Tiến hành nuôi cấy 3 chủng vi khuẩn lactic: chủng Lactobacillus acidophilus
được lưu giữ tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ,
chủngND2 và chủng SC4 trên môi trường MRS trong tủ ấm ở nhiệt độ 340C. Sau 2 ngày nuôi, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng này dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả thể hiện ở các hình 3.1, 3.2, 3.3,..., 3.8.
Hình 3.1. Hình ảnh về khuẩn lạc của Lactobacillus acidophillus nuôi trên môi
Hình 3.2. Hình ảnh về Lactobacillus acidophillus khi nhuộm tiêu bản tươi
Hình 3.3. Hình ảnh về khuẩn lạc của chủng ND2 trên môi trường MRS
Hình 3.5. Hình ảnh về chủng ND2 khi nhuộm tiêu bản tươi
Hình 3.6. Hình ảnh về khuẩn lạc của chủng SC4 trên môi trường MRS
Hình 3.8. Hình ảnh về chủng SC4 khi nhuộm tiêu bản tươi
Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở các hình 3.1, 3.2, 3.3,..., 3.8 cho thấy:
- Khuẩn lạc của dòng thuần Lactobacillus acidophilus nhỏ, đồng đều, hình tròn, đường kính từ 0,5-1mm, bề mặt khuẩn lạc bóng, màu trắng sữa (hình 3.1). Sau khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần nhận thấy chủng Lactobacilluss acidophilus là vi khuẩn Gram dương (G+), không có bào tử, tế
bào hình que, sắp xếp đơn và đồng đều (hình 3.2).
- Khuẩn lạc chủng ND2 có hình dạng tròn, đường kính 2,5-3,0mm, đục, bề
mặt khuẩn lạc trắng ngà, trơn bóng, màu trắng sữa (hình 3.5). Sau khi nhuộm Gram
và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần nhận thấy chủng ND2 là vi khuẩn Gram dương (G+), không có khả năng sinh bào tử, không thể di động, tế bào hình que, kết đôi, kết chuỗi ngắn (hình 3.3 và 3.4). So sánh với khuẩn lạc của chủng
Lactobacillus acidophilus ở trên và dựa theo phân lọai của Bergey có thể khẳng
định đây chính là chủng vi khuẩn lactic. Chúng tôi tạm gọi tên chủng này là
Lactobacillus sp1.
- Khuẩn lạc chủng SC4 có dạng hình tròn, bề mặt màu trắng sữa, trơn bóng, đục (hình 3.6). Sau khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 1000 lần nhận thấy chủng SC4 là vi khuẩn Gram dương (G+), không có khả năng sinh bào tử, không có khả năng di động, tế bào hình que ngắn hoặc dài, tế
bào mảnh, đôi khi hơi cong, đứng riêng lẻ, kết đôi hay chuỗi ngắn (hình 3.7 và 3.8). So sánh với khuẩn lạc của chủng Lactobacillus acidophilusở trên và dựa theo phân lọai của Bergey có thể khẳng định đây chính là chủng vi khuẩn lactic. Chúng tôi tạm gọi tên chủng này là Lactobacillus sp2.
Như vậy sau khi phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa và sữa chua chúng tôi tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn lactic, trong đó có hai chủng có họat tính latic
cao được chúng tôi lựa chọn để dùng cho quá trình nghiên cứu theo và chúng tôi tạm gọi là Lactobacillus sp1 và Lactobacillus sp2.
3.1.3. Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính amylase và protease
Tiến hành phân lập, tách và thuần khiết các chủng Bacillus từ đất mùn trên
môi trường NP, ở nhiệt độ 300C, trong thời gian 48h. Sau đó dựa vào hình thái của chủng vi khuẩn này theo hệ thống phân lọai vi khuẩn của Bergeychúng tôi lựa chọn
được 5 chủng, ký hiệu từ D1, D2,…, D5 có hình dạng điển hình của vi khuẩn
Bacillus. Sau đó sử dụng 5 chủng này để tiến hành nghiên cứu các đặc tính của nó.
Để đánh giá hoạt tính protease và amylase của 5 chủng được lựa chọn, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng này trên môi trường đặc hiệu: môi trường PB (môi trường TB có bổ sung casein) và môi trường AB (môi trường TB có bổ sung tinh bột) để cấy các chủng vi khuẩn thu được theo phương pháp chấm điểm trên đĩa petri. Kết quả đo vòng phân giải tinh bột và vòng phân giải casein được thể hiện qua bảng 3.2.
Nhận xét
Kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy tất cả các chủng đem phân tích đều có vòng phân giải tinh bột và casein sau 48h, nhưng mức độ phân giải tinh bột và casein của các chủng đã phân lập cũng khác nhau. Kết quả này chứng tỏ các chủng
đã phân lập đều có hoạt tính amylase và protease. Tuy thế 3 chủng D1, D3, D5 có
đường kính vòng phân giải tinh bột và protein sau 48h là cao nhất. Điều này cũng
có nghĩa là 3 chủng này có hoạt tính amylase và protease cao nhất trong những chủng phân lập được.
Bảng 3.2. Họat tính sinh protease, amylase và đường kính vòng phân giải của 5 chủng Bacillus phân lập được
Đường kính vòng phân giải (mm) STT Chủng Hoạt tính amylase Hoạt tính protease Amylase Protease 1 D1 ++ + 17 10 2 D2 + - 5 8 3 D3 +++ ++ 23 26 4 D4 + ++ 8 14 5 D5 ++ ++ 14 18 Ghi chú: +++: hoạt tính mạnh ++ : hoạt tính trung bình. + : hoạt tính yếu. - : không có hoạt tính
Kết quả phân tích ở trên cũng cho thấy mặc dù cả 3 chủng D3, D4, D5 đều có hoạt tính protease trung bình nhưng đường kính vòng phân giải casein của 3 chủng là khác nhau. Trong đó chủng D3 có đường kính vòng phân giải casein lớn hơn cả.
Tương tự dù có cùng hoạt tính amylase nhưng đường kính vòng phân giải tinh bột của 3 chủng là khác nhau. Trong đó chủng D3 lại có đường kính vòng phân giải tinh bột lớn hơn cả.
Do vậy chúng tôi quyết định chọn chủng D3 là chủng có hoạt tính amylase và protease cao nhất để tiến hành tiếp tục nghiên cứu làm thuần khiết và quan sát hình thái tế bào cũng như nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để đưa vào sản xuất chế
3.1.4. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus phân lập và được lựa chọn
Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được lưu giữ tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và chủng D3 mới
được phân lập trên môi trường NP lỏng trong các bình tam giác 250ml trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 24h. Từ dịch nuôi cấy lấy mẫu vi khuẩn để cấy gạt
đều trên đĩa petri chứa môi trường thạch NP. Để các đĩa petri trong tủấm 300C, sau 24h quan sát hình thái khuẩn lạc. Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần được thể hiện ở các hình 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12.
Hình 3.9. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Bacillus subtilis nuôi trên môi trường NP
Hình 3.11. Hình ảnh về chủng Bacillus subtilis khi nhuộm tiêu bản cố định
Hình 3.12. Hình ảnh về chủng D3 khi nhuộm tiêu bản cố định Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở các hình trên cho thấy:
- Chủng thuần chủng Bacillus subtilis: khuẩn lạc khô, có màu trắng, khuẩn lạc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hơi lồi lõm, bám chặt vào
môi trường thạch (hình 3.9). Khi quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần thì hình ảnh của Bacillus subtilis là trực khuẩn ngắn nhỏ, nhiều khi nối lại thành sợi dài, ngắn khác nhau và có thể đứng riêng rẽ (hình 3.11).
- Chủng D3 mới phân lập được: Khuẩn lạc tròn, có màu hơi vàng nâu, mép hơi lượn sóng, ướt (hình 3.10). Khi quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần thì hình ảnh của chủng D3 này là dạng trực khuẩn ngắn, nhỏ đứng riểng rẽ, bề mặt nhẵn (hình 3.12). So sánh với khuẩn lạc của chủng
Bacilus chuẩn ở trên và dựa theo phân lọai của Bergey chúng tôi tạm gọi tên chủng này là Bacillus sp.
Như vậy sau khi phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất chúng tôi tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn Bacillus, trong đó chủng Bacillus sp có hoạt tính amylase và
protease cao được chúng tôi lựa chọn cùng với giống vi khuẩn thuần chủng
Bacillus subtilus dùng để nghiên cứu vào sản xuất chế phẩm.
3.1.5. Quan sát hình thái khuẩn lạc nhóm vi khuẩn quang dưỡng
Hai chủng vi khuẩn quang dưỡng (vi khuẩn tía và vi khuẩn quang dưỡng xanh lục) được lấy từ Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
được hoạt hóa trên môi trường EB lỏng trong các bình tam giác 250ml trong 48h. Từ
dịch nuôi cấy tiến hành cấy và gạt đều trên đĩa petri chứa môi trường thạch EB. Để các
đĩa petri ở nơi có ánh sáng chiếu vào, sau 48h quan sát hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả quan sát thể hiện ở các hình 3.13, 3.14 và 3.15.
Hình 3.13. Hình ảnh về khuẩn lạc của vi khuẩn quang hợp xanh lục và vi khuẩn tía trong ống thạch nghiêng
Hình 3.14. Hình ảnh về vi khuẩn tía khi nhuộm tiêu bản cố định
Hình 3.15. Hình ảnh về vi khuẩn xanh lục khi nhuộm tiêu bản cố định Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy: nhóm vi khuẩn quang dưỡng có hình dạng chấm tròn nhỏ đồng đều, tạo thành từng đám nhỏ hoặc lớn khác nhau. Khi nhuộm tiêu bản và soi dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần thì nhận thấy các tế
bào vi khuẩn quang dưỡng bắt màu hồng, chứng tỏ chúng là các vi khuẩn Gram âm (G-). Hình ảnh tế bào của chúng (hình 3.14 và 3.15) cho thấy chúng có dạng hình tròn
EB ở nhiệt độ 370C trên đĩa petri chỉ thấy xuất hiện khuẩn lạc của chủng vi khuẩn xanh lục mà không thấy sự hiện diện của vi khuẩn tía, trong khi đó trên môi trường thạch EB bằng trong ống nghiệm thì nhận thấy chủng vi khuẩn đỏ sinh trưởng rất mạnh trong khi chủng vi khuẩn xanh lục không thấy xuất hiện (hoặc thấy sự phát triển nhưng không có màu xanh). Điều này có thể giải thích: do tế bào của vi khuẩn xanh lục có chứa sắc tố chlorophyl nên có khả năng hấp thụ ánh sáng trắng vì vậy các khuẩn lạc có màu xanh lục. Đối với vi khuẩn đỏ do có mang sắc tố carotenoid nên chỉ hấp thụ ánh sáng đỏ vì vậy trên môi trường thạch trên đĩa petri chúng không
phát triển được [19,20,21].
3.2. MỘT SỐĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA CÁC CHỦNG ĐÃ LỰA CHỌN 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới khả năng sinh trưởng của 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới khả năng sinh trưởng của các vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các nhóm vi khuẩn, vì vây việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh
trưởng phát triển của các chủng đã lựa chọn là cần thiết. Để xác định sựảnh hưởng nhiệt độ đến các giống vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi 9 mẫu thí nghiệm nuôi
đồng thời cả 3 nhóm vi khuẩn trên các môi trường dịch thể cơ bản: môi trường MRS (vi khuẩn lactic), môi trường NP (vi khuẩn Bacillus) và môi trường EB (vi khuẩn quang dưỡng) ở các nhiệt độ khác nhau: 27 0C, 370C, 470C. Mẫu 1: Nuôi cấy vi khuẩn lactic ở 270C; Mẫu 2: Nuôi cấy vi khuẩn lactic ở 370C; Mẫu 3: Nuôi cấy vi khuẩnlactic ở 470C; Mẫu 4: Nuôi cấy vi khuẩn Bacillusở 270C; Mẫu 5: Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus ở 370C; Mẫu 6: Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus ở 470C; Mẫu 7: Nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng ở 270C; Mẫu 8: Nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng ở 370C; Mẫu 9: Nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng ở 470C. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng theo thời gian thông qua việc xác định giá trị OD620nm. Kết quả được thể
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0 6 12 24 36 48 Thời gian (h) K hả nă ng s inh t rư ở ng ( O D 620nm ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 6 12 24 36 48 Thời gian (h) K h ả n ăn g s in h t rư ở n g ( O D 6 2 0 n m ) Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0 6 12 24 36 48 Thời gian (h) K h ả n ăn g s in h t rư ở n g ( O D 6 2 0 n m ) Mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến sựsinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng
Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở các hình 3.16, 3.17, 3.18 cho thấy:
- Ở vi khuẩn lactic: trong 6 giờ đầu ở cả 3 mẫu (mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3) mật độ
tế bào tăng rất nhanh (OD620nm tăng nhanh), sau khoảng thời gian này ở mẫu 3 chỉ
số OD620nm tăng chậm và đến thời điểm 24 giờ thì hầu như không tăng nữa và bắt
đầu giảm dần. Trong khi đóở mẫu 1 và mẫu 2 mật độ tế bào vẫn tiếp tục tăng nhanh cho đến 36 giờ, tuy nhiên giá trị OD620nm thể hiện mật độ tế bào vi khuẩn ở mẫu thí nghiệm 2 tăng đều đặn hơn cả (hình 3.16), điều này thể hiện nhiệt độ nuôi 370C là thích hợp với vi khuẩn lactic hơn cả và thời gian nuôi thích hợp cho chủng vi khuẩn này là trong khoảng 24h - 48h.
- Đối với vi khuẩn Bacillus: trong 24 giờ đầu cả 3 mẫu thí nghiệm (mẫu 4, mẫu 5, mẫu 6) đều có chỉ số OD620nm tăng nhanh thể hiện tốc độ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn mạnh mẽ. Sau khoảng thời gian này nhận thấy: ở mẫu 6 giá trị
OD620nm tiếp tục tăng nhưng với tốc độ chậm, trong khi đó mẫu 4 và mẫu 5 chỉ số
cao nhất thể hiện điều kiện nuôi cấy ở mẫu thí nghiệm này có nhiều ưu điểm hơn
(hình 3.17) . Từ khoảng thời gian 36 giờ mật độ tế bào ở cả 3 mẫu đều bắt đầu giảm dần. Như vậy nhiệt độ nuôi 370C là thích hợp với vi khuẩn Bacillus và thời gian nuôi thích hợp là trong khoảng 36h - 48h.
- Đối với vi khuẩn quang dưỡng: từ hình 3.18 có thể nhận thấy sự sinh trưởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này có sự tương đồng ở cả 3 mẫu thí nghiệm (mẫu 7, mẫu 8, mẫu 9). Từ khi bắt đầu nuôi cấy đến thời gian 36 giờ cả 3 mẫu thí nghiệm có chỉ số OD620nm tăng đều thể hiện tốc độ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn mạnh mẽ. Tại thời điểm 36 giờ nhận thấy giá trị OD620nm của mẫu 8 cao hơn so với mẫu 7 và mẫu 9. Sau khoảng thời gian này, giá trị OD620nm bắt đầu giảm dần với tốc độ
chậm ở cả 3 mẫu thí nghiệm. Kết quả thể hiện điều kiện nuôi cấy ở mẫu thí nghiệm này (mẫu 8) có nhiều ưu điểm hơn. Như vậy nhiệt độ nuôi 370C cũng là nhiệt đô
thích hợp với vi khuẩn quang dưỡng và thời gian nuôi thích hợp là trong khoảng 36h – 48h.
Từ những nhận định trên cho thấy cả ba nhóm vi khuẩn: vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nhóm vi khuẩn quang dưỡng đều có nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi là ở 370C và thời gian nuôi thích hợp cho chúng là trong khoảng 36h – 48h. Do vậy có thể sử dụng khoảng nhiệt độ và thời gian trên để nuôi cấy cả ba chủng vi khuẩn này.
3.2.2. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng. khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic
Trong quá trính sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bên cạnh yếu tố nhiệt
độ thì giá trị pH của môi trường cũng rất có ý nghĩa. Mỗi vi sinh vật đều có một giá