Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh diệt vi khuẩn xanthomanas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số: 60420114 Đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa Học viên: Từ Thị Bẩy Lớp: CHST _ K15 Hƣớng dẫn: TS Đào Thị Hồng Vân Hà Nội, 2013 i http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Hồng Vân - Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Kỹ sư Đặng Văn Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận án Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln bên tơi, động viên,góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả ii http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Lời cam đoan Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng Tác giả iii năm 2013 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 XẠ KHUẨN 1.1.1 Sự phân bố ý nghĩa xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Vị trí xạ khuẩn sinh giới 1.2 ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 1.2.3 Sự sinh trƣởng phát triển 1.2.4 Sự hình thành bào tử 1.2.5 Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11 1.3 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP 13 1.3.1 Phân lập chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13 1.3.2 Phân loại định tên xạ khuẩn 13 1.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH 18 1.4.1 Phƣơng pháp hấp phụ 18 1.4.2 Một số chất hấp phụ 19 1.4.3 Một số chất nhả hấp phụ 21 1.5 BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA 22 1.5.1 Thiệt hại bệnh bạc gây lúa 22 1.5.2 Biểu bệnh bạc lúa 23 1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa 24 iv http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 1.5.4 Cơ chế gây bệnh 24 1.5.5 Sử dụng xạ khuẩn phòng trừ bệnh bạc lúa 25 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 VẬT LIỆU 26 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.1.4 Môi trƣờng 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Bảo quản giống 27 2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học 28 2.2.3 Xác định sinh khối 29 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh 29 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện lên men 30 2.3 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH CÓ TRONG DỊCH LÊN MEN 31 2.3.1 Đánh giá khả hấp phụ chất kháng sinh chất hấp phụ 31 2.3.2 Xác định nồng độ chất hấp phụ 31 2.3.3 Thử dung môi nhả hấp phụ chất kháng sinh 31 2.3.4 Xác định pH thời gian nhả hấp phụ 31 2.3.5 Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung môi 32 2.3.6 Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 32 2.4 ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 32 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH 33 3.1.1 Phân lập chủng xạ khuẩn 33 3.1.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 34 3.1.3 Khả đối kháng môi trƣờng dịch thể 37 v http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN TB 5.4 38 3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 38 3.2.2 Đặc điểm hình thái bào tử 41 3.2.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 42 3.3.NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces oligocarbophilus TB5.4 47 3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng nhân giống môi trƣờng lên men 47 3.3.2.Ảnh hƣởng nguồn cacbon thay 48 3.3.3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 49 3.3.4 Ảnh hƣởng thời gian nhân giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 50 3.3.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ tiếp giống đến sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 50 3.3.6 Ảnh hƣởng độ thông khí đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 51 3.3.7.Ảnh hƣởng thời gian đến trình sinh tổng hợp kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 52 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN CỦA CHỦNG S oligocarbophilus TB5.4 53 3.4.1 Đánh giá khả kháng sinh chất hấp phụ 53 3.4.2 Xác định nồng độ than hoạt tính 54 3.4.3 Nghiên cứu nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính 55 3.4.4 Xác định pH thời gian nhả hấp phụ tốt 56 3.4.5 Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung môi sử dụng cho trình nhả hấp phụ chất kháng sinh 57 3.4.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố đến tính chất hố lý chất kháng sinh từ chủng S oligocarbophilus TB5.4 58 vi http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 3.5 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH SAU LÊN MEN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN S oligocarbophilus TB5.4 ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA THÓC 60 3.5.1.Ảnh hƣởng dịch kháng sinh thô đến khả nầy mầm hạt 60 3.5.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch sau lên men đến trình nảy mầm hạt 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 65 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 65 vii http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT KTKS Khuẩn ty khí sinh KTCC Khuẩn ty chất RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn sóng (Rectus-Flexibilis) RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu (Retinaculum aperturm) DNA Deoxyribonucleic acide RNA Ribonucleic acide CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử MT Môi trƣờng viii http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biểu lúa bị bị nhiễm bệnh bạc Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae Hình 3.1 Vịng đối kháng chủng vi khuẩn X oryzae 020 đƣợc tạo chủng xạ khuẩn phƣơng pháp cục thạch Hình 3.2 Hoạt tính kháng chủng lại chủng vi khuẩn X oryzae 020 từ dịch sau lên men chủng xạ khuẩn phƣơng pháp đục lỗ thạch Hình 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng TB5.4 mơi trƣờng ISP4 sau ngày nuôi nhiệt độ 28 C Hình 3.4 Hình dạng chuỗi bề mặt bào tử chủng TB5.4 (x 15.000) Hình 3.5 Ảnh hƣởng thời gian đến trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4 Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian đến trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4 Hình 3.7 Nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính với dung mơi Hình 3.8 Định tính chất kháng sinh tách chiết hệ số Rf có dịch sau lên men chủng S.oligocarbophilus TB5.4 sắc ký giấy Hình 3.9 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch ngâm ủ đến khả nảy mầm hạt ix http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Sự phân bố theo nhóm màu xạ khuẩn Bảng 3.2 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn Bảng 3.3 Khả đối kháng dịch sau lên men chủng xạ khuẩn với chủng vi sinh vật kiểm định đối Bảng 3.4 Đặc điểm nuôi cấy chủng TB5.4 sau 14 ngày nuôi cấy nhiệt độ 28 C Bảng 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc chủng TB5.4 số môi trƣờng Bảng 3.6 Khả sinh enzym ngoại bào chủng TB5.4 Bảng 3.7 Khả đồng hoá đƣờng chủng TB5.4 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến sinh trƣởng chủng TB5.4 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng TB5.4 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng TB5.4 Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn TB5.4 với chủng chuẩn Streptomyces oligocarbophilus Bảng 3.12 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 số MT lên men Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới hoạt tính kháng sinh chủng S.oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nguồn nitơ tới hoạt tính kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng thời gian nhân giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 Bảng 3.17 Ảnh hƣởng độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 x http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Hình 3.5 Ảnh hƣởng thời gian đến trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4 Kết trình bày hình 3.5 cho thấy pH dịch lên men giảm dần sau 48 lên men sau lại tăng trở lại kết thúc trình lên men Nguyên nhân tƣợng giai đoạn đầu trình lên men, xạ khuẩn phát triển có sử dụng nguồn dinh dƣỡng mơi trƣờng q trình có phân cắt tạo a xit làm pH môi trƣơng giảm xuống Tuy nhiên, sau xạ khuẩn phát triển tạo sản phẩm thứ cấp có pH kiềm nên làm cho pH môi trƣờng tăng lên Nhƣ vậy, MT điều kiện ni tối ƣu tạo thành sinh khối tích lũy chất kháng sinh chủng xạ khuẩn tăng lên so với ban đầu (đƣờng kính vịng vơ khuẩn đạt 18,0 mm; sinh khối đạt 6,0 mg/ml) Thời điểm thu hồi tốt 120 giờ, thời điểm lƣợng kháng sinh đạt đƣợc cao tƣơng ứng với vịng vơ khuẩn 20 mm Sau thời điểm oxy MT nhanh chóng tăng trở lại xạ khuẩn chuyển sang pha suy vong, nhu cầu oxy cho sinh trƣởng nhƣ tạo sản phẩm khơng cịn 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN CỦA CHỦNG S oligocarbophilus TB5.4 3.4.1 Đánh giá khả kháng sinh chất hấp phụ Chúng tiến hành thử khả hấp phụ chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 số chất hấp phụ thƣờng 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu đƣợc sử dụng tách chiết kháng sinh nhƣ than hoạt tính, cationnit, diatomit Dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 đƣợc ly tâm loại bỏ sinh khối đƣợc bổ sung chất hấp phụ với tỷ lệ (%) lắc tốc độ 150 vòng/phút nhiệt độ phòng thời gian 30 phút Kết xác định hoạt tính kháng sinh lại dịch lên men sau loại bỏ chất hấp phụ đƣợc trình bày bảng 3.18 Bảng 3.18 Khả hấp phụ chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 số chất hấp phụ pH khác Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) pH Than Wofatit Cationit Anionit Diatomit hoạt tính KPS 18,5 18,7 18,5 18,5 18,2 18,2 18,0 18,1 18,0 18,1 17,9 18,0 18,0 10 15,5 15,1 15,4 15,5 Dịch kháng sinh thô không điều chỉnh pH Kết thí nghiệm đƣợc trình bày bảng 3.18 cho thấy, chất hấp phụ thử nghiệm Wofatit KPS, Cationit, Anionit, Diatomit có khả hấp phụ kém, kháng sinh dịch lên men gần nhƣ nguyên pH 3, không điều chỉnh pH dịch sau lên men Trong đó, có than hoạt tính chất hấp phụ tốt nhất, tất pH3, 7, 10 than hoạt tính hấp phụ hồn tồn chất kháng sinh Do vậy, than hoạt tính đƣợc chọn làm chất hấp phụ để tiến hành thí nghiệm 3.4.2 Xác định nồng độ than hoạt tính Dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 môi trƣờng thích hợp, sau loại sinh khối bổ sung than hoạt tính với nồng độ khác nhau, lắc 150 vòng/phút 30 phút nhiệt độ phòng Sau lọc để loại bỏ than, dịch lọc đƣợc xác định hoạt tính kháng sinh cịn lại Kết đƣợc trình bày bảng 3.19 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng nồng độ than tới khả hấp phụ kháng sinh dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 Nồng độ than hoạt tính Hoạt tính kháng sinh (g/100ml dịch kháng sinh thô ) (ĐKVVK , mm) 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 18,5 14,0 10,6 4,0 10 Nhƣ kết thể bảng 3.19 cho thấy, tăng nồng độ than hoạt tính khả hấp phụ tăng nồng độ 4g/100ml dịch sau lên men đủ để hấp phụ hết lƣợng kháng sinh có dịch Cịn lƣợng than hoạt tính sử dụng ảnh hƣởng tới trình hấp phụ, lƣợng kháng sinh cịn lại dịch nhiều, sử dụng > 5g/100ml gây lãng phí Do lƣợng than hoạt tính thích hợp 4g/100ml dịch sau lên men 3.4.3 Nghiên cứu nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính Các chất kháng sinh có độ phân cực lớn khơng thể chiết đƣợc dung môi hữu cơ, ngƣợc lại chất kháng sinh phân cực chiết đƣợc dung môi hữu nhƣng phải dùng số lƣợng lớn dung môi, nên giá thành sản phẩm cao Do thí nghiệm này, sử dụng hệ dung môi khác nhằm mục đích nhả hấp phụ chất sau hấp phụ lên bề mặt than với tỷ lệ dung môi hữu cơ: nƣớc (1,5:1) Lƣợng hỗn hợp dung môi bổ sung 100ml/4g than hoạt tính, sau lắc 150 vịng/phút nhiệt độ phịng khoảng 30 phút kết thử hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khoanh giấy lọc đƣợc thể hiên bảng 3.20 Bảng 3.20 Khả nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính dung mơi khác Các dung mơi Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) n-butanol 5,5 2-butanol 10,2 Aceton 15,5 Ethylacetat 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Butylacetat Isopropanol 15,3 Kết thể bảng 3.20 cho thấy dung môi thử nghiệm n-butanol, Isopropyl acohol, 2-butanol aceton isopropanol có khả nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính, aceton isopropanol cho khả nhả hấp phụ lớn tƣơng đƣơng Tuy nhiên aceton có khả bay nhanh nên thí nghiệm sau ta chọn aceton làm dung môi nhả hấp phụ Hình 3.6 Nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính với dung mơi khác 3.4.4 Xác định pH thời gian nhả hấp phụ tốt Than hoạt tính sau hấp phụ chất kháng sinh có dịch sau lên men đƣợc thu nhận lại, làm khơ sau đƣợc bổ sung theo tỷ lệ 4% vào hỗn hợp chất nhả hấp phụ gồm aceton: nƣớc tỷ lệ 1,5:1, trƣớc bổ sung hỗn hợp dung mơi đƣợc điều chỉnh có giá trị pH khác axit HCl 0,1N bazơ NaOH 0,1N, sau lắc 150 vịng/phút nhiệt độ phịng khoảng thời gian Kết thử hoạt tính kháng sinh có dịch nhả hấp phụ đƣợc thử phƣơng pháp khoanh giấy lọc đƣợc trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Ảnh hƣởng pH thời gian đến trình nhả hấp phụ chất kháng sinh có than hoạt tính pH Hoạt tính kháng sinh (ĐKVKK , mm) theo thời gian (phút) Dịch kháng sinh thô 10 20 30 40 60 90 18,5 8,3 11,3 13,7 9,0 8,0 5,5 18,5 8,9 14,9 15,5 7,5 6,4 8,5 10 18,5 5,5 10,5 13,5 5,5 4,9 4,2 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Kết trình bày bảng 3.21 cho thấy, pH 3, 7, 10 với thời gian nhả hấp phụ nhƣng hiệu suất không cao Ở pH thời gian 30 phút có khả nhả hấp phụ tốt nhất, kéo dài thời gian khả nhả hấp phụ khơng khơng tăng lên mà cịn có tƣợng giảm có tƣợng hấp phụ ngƣợc trở lại Điều đƣợc giải thích kéo dài thời gian nhả hấp phụ liên kết dung môi chất kháng sinh không bền nên lƣợng kháng sinh cao liên kết yếu xảy tƣợng hấp phụ ngƣợc trở lại với than hoạt tính Do vậy, thời gian tối ƣu cho trình nhả hấp phụ 30 phút pH 7,0 3.4.5 Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung môi sử dụng cho trình nhả hấp phụ chất kháng sinh Quá trình nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính chịu ảnh hƣởng mạnh tỷ lệ dung mơi: nƣớc liên quan mật thiết đến cấu tạo, tính chất phân cực chất kháng sinh Đã đánh giá ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi: nƣớc cách thay đổi tỷ lệ dung môi : nƣớc cho tổng thể tích hỗn hợp khơng đổi, sau lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng thời gian 30, thử hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khoanh giấy lọc kết cho bảng 3.22 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng tỷ lệ dung mơi:nƣớc lên q trình nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính Tỷ lệ dung mơi : nƣớc Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) 3,0 : 13,0 2,0 : 15,3 1,5 : 15,5 1,0 : 8,5 0,5 : 3,0 Dịch ban đầu 18,5 Kết thể bảng 3.22 cho thấy, với tỷ lệ dung môi: nƣớc (1,5:1) cho hiệu nhả hấp phụ tốt với hoạt tính kháng sinh thu đƣợc cao (ĐKVVK 15,5), với tỷ lệ thể tích dịch bổ sung 100 ml/4g than hoạt tính đảm bảo khả nhả hấp phụ phần lớn chất kháng sinh có than hoạt tính 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 3.4.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố đến tính chất hố lý chất kháng sinh từ chủng S oligocarbophilus TB5.4 3.4.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến đặc tính chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 Kháng sinh chủng S olig ocarbophilus TB5.4 sinh tiết vào MT lên men Để tách chiết chất kháng sinh khỏi dịch lên men phải qua nhiều cơng đoạn có sử dụng dung mơi chất hấp phụ điều kiện có thay đổi nhiệt độ Khả bền nhiệt CKS có ảnh hƣởng đến trình tách chiết bảo quản sau Do cần nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính chất kháng sinh có dịch lên men Kết đƣợc thể bảng 3.23 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng sinh Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 10 20 40 60 Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) 40 18,5 18,3 18,3 18,2 18,1 60 18,5 17,5 17,3 15,4 15,5 80 18,3 16,5 15,5 12,3 7,9 100 18,7 14,7 10,4 8,5 5,3 Số liệu bảng 3.23 cho thấy, chất kháng sinh có dịch có dịch sau lên men chủng xạ khuẩn S olig ocarbophilus TB5.4 bền với nhiệt: nhiệt độ 40oC sau hoạt tính gần nhƣ khơng thay đổi, 60oC hoạt tính có giảm, cịn nhiệt độ 80 – 100oC hoạt tính giảm theo thới gian, sau hoạt tính thấp Nhƣ vậy, để thu chất kháng sinh nên nhiệt độ ≤ 40oC 3.4.6.2 Ảnh hƣởng pH đến đặc tính chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 Để tách chiết chất kháng sinh khỏi dịch lên men tinh phải qua nhiều cơng đoạn có sử dụng dung mơi chất hấp phụ điều kiện có thay đổi nhiệt độ pH Sự thay đổi pH dung mơi tách chiết ảnh hƣởng khơng nhỏ đến hoạt tính chất kháng sinh, dẫn tới ảnh hƣởng đến hiệu 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu suất trình tách chiết bảo quản sau Do cần nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến hoạt tính chất kháng sinh có dịch lên men Kết đƣợc thể bảng 3.24 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kháng sinh theo thời gian Thời gian (giờ) pH Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) Dịch sau lên men 18,5 18,3 18,3 18,2 18,1 18,5 18,5 18,3 18,0 18,0 18,3 18,5 18,4 18,3 18,1 10 18,7 17,7 17,3 17,0 15,3 không điều chỉnh pH Kết bảng 3.24 cho thấy, chất kháng sinh có dịch lên men bền với pH Khi điều chỉnh dịch lên men pH khác nhau, sau nâng nhiệt độ lên 40oC theo dõi ảnh hƣởng thay đổi theo thời gian, hoạt tính không thay đổi nhiều ĐKVVK dao động 18,0 mm pH 3, dịch sau lên men không điều chỉnh pH Tuy nhiên pH 10 hoạt tính kháng sinh có giảm, nhiên mức độ giảm không nhiều Nhƣ vậy, kháng sinh thu hồi từ S oligocarbophilus TB5.4 bền pH, điều thuận lợi cho trình tách chiết thu hồi sản phẩm 3.4.6.3 Xác định hệ số Rf chất kháng sinh Dịch lọc chứa kháng sinh sau nhả hấp phụ khỏi than hoạt tính đƣợc đặc chân khơng nhiệt độ < 600C để loại bỏ aceton Dịch sau đặc đƣợc định tính phƣơng pháp sắc kí giấy Whatman No1 hoạt tính xác định Rf vi sinh vật kiểm định X oryze 020 Kết nhận đƣợc thể hình 3.6 Bảng 3.25 Hệ số Rf chất kháng sinh có dịch sau lên men chủng S.oligocarbophilus TB5.4 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Hệ dung môi chạy Rf n-butanol:axit acetic:nƣớc = 4:1:5 1,0 Kết hình 3.7 cho thấy, Rf chất kháng sinh thô nhận đƣợc từ dịch lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 1, điều cho thấy với hệ dung mơi (Butanol: axetic:nƣớc ( 2:1:1) có lực tốt với chất kháng sinh, hệ dung mơi đƣợc sử dụng phục vụ cho bƣớc tinh cao nhằm xác định cấu trúc hợp chất kháng sinh Hình 3.7 Định tính chất kháng sinh tách chiết hệ số Rf có dịch sau lên men chủng S.oligocarbophilus TB5.4 sắc ký giấy (Trong từ trái qua phải: Giấy tẩm dung môi (Đối chứng); Giấy tẩm dịch chiết sau trình tich sơ bộ) 3.5 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH SAU LÊN MEN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN S oligocarbophilus TB5.4 ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA THÓC 3.5.1.Ảnh hƣởng dịch kháng sinh thô đến khả nầy mầm hạt Một chủng vi sinh vật muốn đƣợc ứng dụng nơng nghiệp ngồi việc phải có hoạt tính mạnh chống tác nhân gây bệnh, đồng thời phải đáp ứng u cầu an tồn sinh thái nhƣ khơng làm thay đổi tiêu cực đặc tính đất trồng, khơng sản sinh sản phẩm trao đổi chất có tính độc với trồng, khơng ảnh hƣởng đến phát triển Trong khuôn khổ đề tài với thời gian hạn hẹp, đánh giá tác động dịch lên men sau loại bỏ sinh khối hỗn hợp dịch có chứa sinh khối đến nảy mầm lúa Kết thí nghiệm ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4 đến khả nảy mầm hạt thóc đƣợc trình bày bảng 3.26 Bảng 3.26 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt thóc Nồng độ thí Số lƣợng hạt thóc mầm xử lý nghiệm (%) dịch sau lên sau thời gian ngày 60 Đối chứng http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu (hạt) A B C 100 15 18 34 50 25 28 34 10 35 37 38 43 42 38 48 50 40 0,1 50 50 40 45 – 47 A: Dịch sau lên men loại sinh khối S oligocarbophilus TB5.4; B: Dịch nuôi cấy bao gồm sinh khối chủng S oligocarbophilus TB5.4; C: Dịch nuôi cấy chủng X oryzae 020 Kết cho thấy, đối chứng sử dụng nƣớc hạt có khả nảy mầm tốt (45 – 47 hạt nẩy mầm/50 hạt) Với thí nghiệm nhiễm hạt với vi khuẩn gây bệnh bạc X oryzae 020 cho thấy ảnh hƣởng lớn đến khả nảy mầm hạt, cao sử dụng hạt ngâm 100% dịch nuôi chủng X oryzae 020 số lƣợng hạt cịn 34/50 hạt thí nghiệm Điều chứng tỏ vi khuẩn X oryzae 020 có ảnh hƣởng đến khả nảy mầm hạt Đối với thí nghiệm sử dụng dịch ngâm dịch sau lên men chủng xạ khuẩn S oligocarbophilus TB5.4, tƣợng ức chế trình nảy mầm hạt xảy sử dụng nồng độ dung dịch 10, 50 100 % Tuy nhiên, nồng độ thấp 0,1, 5% hai loại dịch cho thấy có kích thích nảy mầm hạt, số lƣợng hạt nảy mầm cao Điều chứng tỏ chất kháng sinh chủng S oligocarbophilus TB5.4 có khả ức chế nảy mầm hạt nồng độ cao nhƣng lại kích thích nảy mầm nồng độ thấp 3.5.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch sau lên men với vi khuẩn kiểm định đến trình nảy mầm hạt Đánh giá tác động tỷ lệ dịch lên men sau loại bỏ sinh khối S oligocarbophilus TB5.4 : dịch nuôi cấy chủng X oryzae 020 đến khả nảy mầm hạt thóc nhằm tìm tỷ lệ phối hợp tốt Kết đƣợc trình bày bảng 3.27 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu Bảng 3.27 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch nuôi cấy S oligocarbophilus TB5.4: X oryzae 020 (v/v) đến khả nảy mầm hạt thóc Tỷ lệ S oligocarbophilus Số lƣợng hạt thóc nảy mầm TB5.4: X oryzae 020 (v/v) sau thời gian ngày (hạt) Tỷ lệ (%) 50:50 34 68 25:75 36 72 10:90 36 72 5:95 46 92 2:98 49 98 1:99 50 100 Đối chứng (nƣớc) 45 90 Hình 3.8 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch ngâm ủ đến khả nảy mầm hạt Tỷ lệ S oligocarbophilus TB5.4: X oryzae 020 (1:99, v/v); Tỷ lệ S oligocarbophilus TB5.4: X oryzae 020 (50:50, v/v); 3: Tỷ lệ S oligocarbophilus TB5.4: X oryzae 020 (2:98, v/v) 4: Đối chứng nƣớc Kết cho thấy, đối chứng sử dụng nƣớc ngâm hạt, số lƣợng hạt có khả nảy mầm tốt đạt 45/50 hạt Ở thí nghiệm có mặt đồng thời hai chủng vi sinh vật bao gồm vi khuẩn gây bệnh bạc X oryzae 020 chủng xạ khuẩn chủng S oligocarbophilus TB5.4 có tác động định đến trình nảy mầm hạt thóc Với nồng độ sử dụng 1; % dịch sau lên men chủng S oligocarbophilus TB5.4 có mặt dịch sinh khối chủng vi khuẩn X oryzae 020 nồng độ từ 95% kích thích nảy mầm hạt thóc cao đối chứng.Trong đó, tỷ lệ S oligocarbophilus TB5.4: X oryzae 020 : 99 (tức 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 99% X oryzae 020) cho tỷ lệ nẩy mầm cao (100%) 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu KẾT LUẬN Từ mẫu đất thu thập Nam Định Thái Bình, phân lập đƣợc 56 chủng xạ khuẩn Từ đó, tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn TB5.4 có khả kháng vi sinh vật kiểm định mạnh Nghiên cứu đặc tính lý hóa, hình thái, hình dạng chuỗi bào tử, chủng TB5.4 đƣợc đặt tên Streptomyces oligocarbophilus TB5.4 Điều kiện thích hợp để lên men chủng Streptomyces oligocarbophilus TB5.4 sinh tổng hợp chất kháng sinh: - Môi trƣờng lên men môi trƣờng 79 với nguồn cac bon thay saccaroza nguồn ni tơ pepton - Thời gian nhân giống: 38 – 48 - Thể tích: 75 ml mơi trƣờng bình tam giác 500 ml - pH: ban đầu - - Nhiệt độ: 28 0C - Tốc độ lắc 180 vòng/ phút - Tỷ lệ tiếp giống: 6% Chất hấp phụ kháng sinh tốt than hoạt tính, nồng độ g/100 ml Nhả hấp phụ tốt hệ dung môi n butanol: nƣớc (1,5:1) điều kiện pH = thờ gian 30 phút S oligocarbophilus TB5.4 kích thích nẩy mầm hạt thóc Ở tỷ lệ S oligocarbophilus TB5.4 : : X oryzae 020 : 99 tỷ lệ nảy mầm hạt thóc 100% (đối chứng 90%) KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu mức độ ảnh hƣởng dịch sau lên men đến khả phát triển khả ức chế bệnh bạc lúa điều kiện nhà lƣới 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Phan Thị Ngọc Bích (1998), “Tách phức vàng xyanua phương pháp hấp phụ than hoạt tính sọ dừa Việt Nam”, Luận án tiến sỹ hoá học Nguyễn Lân Dũng, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Đỗ Văn Đài, Nguyễn Bin, Phạm Xuân Toản, Đỗ Ngọc Cử, Đinh văn Huỳnh (2000), ”Cơ sở trình thiết bị cơng nghệ hố học”, tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lò Văn Huynh, (2002), “Nghiên cứu sử dụng than hoạt tính để loại bỏ số chất hữu môi trường nước”, Luận án Phó tiến sỹ khoa học ngành hố Lê Gia Hy (1994), “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam”, Luận án Phó tiến sỹ sinh học Nguyễn Hữu Phú (2003), “Hoá lý hoá keo”, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Thanh, Dƣơng Văn Tuệ, Vũ Đào Thắng, Hồ Cơng Xinh (1999), “Hố học hữu cơ”, NXB Khoa học Kỹ thuật Lƣơng Đức Phẩm (1998), ”Công nghệ vi sinh vật”, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội TIẾNG ANH 10 A Ismail (2006), “Numerical Assessment of Mycelium Color in Classification of Some Streptomyces Isolates”, Int J Agricult Biology, 872-875 11 Allister JL, JR Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes J Bacteriol American Society Microbiology 89(1), 159-169 12 Austin B (1989),A review: Novel pharmaceutical compounds from marine bacteria J Apply Bacteria 67, 461-470 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 13 Becker B, MP Lechevalier, HA Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyces”, J Appl Microbiol 13, 236-243 14 Bergey’s Mannual of determinative bacteriology (1986), 2, 605-703 15 CR Kokare, KR Mahadik, SS Kadam, BA Chopade (2004), Isolation, characterization and antimicrbial activity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the West coast of India Current Science 86(4), 593-597 16 Demain AL (1974), How antibiotic- producing microorganisms avoid suicide? Annuals NewYork Academy Sciences 235, 601-612 17 Demain A.L (1981), Industrial Microbiology Sciences 214, 987- 995 18 Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Strepmyces project”, Inter J Syst Bac 3, 139-148 19 Egorov NX (Nguyễn Lân Dũng) (1976), Thực tập vi sinh vật học NXB THCN, Hà Nội 20 Fenical W (1997), New pharmaceuticals from marine organisms Trends Biotechnol 15, 339-341 21 Grund E, RM Kroppenstedt (1990), Chemotaxonomy and numerical taxonomy of the genus Nocardiopsis Meyer 1976 Inter J System Bact 40(1), 5-11 22 Hideo N (1974), Key for Classification and identification of 458 spieces of the Streptomyces included in ISP J Ferment Technol 52(2), 78-92 23 Hopwood DA, MJ Merrick (1977), Genetics of antibiotic production Bacteriol Rev 41, 596-636 24 Hostaslek Z, M Blumauero, Z.Vanrk (1979), Tetracycline Antibiotics In Economic Microbiology, Secondary products of Metabolism Academic Press, London – NewYork San Fracisco 3, 294 -343 25 Kamerura M, Moris K (1999), Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae Bioscience Biotechnol Biochem 63(6), 969-972 26 Kampfer P, RM Kroppenstedt (1991), Probasilitic identification of Streptomyces using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137, 1893-1902 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu 27 Kampfer P, RM Kroppenstedt W Dott (1991), A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137,1831-1891 28 Kenneth L Conn, Edlira L, Giora K, George L (1998), A Quantitative Method for Determining Soil Populations of Streptomyces and Differentiating Potential Potato Scab–Inducing Strains Plant Disease 82(6), 631-638 29 Kothe HW, G Vohis, RM Kroppenstedt, A Henssen (1989), A taxonomic study of Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces System Appl Microbiol 12, 61-69 30 Marderosian AD (1969), Marine pharmaceutical J Pharm Scien 58,1-30 31 Michael J, J Pelczar, ECS Chan, R Noel (1993), Antibiotics and other chemotherapeutic agents in microbiology concepts and application McGraw Hill Inc 32 Molinski TF (1993), Developments in marine natural products, Receptor specific bioactive compounds J Nat Prod 56,1-8 33 Nurettin S, Aysel U (2003), Investigation of the Antimicrobial Activity of Some Streptomyces Isolates Turk J Biol 27, 79-84 34 Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes Appl Microbiol 13(1), 43-61 35 Vanek Z, J Cudlin, M.Blumauerova, Z Hosálek (1971), How many genes are required for the synthesis of Chlortetracyline Folia Microbiol 16, 225-240.59 36 Waksman SA (1961), The Actinomycetes, Classification, idetification and description of the genera and species Williams & Wilkins Co Baltimore 37 Witt D, E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces System Appl Microbiol 13, 361- 371 38 Witt D, Liesack W, E Stackebbandt (1989), Identification of Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes Advances microbial ecology Tokyo, Japan Scientific Press 67 ... tài: ? ?Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa? ??, bao gồm nội dung sau: Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn. .. 21 1.5 BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA 22 1.5.1 Thiệt hại bệnh bạc gây lúa 22 1.5.2 Biểu bệnh bạc lúa 23 1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa 24 iv http://www.lrc-tnu.edu.vn/... đƣờng vi? ??n màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng (hình 1.1) Hình 1.1 Biểu lúa bị bị nhiễm bệnh bạc 1.5.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa Vi khuẩn gây bệnh bạc Xanthomonas oryzae