BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THÉ vũ TỐNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHÁT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VÒNG 2 OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HOÁ ENZYM CASPASE KHÓA L[.]
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THÉ vũ TỐNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHÁT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VỊNG 2-OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HỐ ENZYM CASPASE KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG THÉ vũ Mã sinh viên: 1701679 TÓNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SƠ DÃN CHẤT ACETOHYDRAZID MỚI MANG DỊ VỊNG 2-OXOINDOLIN HƯỚNG HOẠT HỐ ENZYM CASPASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hưởng dẫn: TS Đỗ Thị Mai Dung TS Dương Tiến Anh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người đáng kính tơi: GS TS Nguyễn Hải Nam, PGS TS Phan Thị Phuong Dung, PGS TS Trần Phuong Thảo, TS Đỗ Thị Mai Dung -Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận mà ln có dẫn xác, kịp thời động viên tơi lúc khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Trường Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Cuổi cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị bạn nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược khố 70, 71, 72 hỗ trợ gắn bó suốt quãng thời gian nghiên cứu Đặc biệt TS Dương Tiến Anh, anh ln tận tình bảo giúp tơi vượt qua khó khăn ngày đầu chập chững làm quen với môi trường công việc nghiên cứu Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Quang Thế Vũ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÃC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BANG DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ DANH MỤC CÁC sơ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) 1.1.1 Giới thiệu apoptosis 1.1.2 Các giai đoạn trình apoptosis 1.1.3 Sự chết tế bào theo chương trình bệnh ung thư 1.2 Enzym caspase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cấu trúc 1.2.3 Phân loại 1.2.4 Vai trò enzym caspase chết tế bào theo chương trình .6 1.3 Các chất hoạt hóa enzym caspase 1.3.1 Vai trò ion kẽm hoạt hóa hoạt động caspase-3 1.3.2 Một số chất hoạt hóa caspase-3 1.4 Hoạt tính sinh học số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin 12 1.4.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư 12 1.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 14 1.4.3 Hoạt tính kháng virus 15 1.4.4 Một số hoạt tính sinh học khác 15 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Hóa học I 18 2.2.2 Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tống hợp 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Hoá học 18 2.3.2 Thử hoạt tính sinh học 19 CHƯƠNG THỤ C NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Hoá học 22 3.1.1 Tổng họp hoá học 22 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 28 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 29 3.2 Thử hoạt tính sinh học 35 3.2.1 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 35 3.2.2 Thử tác dụng hoạt hoá enzym caspase-3 36 3.3 Bàn luận .37 3.3.1 Tổng họp hoá học 37 3.3.2 Khẳng định cấu trúc .42 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÃI LIỆU THAM KHẲO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR : Phố cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) *H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 5-FU : 5-Fluorouracil AcOH : Acid acetic ADN : Acid deoxyribonucleic APAF-1 : Nhân tố hoạt hoá enzym protease apoptosis (Apoptotic protease activating factor 1) ASAP HTS : Giải trình tự Amplicon thông lượng cao (Amplicon Sequence Analysis Pipeline High-Throughput Sequencing) Bad : Bcl-2-associated agonist of cell death Bak : Bcl-2 homologous antagonist killer Bax : Bcl-2-associated X protein Bcl-2 : B-cell lymphoma Bel-7402 : Dòng tế bào ung thư biểu mô gan người Bid : BH3-interacting domain death agonist Bim : Bcl-2-like protein 11 BIODS : Tổng họp thuốc theo định hướng sinh học (Biology-oriented drug synthesis) CARD : Miền tổ hợp hoạt hoá caspase (Caspase activation and recruitment domain) CDK : Kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase) d : Pic đôi phổ *H-NMR (Doublet) dADP : Deoxyadenosin diphosphat dATP : Deoxyadenosin triphosphat DCM : Dicloromethan dd : Pic đôi lần phổ 'H-NMR (Doublet of doublet) DD : Miền gây chết (Death domain) DED : Miền gây hiệu ứng chết (Death effector domain) DISC : Phức hợp tín hiệu gây chết (Death-inducing signaling complex) DMA : A,A-dimethylacetamid DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMF : Dimethylformamid DMSO : Dimethylsulfoxid DMSO-í/ó Dimethylsulfoxid deuteri hóa ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization) EtOH Ethanol FADD Protein có miền gây chết liên kết với thụ thể Fas (Fas-associated death domain protein) FAK Kinase kết dính khu trú (Focal adhesion kinase) FBS Huyết bào thai bò (Fetal Bovine Serum) FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (U.S Food and Drug Administration) H(%) Hiệu suất (%) HCT-116 Dòng tế bào ung thu đại trực tràng người HIV-1 RT Enzym phiên mã ngược virus HIV-1 (HIV-1 reverse transcriptase) HIV-l-IIIB Human Immunodeficiency Virus type (IIIB Strain) HL-60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu người HOMO Highest Occupied Molecular Orbital HRMS Phổ khối lượng độ phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy) IC50 ICE : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) : Enzym chuyển hoá interleukin-1 p (Interleukin-1 p converting enzyme) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) J Hằng số ghép cặp phổ 'H-NMR (Hz) LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital m Da pic phổ 'H-NMR (Multiplet) MeCN Acetonitril MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) MOMP Sự thẩm thấu qua màng ty thể (Mitochondrial outer membrane permeabilization) MS : Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) NCI-60 : Nhóm gồm 60 dòng tế bào ung thư người Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ đưa vào nghiên cứu NMP : V-methyl-2-pyrrolidon NNRTI : Chất ức chế enzym phiên mã ngược nucleosid (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) NOD : Miền liên kết nucleotid oligome hóa (Nucleotide-binding and oligomerization domain) Noxa Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein OD Mật độ quang (Optical Density) OVCAR-3 Dịng tế bào ung thu biểu mơ buồng trứng người p53 Gen áp chế khối u p53 (tumor protein p53) PAC-1 Hợp chất hoạt hóa procaspase (Procaspase-activating compound 1) PBS Dung dịch đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC3 Dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến tiền liệt PYK2 Tyrosin kinase giàu prolin (Proline-rich tyrosine kinase 2) Rf RKO Hệ số lưu giừ sắc ký lóp mỏng s Pic đơn phổ ‘H-NMR (Singlet) SAR Liên quan cấu trúc - tác dụng (Structure-Activity Relationship) SJSA-1 Dòng tế bào ung thư xương người SNƯ-398 Dịng tế bào ung thư biếu mơ gan người SRB Sulforhodamin B SW620 Dòng tế bào ung thư đại tràng người t Pic ba phổ *H-NMR (Triplet) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS Tetramethylsilan TNF Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) t°nc ƯV Nhiệt độ nóng chảy VEGF Yeu tố tăng trưởng nội mơ mạch máu Dịng tế bào ung thư biểu mô ruột kết người Tử ngoại (Ultraviolet) (Vascular endothelial growth factor) XIAP : Chất ức chế protein apoptosis liên kết với nhiễm sắc thể X (X-linked inhibitor of apoptosis protein) ZBG Nhóm gắn kẽm (Zinc binding group) Ỗ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (phần triệu) phổ NMR V Số sóng ứng với dao động hố trị phố IR DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại enzym caspase Bảng 3.1 Các số lý hố hiệu suất tồn phần dẫn chất IVa-g 28 Bảng 3.2 Kết kiềm tra độ tinh khiết dẫn chất IVa-g 29 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ hồng ngoại dẫn chất IVa-g 29 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ khối lượng dẫn chất IVa-g 30 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ ‘H-NMR dẫn chất IVa-g 31 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất IVa-g 33 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất IVa-g 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Các giai đoạn trình apoptosis Hình 1.2 Q trình hoạt hóa apoptosis thơng qua enzym caspase Hình 1.3 Cấu trúc chung họp chất 7V-acylhydrazon (a) cấu trúc phức chất A-acylhydrazon với ion kẽm (b) Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo hợp chất PAC-1 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo hợp chất WF-210 WF-208 10 Hình 1.6 Công thức cấu tạo hợp chất 11 Hình 1.7 Cồng thức cấu tạo họp chất 11 Hình 1.8 Liên quan cấu trúc - hoạt tính kháng tế bào ung thư (SAR) dẫn 12 chất 2-oxoindolin Hình 1.9 Cơng thức cấu tạo Sunitinib Semaxanib 13 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo họp chất 10 13 Hình 1.11 Cơng thức cấu tạo họp chất 11 14 Hình 1.12 Công thức cấu tạo họp chất 12 13 14 Hình 1.13 Cơng thức cấu tạo họp chất 14 15 Hình 1.14 Cơng thức cấu tạo ba họp chất 15, 16, 17 15 Hình 1.15 Cơng thức cấu tạo số dẫn chất 2-oxoindolin mang hoạt tính 16 sinh học Hình 3.1 Biểu đồ kết thử tác dụng hoạt hoá enzym caspase-3 dẫn 36 chất IVg Hình 3.2 Các sản phẩm C-alkyl hố tạo thành sau phản ứng 39 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo sản phẩm phụ tạo thành 41 Hình 3.4 Phổ HRMS dẫn chất IVb 44 Hình 3.5 Cơng thức cấu tạo dẫn chất IVa-g 45 Hình 3.6 Các đồng phân cấu dạng có dẫn chất acetohydrazid 47 Hình 3.7 Cấu trúc cộng hưởng liên kết amid 47 Hình 3.8 Sự xen phủ orbital ơco Ơ*NH hai đồng phân anti/E 48 syn/E Hình 3.9 Khả tạo liên kết hydro liên phân tử đồng phân syn/E 49 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh độc tính tế bào dẫn chất IVa-g với 5-FU 50 PAC-1 dòng tế bào ung thư thử nghiệm D:\DATA\Old\TA-MS\200803\109J 08/03/20 15:25:09 109J&18 RT: 0.17 AV: NL: 1.93E9 T: FTMS + p ESI Full ms [100.0000-1500.0000] 350.1500 100q 95^ 90^ 85^ 802 - 70^ 65- R elative A bundance 60- 55^ 50^ 45^ IVg, M = 349,1426 40^ 35 30- 20 15 327.0083 10 227.1755 5- 195.0878 385.3173 453.3435 279.1592 149.0235 440.3584 475.3256 566.4277 699.2928 I I I I r I I I I I I 200 300 400 500 m/z Phụ lục 14 Phổ MS hợp chất IVg PL-14 600 TAnh-109A H H ơ^in(NCO(NHkữHCOC\COr' u?Lnkữư)'^'^HHor^LnM' ^co^rcNH^Hoưì^co^ (N(N(N(N(NOOOO>Ơ^COM ’ co cn cí » ọ CM I ■ ■ ■ I 12 11 10 Phụ lục 17 Phổ 'H-NMR hợp chất IVc PL-17 ppm TAnh-109D co ID • (XJCOkDCNr-HO^DOO^^OLDOr" HO^COU?^(NH(NHOư^^03 Djor-r-r-r-DD inLf)CM(\l(NC\l(N(NOOOƠWCO LO CO kO ỈRUKER co Current Data Parameters NAME TAnh-109D EXPNO 40 PROCNO IVd 6’ F2 - Acquisition Parameters Date20200731 Time 14.39 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PƯLPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 see RG 191.38 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 300.6 K DI 1.00000000 see TDO 5’ ======== CHANNEL fl ======== SFO1 500.1330885 MHz NƯC1 1H P1 9.80 usee PLW1 24.00000000 w F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1300000 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 Ọ Ọ • I •••••-••• I 10 I I I I I 11 I I I I I -I 987654321 Phụ lục 18 Phổ 'H-NMR hợp chất IVd PL-18 ppm TAnh-109E r-< mm • • ro^^O^^^ininO^CO^MiNO^CNCNHOO^M'^UiM ’HOCn H^kO^^^kOkữCOCN^CNCNCNCNOOOOOOO^^CO^COCOkĐ rHt-H cor-r-r-r-r^r-r-r-r-r-r-r-r-r-r-r-r-r^r-r-^D^ko^^cncnco RUKER r—It—1 Current Data Parameters NAME TAnh-10 9E-DMSO EXPNO 40 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date20200811 Time 17.48 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PƯLPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 see RG 191.38 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 299.9 K DI 1.00000000 see TDO ======== CHANNEL fl ======== SFO1 500.1330885 MHz NƯC1 1H P1 9.80 usee PLW1 24.00000000 w F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1300000 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 r 11 10 I I I I I 1111I I 987654321 Phụ lục 19 Phổ 'H-NMR hợp chất IVe PL-19 ppm TAnh-109G CM OlDƠ^03H>O[^(N [''O'^owr'^Hinin ommcocoiDorr) oio^íNrco^^coơ^ RUKER LDkDinkDiiWincw r-r^mcncMO^rcocxjrH H^^^CỌCNCNOO GOcor->^(\jơ\ơ>o>oooooocoư)kữ^r^(nn(n RUKER Current Data Parameters NAME TAnh-109J EXPNO 10 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date20200724 Time 10.51 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 191.38 DW 50.000 usee DE 6.50 usee TE 299.3 K DI 1.00000000 sec TDO ■ SFO1 NUC1 Pl PLW1 F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1300000 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 I J UUJL p o O cọ O 9? s? CD co o CD CM Ơ CM I ••■■■••■■ I 12 £1 500.1330885 MHz 1H 9.80 usee 24.00000000 w 10 Phụ lục 21 Phổ ’H-NMR hợp chất IVg PL-21 ppm TAnh-109A LO LO ơì Ị I r- 00 co co o co CO LO LO CO co —1 LO LO ơ> LO p' o LO LO 1 co co ĩ—1 o o co CM r—1 ơo co CO j CM CO CM co LO o 00 r- LO CM CM Ị cn co CM ã V-!1 P"* p**ô LO ã ơ> r- LO LO CO co CO co CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM o o Ị- ■ ơ>ơ>r-ư^^r^T^TCN(Nơ>ơ> r>kDkD'3'^M’'3’(n(nfnc\ic\]c\jc\i(\j(N(N(N(\]c\ioo kũ in