Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG TÔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT V ACYI H YDRAZOS MỚI LAI HÓA ONCRASIN 1 HƯỚNG HOẠT HÓA ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT[.]
Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG TÔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT V-ACYI.H YDRAZOS MỚI LAI HÓA ONCRASIN-1 HƯỚNG HOẠT HÓA ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG Mã sinh viên: 1701162 TÔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT V-ACYIH YI)RAZO\ MỚI LAI HÓA ONCRASIN-1 HƯỚNG HOẠT HÓA ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hưởng dẫn: PGS.TS Phan Thị Phương Dung TS Đỗ Thị Mai Dung Noi thực Bộ mơn Hóa dươc HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người đồng hành, hỗ trợ động viên suốt trình nghiên cứu khoa học thực khóa luận tốt nghiệp Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, PSG.TS Phan Thị Phương Dung, TS Đỗ Thị Mai Dung, TS Dương Tiến Anh Thầy cô anh tận tình hướng dẫn tơi từ ngày đầu chập chững làm nghiên cứu khoa học, đưa lời khun bổ ích động viên tơi lúc khó khăn, giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn đến giảng viên, anh chị kĩ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy cô anh chị tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thành viên tham gia nghiên cứu khoa học mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt anh Bùi Xuân Trường, chị Hoàng Bảo Ngọc, anh Phan Huy Đức, bạn Trịnh Thị Minh Ngọc, bạn Nguyễn Quang Thế Vũ, bạn Nguyễn Đức Thịnh, em K73, K74 nhóm nghiên cứu Tống họp hóa dược Sự đồng hành giúp đỡ người nguồn động viên to lớn suốt thời gian thực nghiên cứu Với lịng biết ơn chân thành nhất, tơi xin cảm ơn giúp đỡ tất người Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC Sơ ĐÒ DANH MỤC BIÊU ĐÒ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzym caspase ỉ 1.1 Giới thiệu enzym caspase 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc chung caspase ỉ 1.4 Cơ chế hoạt hóa enzym caspase trình apoptosis 1.1.5 Enzym caspase-3 sinh lý bệnh ung thư 1.2 Các chất hoạt hóa enzym caspase-3 1.2.1 Chất hoạt hóa procaspase-3 - PAC-Ỉ 1.2.3 Các dẫn chắt khác 1.3 Quinazolin ứng dụng điều trị ung thu 10 1.3.1 Quinazolin dẫn chất 10 1.3.2 Các phương pháp tông hợp khung quỉnazoỉin-4(3H)-on 11 1.4 Oncrasin-1 hoạt tính kháng ung thu 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .15 2.1.1 Hóa chất 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Đảnh giả tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp .16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Hóa học 16 2.3.2 Đảnh giá hoạt tính sinh học 17 CHƯƠNG THỤC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .19 3.1 Hóa học 19 3.1.1 Tổng họp hóa học 19 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 27 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 28 3.2 Hoạt tính sinh học 32 3.2.1 Đảnh giả độc tính tê bào ung thư 32 3.2.2 Đảnh giá khả hoạt hóa caspase-3 33 3.3 Bàn luận 34 3.3.1 Tồng hợp hóa học 34 3.3.2 Khắng định cấu trúc 36 3.3.3 Hoạt tỉnh sinh học .41 KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ‘H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 5-FU 5-fluorouracil Ac-DEVD-/?NA Acetyl Asp-Glu-Val-Asp /7-nitroanilid Bcl-2 B-cell lymphoma CARD Vùng tưong tác tập hợp caspase (Caspase recruitment domain) d Vạch đôi (doublet) DCM Diclomethan DED Vùng tương tác gây chết (Death effector domain) DMF VjV-d i methyl formam id DMSO Dimethyl sulfoxid EC50 Nồng độ hiệu 50% (The half maximal effective concentration) ESI Ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization) EtOH Ethanol FAM-DEVD-fmk Chất phát huỳnh quang ức chế caspase-3 FasL Phối tử gây chết Fas (Fas ligand) FDA Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (U.S Food and Drug Aministratrion) h Giờ IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50% (The half maximal inhibitory concentration) ICE Enzym chuyên hóa interleukin-1 p (Interleukin-1 p-converting enzyme) IPA Chất ức chế protein apoptosis (Inhibitors of protein apoptosis) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) J Hằng số tương tác KRIBB Viện nghiên cứu sinh học công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) m Đa vạch (multiplet) MCF-7 Te bào ung thư vú người MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NCI-H23 Ung thư phổi không tế bào nhở người NMDA 7V-methyl-Z)-aspartat receptor p53 Protein ức chế khối u PAC-1 Chất hoạt hóa procaspase-3 (Procaspase-activating compound 1) PARP Poly(ADP-ribose) polymerase PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC3 Ưng thư biểu mô tuyến tiền liệt người PKCt Protein kinase C-I R/ s Hệ số lưu giữ SRB Sulforhodamin B SW620 Ưng thư đại tràng người Tnc T29 Nhiệt độ nóng chảy T29Htl Tể bào T29 đột biến gen H-Ras T29Ktl Tế bào T29 đột biến gen K-Ras TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS Tetramethylsilan TNF Yeu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TRAIL Phối tử kích hoạt apoptosis liên quan đến TNF Vạch đơn (Singlet) Tế bào biểu mô buồng trứng người (TNF-related apoptosis-inducing ligand) U937 Te bào ung thư hạch bạch huyết người V Dao động hóa trị Ơ Độ dịch chuyển hóa học (ppm) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hiệu suất tồn phần trình tổng họp dẫn chất Va-f 27 Bảng 3.2 Giả trị R/và nhiệt độ nóng chảy dẫn chắt Va-f 28 Bảng 3.3 Kết phổ IR dẫn chất Va-f 28 Bảng 3.4 Kết phổ MS dẫn chất Va-f 29 Bảng 3.5 Kết phổ dỉ-NMR dẫn chất Va-f 30 Bảng 3.6 Kết phô l3C-NMR dẫn chắt Va-f 31 _ r _ ,_ _ _ _ r r Bảng 3.7 Kêt đảnh giá độc tính sơ dịng tê bào ung thư 33 Bảng 3.8 Kêt đảnh giá khả hoạt hóa caspase-3 dân chât Vc 33 DANH MỤC HINH VE Hình 1.1 Quả trình apoptosis hoại tử tế bào Hình 1.2 Phân loại caspase Hình 1.3 Cấu trúc chung caspase Hình 1.4 Hai đường hoạt hóa quảtrình apoptosis Hình 1.5 Sự phân cắt tải xếp chuỗi protein trình hoạt hóa enzym caspase Hình 1.6 cấu trúc PAC-1 Hình 1.7 Cơ chế hoạt hóa procaspase-3 PAC-1 Hình 1.8 Cấu trúc S-PAC-1 Hình 1.9 Cấu trúc WF-210 WF-208 10 Hình 1.10 Cấu trúc quinazolin dẫn chắt quinazolinon 10 Hình 1.11 Một số thuốc điều trị ung thư có cấu trúc quinazolin cấp phép FDA 11 Hình 1.12 Câu trúc oncrasin-1 .13 Hình 3.1 Phổ hồng ngoại dẫn chắt Vb 37 Hình 3.2 Phổ khối lượng dẫn chất Va 38 Hình 3.3 Các cấu dạng có dẫn chẫn Va-f 39 Hình 3.4 Các tương tác cấu dạng syn-E antỉ-E 40 Hình 3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR dẫn chất Va 40 Hình 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chắtVa 41 DANH MỤC Sơ ĐỒ A _ Sơ đô 1.1 Quy trình tỏng hợp 2-ethoxy-4(3H)-quỉnazolỉnon theo Griess cộng .11 Sơ đồ 1.2 Phản ứng Niementowski 12 Sơ 1.3 Quy trình tơng họp dân chât quỉnazolin-4(3H)-on sử dụng tảc nhân Vilsmeỉer 12 Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng họp Piriqualon .12 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng họp dẫn chất Va-f 19 Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng họp chất trung gian lia 19 Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng họp chất trung gian nia .20 Sơ đồ 3.4 Phản ứng tổng họp chất trung gian IVa .20 Sơ đồ 3.5 Phản ứng tổng họp dẫn chất Va 21 Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng họp dẫn chất Vb 21 Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng họp dẫn chất Vc 22 Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng họp dẫn chắt Vd 24 Sơ đồ 3.9 Quy trình tống hợp dẫn chắt Ve 25 Sơ đồ 3.10 Quy trình tống hợp dẫn chất Vf 26 So’ đồ 3.11 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian Ha-f 34 Sơ đồ 3.12 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tông họp chất trung gian HIa-f 35 Sơ đồ 3.13 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa-f 35 So’ đồ 3.14 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tông hợp dẫn chắt Va-f 36 06/02/20 16:57:36 D:\DATA\Old\TA-MS\200602\107F 107F#18 RT: 0.17 AV: NL: 2.99E8 T: FTMS + p ESI Full ms [100.0000-1000.0000] 488.12817 100ti 95 90 o 85 H N 80 N 75 70 N 65H 9? o c cu 60 CTPT: C26H19CIFN5O2 55 M =487,1211 50 0) (U CD £ 45 40 453.34323 35 491.12842 30 25 20 15 456.35211 10 475.32532 498.40073 0J 448.36206 450 484.38440 467.30038 460 470 480 510.11017 490 500 m/z 510 528.41022 536.16461 520 530 Phụ lục 11: Phô khôi lượng MS dân chât Ve PL-11 540 556.44116 550 560 06/02/20 17:03:30 D:\DATA\Old\TA-MS\200602\107G 107G#25 RT: 0.23 AV: NL: 3.35E8 T: FTMS + p ESI Full ms [100.0000-1000.0000] 488.12827 100ti 95 90 85 o 80 H N 75 70 N 65H 9? ọ c ro 60 CTPT: C26H19CIFN5O2 55 M = 487,1211 50 0) ro (D 45 40 453.34329 35 491.12851 30 25 20 448.36215 15 456.35165 10 484.38458 470.36996 o-1 413.34836 420 498.40082 I 510.11014 528.41040 546.18121 ’ «r’ ; 520 440.35806 440 460 480 540 m/z Phụ lục 12: Phô khôi lượng MS dân chât Vf PL-12 566.42706 556.44116 560 TANh-107A 'TO'TOin(\ír)^O^ƠJOƠ>ír)H kDH>Hư)a)Ofn(NCOH^co^kD^r' (NH^kDcxjH^r'^rHO^r'kDkD ’Tcno CO^’TOlH^OCOkD^mCNOOCOO^ ^’TfOMC^CMHHOOCOCOCOCOCOrrkD ư)Lnưìiíì^rc(y)(N(N^(N^ơjH^(Nr' BRUKER cococococooDcocoax^r-^^^brr-^r-^rr-^r-^r^^^r-rưìưi^ Current Data Parameters NAME TANh-107A EXPNO 10 PROCNO 5’ F2 - Acquisition Parameters 20200327 Date_ 16.54 Time INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 see 138.87 RG DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 298.4 K DI 1.00000000 see TD0 CHANNEL fl ——— SFO1 500.1330885 MHz NUCI 1H Pl 9.80 usee PLW1 24.00000000 w F2 SI SF WDW SSB LB GB PC 11 10 987654321 Processing parameters 65536 500.1300000 MHz EM 0.30 Hz 1.00 ppm Phụ lục 13: Phố cộng hưởng tù’ hạt nhân ipỉ-NMR dân chất Va PL-13 1 1 5 TANh-107B ơ>HH(N^o>H’TH(DưìHư)^kD(^’TO^ơ>(N(X)ff)oư)0’Tư)r' ưìí*)k£)rnHnH^oơ>o3(o^(N^(NHH^ơ>(X)^mơ)(NHCococo í’WMc\](\]OOơ>^Ukí)’7ưì(Nco • • r^’TOOƠ'»rd[^(^’^(XJƠ>ơ^ơ>COir>COC\Jrd^DlT)rdrdCO CDkDkPin^r^TCOCOCOCnCXJCXJCXJCXJCXJCXJCXJCXJrdrdrdrdO r-I r-< H H H r-< r-< rd r—< r—< rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd co m CXI • KT o in tfJkDkOkOinq’q’M’cncnfOcnfnfncONC'iNCMCNNCNCNNCNHr-iH ơ> r- Current Data Parameters NAME TAnh-107F EXPNO 32 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200331 Time 19.16 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 2048 DS SWH 31250.000 Hz 0.476837 Hz FIDRES AQ 1.0485760 see RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 299.2 K DI 2.00000000 see Dll 0.03000000 sec TD0 SFO1 NUCI Pl PLW1 - CHANNEL fl 125.7703637 MHz 13C 9.50 usee 90.00000000 w ======== CHANNEL f2 SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltzl6 PCPD2 80.00 usee PLW2 24.00000000 w PLW12 0.36015001 w PLW13 0.23050000 w —J - T - ị r - ĩ - - T - - T - - T - - T - - T - 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125 .7577885 MH WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 Phụ lục 23: Phổ cộng hưởng tù’ hạt nhân Ì3C-NMR dẫn chất Ve PL-23 TAnh—107G kí)kí)kí)r'HkD(\jưìcoơ\^>(NO'TkDincocor''>o>ooc\ju -)r'>inr'ink0 NíN^LnkOin^o^inHLncoco^ưìNOO^Hin^^^^^ưìcoco^n HHCOHCO^kOưì^ơìN^^^LnưìHCN^-T^^^OCNO^^kOƯÌCN •••••••• •••••••• o rd ơ> in o kD^^lDưìư^ư^ưìTCnmncnCNCNCNCNCNíNCNMMCNCNHHHHHHHH rd r-I rd rd rd t—< r-1 r-< rd t—< rd rd rd rd r-1 rd 1—I rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd ơ> r’T Current Data Parameters NAME TAnh-107G EXPNO 42 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200401 Time 8.22 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 2048 DS SWH 31250.000 Hz 0.476837 Hz FIDRES AQ 1.0485760 see RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 298.5 K DI 2.00000000 see Dll 0.03000000 sec TD0 SFO1 NUCI Pl PLW1 - CHANNEL fl 125.7703637 MHz 13C 9.50 usee 90.00000000 w ======== CHANNEL f2 SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltzl6 PCPD2 80.00 usee PLW2 24.00000000 w PLW12 0.36015001 w PLW13 0.23050000 w 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125 .7577885 MH WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 Phụ lục 24: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vf PL-24 College of Pharmacy, Chungbuk National University, 12 Gaesin, Heungduk, Cheongju, Chungbuk 361-763, KOREA Report on Bioactivity of Compounds Cytotoxicity of series Cpd 5a 5b 5c 5d 5e 5f 5g 5h 5i 5j 5k 51 5m 5-FU PAC-1 Oncrasin-1 Cytotoxicity (IC50,2 |1M)/Cell lines5 SW620 PC3 NCI-H23 1.01±0.045 3.46±0.082 0.79±0.033 3.32±0.096 0.5H0.049 0.87±0.084 1.21±0.062 0.49±0.014 1.12±0 006 2.82±0.019 10±0 051 3.15±0.091 >10 8.84±1.92 2.63±0.016 2.69±0.031 1.05±0.087 3.36±0.031 0.51±0.050 76±0 091 0.8H0.061 0.44±0.023 16±0.052 0.84±0.030 1.18±0.009 2.97±0.267 0.96±0.053 3.7H0.167 >10 13.61i0.46 2.98±0.139 2.4H0.021 0.63±0.002 1.79±0.080 0.70±0.057 1.35±0.026 0.46±0.007 0.62±0.050 0.92±0.048 0.50±0.023 1.05±0.070 2.26±0.035 0.79±0.008 2.43±0.198 >10 13.45±3.92 2.60±0.012 2.15±0.019 Reviewed by Sang-Bae Han, PhD Professor, College of Pharmacy, Chungbuk National University 52 Naesudong, Seowon, Cheongju, Chungbuk 362-763, Korea Tel: 82-43-261-2815, E-mail: shan@chungbuk.ac.kr Phụ lục 25: Giấy chứng nhận hoạt tỉnh sinh học PL-25 Va Vb Vc Vd Ve Vf