñó, chỉ thị phân tử RFLP (RG 103) ñược tìm thấy liên kết chặt với gen tại khoảng cách 1.2cM Dựa trên những marker này, một chỉ thị phân tử PCR-based STS pTA248 ñã ñược phát triển bằng việc sử dụng hiệu quả trong chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) [84] Năm 1997 Ronald ñã nhân bản thành công gen kháng bệnh Xa21 trên cây lúa bằng việc thích ứng phương pháp nhân bản dựa trên cơ sở bản ñồ (Map-based cloning)

Ngoài ra trong tổng số 24 gen kháng bạc lá ñã ñược phát hiện có 6 gen lặn trong tự nhiên Trong ñó, có 2 gen xa5 và xa13 là các gen lặn kháng với

Gen xa5: ñây là gen kháng lặn ñược ñánh dấu với chỉ thị phân tử RFLP (RG 556 và RZ 390) và chỉ thị tiểu vệ tinh (microsatellite) RM 122 và RM

390 Gen ñược lập bản ñồ trên nhiễm sắc thể số 5 dựa trên số liệu phân ly của

207 cá thể F2 của 2 quần thể IR24 x IRBB5 và Chinsurah Boro II x IR64 [30] Chỉ thị phân tử RFLP (RG 556) ñã ñược sử dụng ñể phát triển chỉ thị PCR-based STS cho việc sử dụng trong phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử [45] Chỉ thị STS ñược phát hiện tạo ra nền băng ñơn hình trên sự nhân bản của PCR giữa những cây kháng và cây nhiễm Vì vậy, sản phẩm PCR ñược cắt bằng một enzime cắt hạn chế ñể tạo sự ña hình ñặc hiệu SAP (specific amplicon polymorphism) Sanchez và CTV (2000) [87] ñã thành

công trong việc nhân dòng vùng mang gen xa5 trên nhiễm sắc thể số 5 Họ ñã xác ñịnh 2 nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosome) nhân dòng 9E8 và 28N22 có mang gen xa5

Gen xa13: ñây là gen lặn kháng với nòi số 6 của Xanthomonas oryzae

pv oryzae ở Philippines Gen ñược ñánh giá với chỉ thị RAPD (OPAC05

900) và chỉ thị RFLP (RG 136) và ñược lập bản ñồ trên nhiễm sắc thể số 8 bằng việc sử dụng bản ñồ của quẩn thể ñơn bội IR64 và Azucena Chỉ thị RFLP (RG 136) ñược sử dụng ñể phát triển chỉ thị PCR-based STS Các mồi STS ñược sử dụng giống như mồi STS sử dụng ñối với gen xa5 ñã không tạo

ra ña hình trên sự nhân bội PCR Do vậy, sản phẩm PCR ñược cắt bởi enzime hạn chế HinfI ñể tạo SAP.4 chỉ thị AND RG136, R2027, S14003 và G1149 vô tính nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn chứa vị trí gen xa13 từ một thư viện BAC [88] Bản ñồ di truyền ñã chỉ ra rằng vị trí của gen xa13 hiện diện kề với chỉ thị R2027 và dòng vô tính 96-kb chỉ thị 21H14

Bảng 1.1 Danh sách các gen kháng trên các giống lúa kháng với

các nòi vi khuẩn khác nhau

Ezuka và CTV (1975), Ogawa và CTV (1986) Xa4 IR20, IR22,

IR1529-680-3

Chủng I ở Philippines

Petpist và CTV, Sidhu và CTV (1978)

xa5 IR1545-248, BJ-1,

IR291-7, DV85

Chủng Nhật Bản Petpisit và CTV (1977),

Sidhu và CTV (1978), Singh và CTV (1983), Blair và McCouch (1997) Xa6 Malaget sunsong,

IR994-102,

Chủng I ở Philippines

Sidhu và CTV (1978)

Xa8 PI1231129 Chủng Philippines Sidhu và CTV (1978,

1979) Xa9 Sateng Chủng Philippines Singh và CTV (1983) Xa10 Cas209 Chủng Philippines

và chủng Nhật Bản

Yoshimura và CTV (1983)

Xa11 IR8, RP9-3 Chủng Nhật Bản Ogawa và

Yamamoto (1986) Xa12 Kogyoku và Java

14

Chủng Nhật Bản

và chủng Indonesia

Ogawa và CTV (1978)

xa13 Long grain Chủng Philippines Zhang và CTV (1996) Xa14 TN(1) Chủng Nhật Bản Taura và CTV (1989) Xa15 M41 Chủng Nhật Bản Noda (1989)

Xa16 Tẻ tép và IR24 Chủng Nhật Bản Noda (1989)

Xa17 Asominori Chủng Nhật Bản Ogawa và CTV (1089) Xa18 Toyonishiki Chủng Burmese Ogawa và

Yamamoto (1986) Xa19 XM5 Chủng Nhật Bản Taura và CTV (1991) Xa20 XM6 Chủng Nhật Bản Taura và CTV (1992) Xa21 Oryzae

longistaminata

Chủng Nhật Bản

và chủng Philippines

Khush và CTV (1990)

Xa22 Zhachanglong Chủng Trung

Quốc

Lin và CTV (1996)

Xa23 Oryzae nivara Chủng Ấn ðộ Kumar (1999)

Xa24 DV85, DV86,

Aus295

Chủng VI Philippines

Lee và CTV (2001)

Năm 1999, Nguyễn Văn Viết và CTV ñã tiến hành thu thập 40 isolates

vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae ở 8 tỉnh thuộc ñồng bằng sông Hồng

Sau khi bảo quản, phân lập và thử ñộc tính ñã xác ñịnh ñược 30 isolates có ñộc tính cao ñưa vào thí nghiệm Sau lây bệnh nhân tạo, thấy mức ñộ phát triển của các isolates vi khuẩn trên các giống chỉ thị rất khác nhau: về phản ứng của các giống chỉ thị thấy rằng toàn bộ 30 isolates vi khuẩn gây bệnh ñược cho 4 giống chỉ thị là DV85, Zenith, BJ1 và Nigeria Các giống này mang gen kháng xa5 ñi kèm với Xa7; xa5 ñi kèm với xa13; Xa16 Như vậy, các giống lúa có mang gen chống chịu trên vẫn có khả năng kháng với các isolates vi khuẩn ở 8 tỉnh thu mẫu thuộc ñồng bằng sông Hồng Trái lại, 3 giống IR24; Milyang46 và Kinmaze lại nhiễm với toàn bộ 30 isolates vi khuẩn Như vậy, các giống này không mang gen kháng với các nguồn vi khuẩn trên [23]

Kết quả lây nhiễm 47 nguồn vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

gây bệnh bạc lá lúa trên các giống chỉ thị mang gen kháng bạc lá cho thấy giống IR1545 (mang gen kháng xa5) và giống DV85 (mang gen kháng Xa7)

có phản ứng kháng với nhiều nguồn vi khuẩn nhất Kết quả thử phản ứng trên các dòng ñẳng gen mang gen kháng bạc lá (NIL – Nearly Isogenic Lines) cũng trùng với nhận xét trên Các dòng ñẳng gen IRBB4 (mang gen kháng Xa4), IRBB7 (mang gen Xa7), IRBB21 (mang gen Xa21), IRBB5 (mang gen xa5) kháng với hầu hết các nguồn vi khuẩn ñã thu thập Các giống TN1 (mang gen kháng Xa14), BJ1 (mang gen xa13) bị nhiễm với hầu hết các nguồn vi khuẩn [24]

Tương tự, giả tác Phan Hữu Tôn (2004) khẳng ñịnh: dòng chỉ thị IRBB5 (mang gen xa5), IRBB7 (mang gen Xa7), và IRBB21 (mang gen Xa21) kháng với hầu hết các nguồn vi khuẩn ñã thu thập Trong khi ñó, các dòng chỉ thị

IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB10, IRBB11 và IRBB14 mang gen kháng lần lượt

là Xa1, Xa2, Xa3, Xa10, Xa11 và Xa14) lại bị nhiễm bởi hầu hết các chủng [17] ðiều này giải thích tại sao nhiều giống lúa có nguồn gốc Trung Quốc mang gen kháng Xa14 mặc dù kháng với các nòi bạc lá ở Trung Quốc nhưng lại bị nhiễm bệnh nặng ở Việt Nam [24]

Kết quả phân tích gen bạc lá lúa bằng phân tích PCR trên 43 giống lúa

cổ truyền và cải tiến ở Việt Nam ñã xác ñịnh ñược một số mẫu giống lúa mang gen kháng Trong số 43 giống có 11 giống mang gen Xa4, 01 giống mang gen xa5, 01 giống mang gen Xa7 ðây là nguồn vật liệu quan trọng phục vụ công tác chọn tạo giống chống chịu bệnh bạc lá, ñặc biệt là chọn tạo nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và chuyển nạp gen [24] Tương tự, tác giả Phan Hữu Tôn (2004) dùng phương pháp PCR phát hiện gen kháng hữu hiệu xa5

và Xa7 có ñộ chính xác cao, kết quả lây nhiễm nhân tạo phù hợp với kết quả phát hiện gen bằng PCR, không có hiện tượng tái tổ hợp xảy ra [17]

- Khả năng chống chịu bệnh bạc lá của một số giống lúa phổ biến và của nguồn gen di truyền cây lúa

Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong số 19 giống lúa ñang trồng phổ biến ngoài sản xuất ñều có phản ứng với bệnh ở mức ñộ từ nhiễm ñến nhiễm nặng Trong số các giống lúa thí nghiệm thì nhóm lúa lai bị nhiễm bệnh nặng nhất Các giống lúa thuần có nguồn gốc từ Trung Quốc ñều nhiễm bạc lá Các giống lúa ñịa phương có khả năng kháng bệnh bạc lá rất ña dạng như: lúa tám,

dự, khẩu, dâu, nếp…ngoài ra, một số giống lúa nhập nội từ IRRI cũng có khả năng kháng bệnh bạc lá [3], [22] Tác giả Phan Hữu Tôn (2004) cũng kết luận: các giống lúa ñịa phương Việt Nam chứa nguồn gen chống bệnh hữu hiệu rất phong phú [17] Nghiên cứu khả năng chống chịu bệnh kiểu hình của các nguồn gen lúa khác nhau trong ngân hàng gen lúa với bệnh bạc lá thấy rằng phản ứng của các mẫu giống với nguồn bệnh rất ña dạng Trong số 1.159 mẫu giống nghiên cứu có 226 mẫu giống có khả năng kháng với bệnh bạc lá

lúa đây là nguồn thực liệu quý và ựa dạng có thể sử dụng ựể chọn tạo giống lúa theo hướng chống chịu [3], [22], [23], [5]

1.2.8 Chọn tạo giống chống chịu bệnh bạc lá

trừ bệnh bạc lá là sử dụng giống chống chịu Việc phát hiện ra 24 gen kháng

với nòi hoặc nhóm nòi Xanthomonas oryzae pv oryzae tạo ra một khả năng

mới trong việc tiến hành tạo ra những giống lúa hiện ựại mang gen kháng đã

có nhiều giống lúa mang gen kháng ựã ựược tạo ra bằng phương pháp lai thuần Khush và cộng tác viên (1989) [53] ựã phát hiện gen kháng Xa4 bằng phương pháp lai trở lại cổ truyền và kết quả là phát triển ựược nhiều giống kháng góp vai trò quan trọng trong công tác phòng trừ bệnh do vi khuẩn

dụng như một giống bố mẹ mang gen kháng bạc lá và ựã ựược phát triển thành nhiều giống kháng như: ABT32, Govind, UR20, IR36, Kajat, Radha, Ramakrishna Kiểu gen của Sigadis ựã ựược sử dụng ựể phát triển các giống Ratnagiri và 69-1 BJI cũng ựược sử dụng như giống bố mẹ chứa gen kháng với vi khuẩn bạc lá và các giống PR4114 và IET8558 ựã ựược phát triển

Tuy nhiên, với việc sử dụng một thời gian dài trên diện tắch rộng các giống mang gen kháng Xa4 ựã làm phát sinh những nòi vi khuẩn mới có khả năng nhiễm các giống mang gen kháng Xa4 ở một vài nước đông Nam Á để khắc phục vấn ựề này, việc lựa chọn các giống lúa mang nhiều gen kháng bằng phương pháp lai hồi quy (Pyramid) ựã ựược tiến hành Phương pháp lai hồi quy này ựược ứng dụng bởi Xu (1996) ở Trung Quốc Xu và cộng tác viên

ựã tiến hành tổ hợp dòng lúa sớm Japonica G38 mang gen kháng xa5 với các giống lúa hiện hành là Xiushui11 là giống lúa mang gen kháng Xa3 kháng với

pháp lai trở lại Kết quả là tạo ra 3 dòng lúa muộn kháng với vi khuẩn

Tương tự, một số nhà khoa học ñã tổ hợp các cặp gen kháng Xa4/ xa5

và xa5/ Xa10 và tạo ra các con lai mang 2 gen kháng với khả năng kháng cao hơn so với bố mẹ

* Chọn giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Marker-Assisted

lá cho giống lúa kháng lần ñầu tiên ñược Abenes và cộng tác viên (1993) thực hiện [26] Gen kháng xa13 ñã ñược xác ñịnh qua liên kết với chỉ thị phân tử RFLP trong 3 quần thể F4 trong ñó có gen kháng xa13 ñã bị át chế bởi Xa21 nếu không sử dụng phương pháp này ñể xác ñịnh Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử ñối với Xa21 bằng việc sử dụng môi trường ñặc hiệu ñánh dấu trình tự (STS) ñối với gen Xa21 ñã ñược Reddy và ctv tiến hành năm 1997 [79] trong chương trình cải tiến giống lúa Huang và CTV (1997) [45] ñã thành công trong việc sử dụng MAS ñể hồi quy gen kháng Xa4, xa5, xa13 và Xa21 bằng chỉ thị RELP và PCR-based marker Các dòng hồi quy có phổ kháng rộng và có khả năng kháng cao so với các dòng chỉ chứa một gen kháng Việc sử dụng chỉ thị STS và MAS-based cũng ñược Sanchez và CTV (2000) [87] sử dụng ñể chuyển 3 gen kháng xa5, xa13 và Xa21 vào 3 giống mới triển vọng Họ chứng minh rằng quần thể ñẳng gen (NILs) BC3F3 chứa hơn một gen kháng với bệnh bạc lá có phổ kháng rộng

và biểu hiện khả năng kháng cao hơn so với các giống chỉ chứa ñơn gen Các nghiên cứu của họ chỉ ra rằng MAS có thể ñạt tới ñộ chính xác 95 và 96% trong việc phát hiện các cây kháng bệnh ñồng hợp tử với gen xa5 và xa13

Nghiên cứu xác ñịnh mối quan hệ về liên kết giữa 2 gen kháng trội Xa3

và Xa4, Ogawa và CTV (1986) [71] ñã sử dụng chỉ thị phân tử RELP (XNpb181 và XNpb78) ñể kiểm tra sự phân ly của quần thể F2 giữa các dòng ñẳng gen mang gen kháng Xa3 (IR-BB3, Chugoku45) và Xa4 (IRBB4) với giống nhiễm IR24 kết quả chỉ ra có sự liên kết chặt giữa 2 gen này

thể sử dụng thành công trong việc chuyển các gen kháng bệnh vào bố mẹ của lúa lai Việc dùng chỉ thị phân tử ñể chuyển các gen kháng khác nhau vào bố

mẹ của lúa lai 3 dịng cũng cĩ thể sử dụng Trong trường hợp này vấn đề khĩ khăn là chọn bố mẹ Mặc dù kỹ thuật MAS cĩ thể dễ dàng tiến hành trong dịng phục hồi hơn đối với hạt bố mẹ bao gồm cặp A/B, vấn đề kinh tế làm cho MAS trở nên được quan tâm hơn đối với hạt lai bố mẹ Ngồi ra, dịng phục hồi thường được sử dụng để tạo chỉ 1 phép lai đơn lẻ, trong khi đĩ dịng bất dục đực được sử dụng cho nhiều phép lai nhưng dịng bất dục đực rất khĩ tiến hành lai tạo Việc tạo ra các phép lai chéo đơn lẻ với một dịng B phả hệ đơn lẻ là cách đơn giản nhất trong việc chuyển một vài gen kháng, nhưng tất cả các gen kháng R phải được sử dụng trong phép hồi quy đơn lẻ ðiều này mang theo những rủi ro bao gồm việc phơi bày trước ký sinh của giống chứa gen kháng được tạo bằng phép lai hồi quy hồn tồn cả trên vùng sản xuất hạt lai và trên ruộng của nơng dân Thêm vào đĩ, tính bền vững của các gen R hồi quy khơng thể dự đốn được Do đĩ, luơn luơn mong muốn để cĩ 2 dịng B với mức hồi quy nhỏ hơn để cĩ thể lai với dịng A Kết quả dịng A sẽ bao gồm các gen R

cĩ thể lai với dịng phục hồi để phát triển con lai F1 thương phẩm

Chen và CTV (2000) [35] đã kết hợp thành cơng gen Xa21 vào trong giống Minghui63 là dịng phục hồi của cây lúa lai bằng kỹ thuật chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assited sellection) Trong nghiên cứu này, các tác giả

đã phục hồi các cây Minghui63 bằng việc sử dụng 128 chỉ thị RFLP được phân

bố trên 12 nhiễm sắc thể Gần đây, Borines và CTV (2000) [32] đã cố gắng kết hợp 3 gen kháng bạc lá Xa4, Xa7 và Xa21 vào 4 dịng duy trì (IR58025B,

IR62829B, Lion B và Bob) là những dịng nhiễm với Xanthomonas oryzae pv

phân biệt dịng duy trì chỉ mang gen kháng Xa21 và dịng duy trì mang cả 2 gen trên họ đã đánh dấu gen Xa7 với chỉ thị phân tử RFLP (G1091)

Tại Việt Nam, việc chọn tạo giống chống chịu cũng đã được tiến hành bằng cả phương pháp lai cổ truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử và đã đạt được những kết quả rất tốt Ở phía Nam, Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2003) [2] nghiên cứu bệnh bạc lá đã sử dụng phương pháp chỉ thị phân tử để xác

ựịnh ựược các giống mang gen kháng trong ựó: gen xa13 có trong các giống

Cà đung, Ba Túc, Thơm Lung, Vệ Phắch, Lúa Trắng, Nếp Hoa Vàng Giống mang gen xa5: Nàng Chi, Trắng Lùn, Giàu, Ba Ren Giống mang gen kháng Xa4: Lúa Sóc, Lúa Mùa Số 2, Trắng Quảng, Trắng Phước, Tàu Hương, Nàng Sậu Giống mang gen Xa7: Nếp Màu Lươn, giống mang gen Xa14: Trăm Bông, Nàng Tây đùm, Nàng Hương Dựa trên những kết quả thu ựược trong việc xác ựịnh các gen kháng, các tác giả ựã ứng dụng MAS (Marker Ờ Assist Sellection) vào chọn tạo giống chống chịu Bằng phương pháp lai thuần sau

ựó dùng chỉ thị phân tử ựể kiểm tra sự hiện diện của các gen kháng xa13 và xa5 của các con lai trong quần thể IR24/ Ba Ren Kết quả cho ựộ chắnh xác ựạt ựến 93,3% ựối với kiểu gen ựồng hợp tử lặn và 90% ựối với kiểu gen ựồng hợp tử trội, 98% ựối với dị hợp tử Ngoài ra, bằng việc sử dụng chỉ thị phân tử RAPD ựể xác ựịnh mối quan hệ về di truyền tập ựoàn giống lúa có tắnh kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn phổ biến ở ựồng bằng sông Hồng đinh Thị Phòng và CTV (2004) [7] ựã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên phân tắch với 36 giống lúa có tắnh kháng bệnh bạc lá thu ựược tổng số có 392 phân ựoạn nhân bản Tất cả 21 mồi RAPD ựều cho tắnh ựa hình với giá trị PIC từ 0,25 ựến 0,58

Sự sai khác về hệ số tương ựồng di truyền giữa các giống khoảng từ 22 Ờ 64%

để xác ựịnh 4 gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 trên các dòng giống khác nhau Phan Hữu Tôn và CTV (2003) [18] ựã sử dụng chỉ thị phân tử (AND marker) ựể xác ựịnh trên hàng trăm giống lúa ựịa phương trong ựó 56 giống, 36 giống và 10 giống ựược xác ựịnh là có mang gen Xa4, xa5 và Xa7 Ngoài ra, ựể xác ựịnh các gen hiệu quả, 16 dòng ựẳng gen chứa các ựơn gen và nhiều gen

kháng ựược lây nhiễm với 6 nòi vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae khác

nhau Kết quả cho thấy, các dòng có chứa các gen xa5, Xa7 và Xa21 kháng với tất cả 6 nòi ựược thu thập ở các vùng miền Bắc Việt Nam Các dòng chứa gen xa5 không có khả năng kháng khi ựược tổ hợp các giống mang gen Xa7 hoặc các giống nhiễm so sánh với các dòng chỉ mang gen xa5 Kết quả cũng thu ựược tương tự với giống mang gen Xa7 và Xa21

1.2.9 Các chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bội AND sử dụng trong

ñánh giá ña dạng di truyền nguồn gen kháng bạc lá

Phản ứng chuỗi nhờ Polymeraza (polymerase chain reaction - PCR) ñược Kary Mullis và CTV mô tả năm 1993, ñã nhanh chóng ñược sử dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới [68]

PCR là quá trình tương ñối ñơn giản cho phép nhân nhanh một số lượng không hạn chế nguyên bản một ñoạn AND nhất ñịnh trong một khoảng thời gian ngắn Quá trình nhân bản bằng enzim này gồm 3 bước lặp lại nhiều lần: (1) biến tính AND từ dạng sợi kép thành dạng sợi ñơn bằng cách nâng cao nhiệt ñộ lên 94-950C trong khoảng thời gian ngắn; (2) tiếp hợp ñoạn mồi (Primer) thông qua hạ nhiệt ñộ xuống 40 – 600C Hai ñoạn mồi là các oligonucleotide dài khoảng 18 – 23 baze tiếp hợp theo nguyên tắc bổ sung với ñoạn AND tương ñồng ở 2 ñầu của ñoạn AND cần nhân; (3) phản ứng polymerase tổng hợp phân tử AND kéo dài từ ñoạn mồi Hai phân tử AND mới ñược tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ 2 ñầu phân tử khuôn ban ñầu [1] Tuỳ theo bản chất của những ñoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị ñặc trưng như chỉ thị RFLP, RAPD, SSR, AFLP…

- Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites: vị trí ñánh dấu trình tự)

Phương pháp STS lần ñầu tiên ñược Olson M và CTV (1989) [72] áp dụng trong nghiên cứu lập bản ñồ gen người (1989) sau khi kỹ thuật PCR ra ñời

- ða hình ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế (RFLP)

Sự ña hình trong phân tích RFLP có thể ghi nhận như sự có mặt hay vắng mặt của một phân ñoạn riêng biệt trên gen Mức ñộ khác nhau giữa các kiểu gen thường ñược nhận biết khi có thay ñổi ñộ dài của các ñoạn AND hạn chế Sự thay ñổi này là do những biến ñổi nhỏ trong cấu trúc phân tử AND thông qua cách sắp xếp lại, thêm vào hay mất ñi một cặp bazơ…cho ñến khi biến ñổi lớn như ñảo ñoạn, chuyển ñoạn ñều làm ảnh hưởng ñến vị trí nhận biết của enzym hạn chế Hoàn toàn có thể xác ñịnh ñược sự khác nhau về chiều dài

của các sản phẩm này sau khi chạy điện di trên gel agarose và lai Sounthern với chỉ thị RFLP [33]

Bản đồ di truyền phân tử đầu tiên ở người đã được xây dựng bằng chỉ thị RFLP Ở lúa, các bản đồ RFLP mật độ cao chứa tới hơn 2000 chỉ thị phân

tử Tương tự, nhiều bản đồ chỉ thị RFLP hiện nay đã cĩ sẵn ở các lồi cây trồng như: khoai tây, lúa mỳ, chuối, cà chua [61], [59]

- ða hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP)

He và Prakash (1977) [43] đã sử dụng chỉ thị AFLP để nghiên cứu biến

dị di truyền ở các giống lúa lai, xác định tính đa dạng ở cây rau diếp (Lactura spp), phát hiện AND đa hình ở lạc (Arachis hypogaea L.), nghiên cứu đa dạng

di truyền đậu tương Lập bản đồ liên kết di truyền các tính trạng liên quan đế tính chống chịu hạn ở lúa [81], [28]

- ða hình các đoạn lặp lại đơn giản (SSR)

Cho đến nay, kỹ thuật này đang được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực di truyền phân tử của nhiều đối tượng khác nhau như đánh dấu gen, xác định giống, chẩn đốn bệnh di truyền

- ða hình các đoạn AND được nhân ngẫu nhiên (RAPD)

Một kỹ thuật mới được phát triển dựa trên nguyên tắc hoạt động của PCR và gọi là AND đa hình được nhân ngẫu nhiên (RAPD) Kỹ thuật RAPD

là kỹ thuật dựa trên PCR với 1 mồi đơn với trình tự ngẫu nhiên gồm 10 base, các mồi này thường cĩ hơn 60% G+C để đạt được liên kết với mẫu đủ mạnh

Sự nhân AND chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở hai điểm cĩ sự định hướng ngược nhau trong khoảng 2000 base dọc theo NST [81]

Trong những năm gần đây, phân tích RAPD đã trở thành phương pháp phổ biến để đánh giá tính trạng di truyền và phân loại ở các lồi thực vật, đánh dấu các đặc điểm quan trọng, xác định nguồn gốc [29]

RAPD được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác định quan hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng ở nhiều lồi cây như lúa, hoa hồng, bơng…[65], [14], [13]