Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây rau bép gnetum gnemon l var griffithii markgr

HCM BÁO CÁO NGHI M THU NGHIÊN C U QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY RAU BÉP (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) ThS Nguyễn Thị Điệp ThS Nguyễn Thị Hồng Tú Th nh ph h inh, h ng 01/2019 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN C U VÀ PHÁT TRI N NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN C U QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY RAU BÉP (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) Nguyễn Thị Điệp Th nh ph h Nguyễn Thị Hồng Tú inh, h ng 01/2019 TÓM TẮT Cây rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) từ lâu dùng làm rau người dân tộc thiểu số, có tiềm lớn không giá trị dinh dưỡng mà cịn dược tính Do đó, việc nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro rau bép cần thiết Trong nghiên cứu nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.), sử dụng chồi chồi nách có mầm ngủ làm vật liệu nuôi cấy ban đầu Kết ghi nhận được, môi trường tái sinh chồi thích hợp cho rau bép môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,25 mg/l kinetin Mơi trường thích hợp cho tăng sinh chồi rau bép in vitro môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA 0,2 mg/l NAA thu số chồi trung bình cao 3,27 chồi/mẫu, chồi khỏe, nhỏ có mẫu có sẹo gốc Mơi trường khống thích hợp cho tăng trưởng chồi rau bép in vitro môi trường WPM Ở nghiệm thức có 0,25 – mg/l IBA chưa ghi nhận tạo rễ Chồi sau trồng ngồi vườn ươm 30 ngày có tạo rễ Tỉ lệ sống sót chồi rau bép 52% Từ khóa: rau bép, tái sinh chồi, in vitro BM20-QT.QLKH Trang ii MỤC LỤC Trang TRANG BÌA i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii THÔNG TIN ĐỀ TÀI .1 MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu rau bép 1.1.1 Phân loại (Võ Văn Chi, 1997) .6 1.1.2 Phân bố đặc điểm hình thái 1.1.3 Công dụng 1.1.4 Giá trị dinh dưỡng rau bép 1.2 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật 1.2.1 Giới thiệu nhân giống in vitro .9 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng in vitro thực vật 10 1.2.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 10 1.2.2.2 Ảnh hưởng mẫu nuôi cấy 11 1.3 Các nghiên cứu nước 13 Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.1.1 Thời gian 17 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu thiết bị 17 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA kinetin lên phát sinh chồi rau bép .17 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tăng sinh BM20-QT.QLKH Trang iii chồi rau bép in vitro 18 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro 19 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Ảnh hưởng nồng độ BA kinetin lên phát sinh chồi rau bép 23 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tăng sinh chồi rau bép in vitro 26 3.3 Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro 29 3.4 Ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro 31 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .34 4.1 Kết luận 34 4.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 PHỤ LỤC BM20-QT.QLKH Trang iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt ANOVA Thuật ngữ tiếng Việt Analysis of variance BA Benzyladenine CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation Duncan Duncan’s multiple range test ĐC Đối chứng IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA α – naphthalene acetic acid SH Môi trường Schenk Hilderbrant TDZ 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl) TN Thí nghiệm WPM Môi trường Woody plant medium BM20-QT.QLKH Trang v DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng 2.1 Khảo sát nồng độ BA kinetin lên phát sinh chồi rau bép 2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tăng sinh chồi rau bép in vitro 2.3 Trang 15 19 Khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng tăng trưởng chồi rau bép in vitro 20 2.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro 21 3.1 Ảnh hưởng BA kinetin lên phát sinh chồi rau bép sau 60 ngày nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tăng sinh chồi rau bép in vitro sau 90 ngày nuôi cấy 3.3 27 Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro sau 60 ngày nuôi cấy 3.4 24 30 Ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro sau 30 ngày nuôi cấy BM20-QT.QLKH 32 Trang vi DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây rau bép 2.1 Mẫu chồi non rau bép 17 3.1 Mẫu vật liệu nuôi cấy ban đầu 23 3.2 Chồi rau bép tái sinh sau 60 ngày nuôi cấy môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,25 mg/l kinetin 25 3.3 Chồi rau bép sau 90 ngày nuôi cấy 29 3.4 Cây rau Bép sinh trưởng môi trường khác sau 60 ngày nuôi 3.5 cấy 31 Cây rau bép vườn ươm sau 30 ngày 35 BM20-QT.QLKH Trang vii THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) Chủ nhiệm đề tài/dự án: Chủ nhiệm đề tài 1:  Họ tên: Nguyễn Thị Điệp  Năm sinh: 1987 Giới tính: Nữ  Học vị: Thạc sĩ Chuyên ngành: Di truyền Năm đạt học vị: 2013  Chức danh khoa học: Năm phong chức danh:  Chức vụ: Phó phịng Nghiên cứu Công nghệ sinh học Thủy sản  Tên quan công tác: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao  Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM  Điện thoại quan: (028) 8862726 Fax: (028) 37990500  Địa nhà riêng:  Điện thoại nhà riêng: DTDĐ: 0909259807  E-mail: nguyenthidiep.bio@gmail.com Chủ nhiệm đề tài 2:  Họ tên: Nguyễn Thị Hồng Tú  Năm sinh: 1986  Học vị: Cử nhân Giới tính: Nữ Chuyên ngành: Cử nhân sinh học  Chức danh khoa học: Năm đạt học vị: 2010 Năm phong chức danh:  Chức vụ: Phó Xưởng Sản xuất Sinh học thực nghiệm  Tên quan công tác: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao  Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TPHCM  Điện thoại quan: (028) 8862726 Fax: (028) 37990500  Địa nhà riêng:  Điện thoại nhà riêng: - DTDĐ: 01674559583 E-mail: hongtu_121_qn@yahoo.com.vn BM20-QT.QLKH Trang Cơ quan chủ trì: - Tên quan chủ trì nội dung nghiên cứu quan chủ quản: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao – Ban Quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại: 028 38862726 - Fax: 028 37990500 - Email: nghiencuu.ahtp@tphcm.gov.vn - Website: www.chta.com.vn - Địa chỉ: Ấp 1, Xã Phạm Văn Cội, Huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh - Số tài khoản: 9527 1032617 Kho bạc Nhà nước Củ Chi Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2018 đến tháng 12/2018 Kinh phí sử dụng: 155.443.500 đồng Mục tiêu: a Mục tiêu tổng quát Đưa quy trình nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) tạo nguồn giống có chất lượng b Mục tiêu cụ thể - Xác định nồng độ BA kinetin thích hợp cho phát sinh chồi - Xác định nồng độ BA NAA thích hợp cho tăng sinh chồi rau bép in vitro - Xác định mơi trường khống thích hợp cho tăng trưởng chồi rau bép in vitro - Xác định nồng độ IBA thích hợp lên rễ rau bép in vitro Nội dung đề tài Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA kinetin lên phát sinh chồi rau bép Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA NAA lên tăng sinh chồi rau bép in vitro Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro BM20-QT.QLKH Trang 0,2 mg/l NAA thu số chồi trung bình cao 3,27 chồi/mẫu, chồi khỏe, nhỏ có mẫu có sẹo gốc Sự gia tăng nồng độ BA giúp ức chế ưu kích thích tái sinh chồi dẫn đến hình thành cụm chồi từ chồi bên Tuy nhiên, hình thành cụm chồi bên nên chiều cao chồi thấp (cao - mm/chồi) mơi trường có BA 1,5 mg/l 0,2 mg/l NAA so với chồi (cao – 11 mm) mơi trường có BA - 0,5 mg/l 0,2 mg/l NAA sau 90 ngày nuôi cấy Kết tương đồng với nghiên cứu tác giả Trần Trung Hiếu (2017) tạo cụm chồi từ chồi bên Xáo tam phân, thành lập cụm chồi nên chiều cao chồi trung bình đạt – mm môi trường BA – mg/l so với chồi (cao – 13 mm) mơi trường có BA – mg/l sau 12 tuần nuôi cấy Nhóm cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào, sinh tạo quan thực vật, cytokinin kích thích mạnh mẽ thành lập chồi non ức chế tạo rễ, kích thích chuyển hóa làm thuận lợi phần tổng hợp protein Cytokinin thể tính chất cho phép giải khó khăn việc trì sống mơ, kích thích phân chia tế bào định hướng tế bào đường đường phân chia (Dương Công Kiên, 2002) Song song với việc thực thí nghiệm này, ảnh hưởng kinetin, TDZ, zeatin, GA3, tổ hợp TDZ BA lên nhân nhanh chồi rau bép tiến hành nghiên cứu Tuy nhiên, hiệu nhân chồi chất lượng chồi thấp Số liệu không báo cáo BM20-QT.QLKH Trang 28 cm 0,5 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA cm 0,5 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA cm cm 1,5 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA mg/l BA; 0,2 mg/l NAA cm cm 1,5 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA mg/l BA; 0,5 mg/l NAA Hình 3.3 Chồi rau bép sau 90 ngày nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro Sự sinh trưởng thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Thành phần môi trường nuôi cấy yếu tố quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mô thực vật nuôi cấy mô Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật thay đổi tùy theo loài phận nuôi cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần mơi trường thay đổi (Nguyễn Đức Lượng ctv, 2006) Trong thí nghiệm này, khảo sát ảnh hưởng thành phần khống mơi trường ni cấy lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro thực Chồi có kích thước đồng khoảng cm ni cấy mơi trường có thành phần khống khác 60 ngày nuôi BM20-QT.QLKH Trang 29 cấy, thu kết tăng trưởng chồi rau bép in vitro bảng 3.3 hình 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống lên tăng trưởng chồi rau bép in vitro sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường Số Chiều cao Hình thái chồi ni cấy MS ½ MS WPM ½ WPM SH ½ SH (lá/chồi) chồi (mm) 2,1cd 11,5bc Chồi nhỏ, mảnh có màu xanh nhạt 1,8d 9,75de Chồi nhỏ, mảnh có màu xanh nhạt 4,6a 19,25a Chồi khỏe, mở to, màu xanh 3,6b 12,5b Chồi nhỏ, mảnh có màu xanh nhạt 2,2c 10,51cd Chồi nhỏ, mảnh có màu xanh nhạt 1,4e 9,15e Chồi nhỏ, mảnh có màu xanh nhạt Ftính 107,83** 86,05** CV (%) 2,1 5,28 Ghi chú: *: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05; **: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01; ns: khơng có khác biệt; a, b, c: khác biệt nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan Kết bảng 3.3 cho thấy tiêu sinh trưởng số chiều cao phụ thuộc lớn vào môi trường nuôi cấy Sau 60 ngày nuôi cấy, chồi tăng trưởng chậm mơi trường MS, ½ MS (giảm 1/2 đa lượng), ½ WPM (giảm 1/2 đa lượng), SH ½ SH (giảm 1/2 đa lượng) với chồi đạt chiều cao từ – 13 mm số từ 1,4 – 3,6 lá/chồi (hình 3.4) Sự tăng trưởng chồi đáng ý mơi trường WPM, chồi có sinh trưởng phát triển tốt với số phát triển trung bình 4,6 lá/chồi chiều cao chồi trung bình đạt 19,25 mm Cây phát triển khỏe, mở to có màu xanh nhạt Trong mơi trường WPM có nồng độ khống đa lượng thấp nhiều so với nồng độ khống đa lượng mơi trường MS SH, đặc biệt nồng độ đạm (NO3) thấp gần lần so với môi trường MS thấp BM20-QT.QLKH Trang 30 gần lần so với mơi trường SH Điều giải thích theo Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006), giai đoạn tăng trưởng nồng độ khoáng đa lượng vi lượng thường giảm xuống so với bình thường (tùy theo lồi thực vật) Ngun nhân có lẽ nhu cầu đạm chồi rau bép giai đoạn tăng trưởng giảm xuống Phần lớn cơng trình nghiên cứu vi nhân giống lồi thân gỗ thành công sử dụng môi trường WPM (Woody Plant Medium), nên WPM gọi môi trường nuôi cấy thân gỗ Môi trường WPM có hàm lượng khống đa lượng thấp hàm lượng vitamin thiamin (B1) cao nên có tác dụng tốt cho q trình trao đổi chất, giúp cho mơ ni cấy hấp thụ trực tiếp loại vitamin mơi trường ni cấy Vitamin có vai trị xúc tác trình trao đổi chất diễn tế bào, muốn đạt sinh trưởng mạnh cho mô nuôi cấy nhà nghiên cứu thêm vào môi trường số vitamin thông thường như: nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, glycine Trong số đó, vitamin B1 coi vitamin thiết yếu cho sinh trưởng biến dưỡng tế bào thực vật Sự phosphoryl hóa biến thiamin thành thiamin-pyrophosphat, chất cocarboxilase tương ứng với khử carboxyl acid cetonic (ShuoHao Huang, 2011) Vậy thí nghiệm mơi trường khống thích hợp cho tăng trưởng chồi rau bép in vitro môi trường WPM, phát triển khỏe, mở to màu xanh Do mơi trường WPM sử dụng cho nghiên cứu cm Môi trường WPM cm Môi trường SH cm Mơi trường MS Hình 3.4 Chồi rau bép sinh trưởng môi trường khác sau 60 ngày nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro BM20-QT.QLKH Trang 31 Sau tạo chồi rau bép hoàn chỉnh có chiều cao trung bình khoảng 1,5 cm cấy chuyền chúng sang mơi trường kích thích rễ để tái sinh hoàn chỉnh hoàn thành giai đoạn nhân giống in vitro Ở giai đoạn tạo rễ, môi trường dinh dưỡng khống dùng mơi trường WPM, bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, g/l than hoạt tính nồng độ khảo sát IBA nhằm tìm mơi trường tối ưu cho q trình sinh tạo rễ Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ IBA lên rễ rau bép in vitro sau 30 ngày Nồng độ IBA (mg/l) nuôi cấy Tỷ lệ mẫu Hình thái rễ rễ (%) Chồi tăng trưởng chậm 0,25 Chồi tăng trưởng chậm 0,5 Chồi tăng trưởng chậm 0,75 Chồi tăng trưởng chậm 1,0 Chồi tăng trưởng chậm 1,5 Chồi tăng trưởng chậm 2,0 Chồi tăng trưởng chậm 2,5 Chồi tăng trưởng chậm 3,0 Chồi tăng trưởng chậm Hình 3.5 Cây rau bép ngồi vườn ươm sau 30 ngày BM20-QT.QLKH Trang 32 Sự hình thành rễ chồi rau bép mơi trường WPM có bổ sung với 0,25 – mg/l IBA ghi nhận bảng 3.4 Các chồi rau bép có chiều cao khoảng cm tăng trưởng chậm khơng hình thành rễ sau 30 ngày ni cấy Các chồi rau bép thu thí nghiệm tạo rễ có chiều cao khoảng cm chuyển trồng vườn ươm Sau 30 ngày nuôi trồng chồi khảo sát, có 52% có khả sống sót tăng trưởng ngồi vườn ươm Kết cho thấy chồi nuôi cấy môi trường WPM có bổ sung IBA cho chồi có khả tăng trưởng hình thành rễ sau 30 ngày trồng ngồi vườn ươm Mặc dù tỉ lệ sống sót hình thành rễ điều kiện ex vitro cịn thấp, bước đầu cho thấy có khả nhân giống rau bép điều kiện in vitro ex vitro BM20-QT.QLKH Trang 33 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua nghiên cứu “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.)” chúng tơi có số kết luận sau: Môi trường tái sinh chồi thích hợp cho rau bép mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,25 mg/l kinetin Môi trường thích hợp cho tăng sinh chồi rau bép in vitro môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA 0,2 mg/l NAA với số chồi trung bình cao 3,27 chồi/mẫu, chồi khỏe Mơi trường khống thích hợp cho tăng trưởng chồi rau bép in vitro môi trường WPM, phát triển khỏe, mở to màu xanh Sau 30 ngày nuôi cấy chồi rau bép môi trường WPM bổ sung 0,25 – mg/l IBA chồi có khả sinh trưởng hình thành rễ vườn ươm sau 30 ngày nuôi trồng giá thể đất trộn với xơ dừa, tro trấu theo tỉ lệ đất : xơ dừa : tro trấu = 1:1:1 Tỉ lệ sống sót chồi rau bép 52% 4.2 Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng loại auxin riêng lẻ kết hợp lên tạo rễ chồi rau bép in vitro BM20-QT.QLKH Trang 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập Trần Toàn (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 775 [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, Nhà xuất y học [3] Nguyễn Thành Đạt (2007), Đánh giá tiềm làm rau ăn bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) Lâm Đồng, Luận văn thạc sĩ, Đại học Đà Lạt [4] Trần Trung Hiếu, Huỳnh Văn Chung, Bùi Thị Linh Huệ, Lương Thị Mỹ Ngân, Bùi Lan Anh Bùi Văn Lệ (2017), Nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.), Tạp chí phát triển Khoa học công nghệ, tập 20, số T2: 4857 [5] Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, tập 3, Nhà xuất trẻ, trang 359 [6] Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Trung Thành (2014), Khảo sát khả nhân giống Trà my hoa đỏ (Camellia Pierre) Sealy) in vitro, piquetiana, Tạp chí khoa học Tự nhiên Công nghệ, tập 30, số 3: 17 – 25 [7] Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [9] Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Quỳnh Trang, Bùi Văn Thắng Vũ Văn Thông (2017), Nghiên cứu nhân giống in vitro Re hương Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn, Tạp chí Cơng nghệ sinh học Giống trồng, trang: 42-48 [10] Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo Nguyễn Thị Thủy (2013), Quy trình nhân giống in vitro Ba kích (Morindaofficenalis How), Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 3: 285-292 [11] Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương (phần I), Nhà xuất Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh BM20-QT.QLKH Trang 35 [12] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương (phần II), Nhà xuất Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh [13] Hegnauer, R (1962), Chemotaxonomy of plant, Pure and applied Chemistry, vol 14(1), 173-188 [14] Iliya I, Ali Z, Tanaka T, Iinuma M, Furusawa M, Nakaya K Murata J, Darnaedi D, Matsuura N, Ubukata M (2003), Stilbene derivatives from Gnetum gnemon Linn, Phytochemistry, 62(4): 601-606 [15] Kazuhiro Kunimasa, Toshiro Ohta, Hiroko Tani, Eishin Kato, Ryoji Eguchi, Kazuhiko Kaji, Katsumi Ikeda, Hideki Mori, Mari Mori, Tomoki Tatefuji, Yukio Yamori (2011), Resveratrol derivative-rich melinjo (Gnetum gnemon L.) seed extract suppresses multiple angiogenesis-related endothelial cell functions and tumor angiogenesis, Molecular Nutrition, vol 55(11), 1730-1734 [16] Le Thi Thuy Tien Tran Van Minh (2015), Tissue cultures of Xa đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi), Journal of Science, vol 3(3), 113-123 [17] Narayanan K Narayanan, Kazuhiro Kunimasa, Yukio Yamori, Mari Mori, Hideki Mori, Kazuki Nakamura, George Miller, Upender Manne, Amit K Tiwari, Bhagavathi Narayanan (2015), Antitumor activity of melinjo (Gnetum gnemon L.) seed extract in human and murine tumor models in vitro and in a colon -26 tumorbearing mouse model in vivo, Cancer Medicine, vol 4(11), 1767-1780 [18] Nguyen Tien Hiep (1996), Flore du Cambodge du Laos et du Viet Nam – tập 31, Gentianaceae par Sovanmody [19] Parhusip NJA, Sitanggang BA (2011), Antimicrobial Activity of Melinjo Seed and Peel Extract (Gnetum gnemon) Against Selected Pathogenic Bacteria, Microbiology Indonesia, 5(3):103-112 [20] ShuoHao Huang, HaiBin Zeng, Jian Yun Zhang, Shu Wei, Long Quan Huang (2011), Interconversions of different forms of vitamin B6 intobacco plants, Phytoch., 72(17): 2124 – 2129 [21] Yasni S, Syamsir E, Direja EH (2009), Antimicrobial activity of black cumin extracts (nigella sativa) against food pathogenic and spoilage bacteria, Microbiology Indonesia, 3(3): 146-150 BM20-QT.QLKH Trang 36 Trang web [22] www.http//wikipedia.org BM20-QT.QLKH Trang 37 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Qui trình đề nghị nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) Cây rau bép (Cây năm tuổi, khỏe mạnh) Chồi ngọn, chồi nách Khử trùng lần 11 – 12 tháng (HgCl2 0,1% phút javel:nước = 1:3 15 phút) Tái sinh chồi từ chồi ngọn, chồi nách (MS + 0, mg/l BA + 0,25 mg/l kinetin) Tăng sinh chồi rau bép in vitro (MS + 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA) Tăng trưởng chồi rau bép in vitro (WPM) Trồng vườn ươm (đất : xơ dừa : tro trấu = 1:1:1) Cây Qui trình nhân giống in vitro rau bép (Gnetum gnemon L var griffithii Markgr.) Giai đoạn vô mẫu (4 - tháng): Đối với mẫu chồi chồi nách: Chọn rau bép khỏe mạnh, đồng đều, cắt lấy chồi chồi nách mang mầm ngủ BM20-QT.QLKH rau bép, sau tiến hành khử trùng mẫu Các chồi rửa nhiều lần với nước sau rửa với xà bơng khoảng 15-20 phút rửa lại với nước cất vô trùng 5-7 lần Tiếp theo chồi đưa vào khử trùng tủ cấy vô trùng, ngâm chồi cồn 700 30 giây sau rửa lại với nước cất vơ trùng Các chồi khử trùng lần với HgCl2 0,1% giọt tween phút Sau mẫu khử trùng lần javel với tỉ lệ javel:nước = 1:3 giọt tween khoảng 15 phút Sau lần khử trùng tiến hành rửa mẫu với 5-7 lần nước cất vô trùng Các chồi cấy vào môi trường MS bổ sung 30g/l sucrose, 8g/l agar Sau 02 tuần, loại bỏ mẫu nhiễm, mẫu có chiều dài 1,0 – 1,5 cm dùng để bố trí thí nghiệm Giai đoạn tái sinh chồi (2-3 tháng): Chồi chồi nách nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,25 mg/l kinetin, 30 g/l sucrose, g/l agar Sau 60 ngày nuôi cấy, chồi tạo thành sử dụng cho giai đoạn nhân chồi Giai đoạn nhân chồi (3 – tháng): Từ chồi rau bép in vitro nuôi cấy môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA 0,2 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, g/l agar Sau 90 ngày nuôi cấy, chồi sử dụng cho giai đoạn tăng trưởng chồi Giai đoạn tăng trưởng (2 tháng): Chồi có kích thước đồng từ – 1,5 cm nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar 0,5 g/l than hoạt tính Sau 60 ngày ni cấy, chồi sử dụng cho giai đoạn tạo rễ Giai đoạn kích thích rễ (1 tháng): Chồi cao khoảng 1,5 cm nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,25 – mg/l IBA, 30 g/l sucrose, g/l agar 0,5 g/l than hoạt tính Sau 30 ngày nuôi cấy chồi rau bép môi trường WPM bổ sung 0,25 – mg/l IBA chồi có khả sinh trưởng hình thành rễ vườn ươm sau 30 ngày nuôi trồng giá thể đất trộn với xơ dừa, tro trấu theo tỉ lệ đất : xơ dừa : tro trấu = 1:1:1 BM20-QT.QLKH Phụ lục 2: Thí nghiệm 1: ANOVA Table for tlmtsc by nt Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 11763.1 11 1069.37 0.76 0.6782 Within groups 33978.6 24 1415.78 Total (Corr.) 45741.7 35 Thí nghiệm 2: Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 13.825 1.975 107.73 0.0000 Within groups 0.293333 16 0.0183333 Total (Corr.) 14.1183 23 Table of Means for so choi by nt with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nt Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -?C 1.0 0.0781736 0.882818 1.11718 NT1 1.06667 0.0781736 0.949484 1.18385 NT2 2.73333 0.0781736 2.61615 2.85052 NT3 3.26667 0.0781736 3.14948 3.38385 NT4 2.2 0.0781736 2.08282 2.31718 NT5 1.4 0.0781736 1.28282 1.51718 NT6 1.46667 0.0781736 1.34948 1.58385 NT7 1.73333 0.0781736 1.61615 1.85052 -Total 24 1.85833 Multiple Range Tests for so choi by nt -Method: 95.0 percent Duncan nt Count Mean Homogeneous Groups -?C 1.0 X BM20-QT.QLKH NT1 1.06667 X NT5 1.4 X NT6 1.46667 X NT7 1.73333 X NT4 2.2 X NT2 2.73333 X NT3 3.26667 X -Thí nghiệm ANOVA Table for so la by nt Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 29.9533 5.99067 107.83 0.0000 Within groups 1.0 18 0.0555556 Total (Corr.) 30.9533 23 Table of Means for so la moi by nt with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nt Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT1 2.1 0.117851 1.92492 2.27508 NT2 1.8 0.117851 1.62492 1.97508 NT3 4.6 0.117851 4.42492 4.77508 NT4 3.6 0.117851 3.42492 3.77508 NT5 2.2 0.117851 2.02492 2.37508 NT6 1.4 0.117851 1.22492 1.57508 -Total 24 2.61667 Multiple Range Tests for so la moi by nt -Method: 95.0 percent LSD nt Count Mean Homogeneous Groups -NT6 1.4 X NT2 1.8 X NT1 2.1 XX NT5 2.2 X NT4 3.6 X NT3 4.6 X BM20-QT.QLKH ANOVA Table for chieu cao by nt Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 273.389 54.6777 86.05 0.0000 Within groups 11.4375 18 0.635417 Total (Corr.) 284.826 23 Table of Means for chieu cao by nt with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nt Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -NT1 11.5 0.398565 10.9079 12.0921 NT2 9.75 0.398565 9.1579 10.3421 NT3 19.25 0.398565 18.6579 19.8421 NT4 12.5 0.398565 11.9079 13.0921 NT5 10.525 0.398565 9.9329 11.1171 NT6 9.15 0.398565 8.5579 9.7421 -Total 24 12.1125 Multiple Range Tests for chieu cao by nt -Method: 95.0 percent LSD nt Count Mean Homogeneous Groups -NT6 9.15 X NT2 9.75 XX NT5 10.525 XX NT1 11.5 XX NT4 12.5 X NT3 19.25 X BM20-QT.QLKH