BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRÀN THỊ MINH THU NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP[.]
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRÀN THỊ MINH THU NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRÀN THỊ MINH THU 1701554 NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SÔ CAO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hưởng dân: TS Nguyễn Khắc Tiệp HVCH Tống Xuân Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dưực HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đờ, quan tâm động viên em trình nghiên cứu khoa học thực đề tài khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, HVCH Tống Xuân Quang ln quan tâm, giúp đỡ, tận tình bảo để em có hướng đắn suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên mồn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, suốt năm học đại học truyền đạt cho em kiến thức vô quý báu để em tự tin tháng ngày tới Em xin cảm ơn bạn Đỗ Thị Huyền Thương, bạn Hoàng Thị Ánh Nhật người bạn em thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, cảm ơn ln đồng hành, hỗ trợ động viên tinh thần em nhiều suốt khoảng thời gian khó khăn vừa qua Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người hậu phương vững chắc, động lực tinh thần to lớn để em vững bước Nghiên cứu tài trợ đề tài cấp Trường Đại học Dược Hà Nội theo định 798/QĐ-DHN năm 2021 Tên đề tài: "Nghiên cứu tạo biofilm s aureus đìa 96 giếng, ứng dụng sàng lọc khả diệt biofilm số dược liệu Việt Nam", định số 798/QĐ-DHN (xem phụ lục 1) Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên Trần Thị Minh Thu MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẦT DANH MỤC CÁC BÀNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, Đồ THỊ ĐẶT VẮN ĐỀ CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan Staphylococcus aureus 1.1.1 Giới thiệu vê Staphylococcus aureus 1.1.2 Đặc điềm hình thái, tính chất ni cấy 1.1.3 Khả gây bệnh s aureus 1.2 Biofilm s aureus 1.2.1 Khái niệm biofilm 1.2.2 Các giai đoạn hình thành biofilm s aureus 1.2.3 Thành phần biofilm s aureus 1.2.4 Các yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến hình thành biofilm s aureus 1.2.5 Các bệnh liên quan đến biofilm s aureus 1.3 Biofilm thất bại điều trị nhiễm khuẩn 1.4 Một số mơ hình biofilm ứng dụng nghiên cứu 10 1.4.1 Mơ hình biofilm in vitro 10 1.4.2 Mơ hình biofilm in vivo 11 1.4.3 Cách đánh giá tiêu thành phần biofilm 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 14 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cúu 16 2.2.1 Khảo sát số môi trường phù hợp cho nuôi cay biofilm s aureus 16 2.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm s aureus 17 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng biìlm số hoạt chất 17 2.3 Phuong pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Chuân bị môi trường hoạt hóa chủng 17 2.3.2 Phưong pháp nuôi cấy tạo biofilm s aureus trênđĩa96 giếng 17 2.3.3 Phương pháp đánh giá tiêu biofilm 18 2.3.4 Phưong pháp chuẩn bị mẫu thử 19 2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm sốdược liệu 19 2.3.6 Phương pháp thống kê 20 CHƯƠNG KẾT QƯẢ 21 3.1 Khảo sát số môi trường phù họp cho nuôi cấy biofiim s aureus 21 3.2 Khảo sát thịi gian ni cấy tạo biofilm s aureus 24 3.3 Đánh giá tác dụng kháng biofilm số hoạt chất 25 3.3.1 Sàng lọc hoạt tính kháng biofilm số dược liệu Việt Nam 25 3.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng biofilm cao ổi (DHN10) 26 BÃN LUẬN 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ Collection BHI Brain Heart Infusion c albicans Candida albicans CFU Colony Forming Unit Đơn vị• hình thành khuấn lạc • cv Crystal violet Tím tinh thể DMSO Dimethyl sulfoxide eDNA extracellular DNA Kháng sinh KS MDK ADN ngoại bào Minimum duration for killing Thời gian tối thiểu để kháng sinh tiêu diệt lượng xác định vsv Mxf Moxifloxacin Moxifloxacin MHB Mueller Hinton broth Mueller Hinton long MIC Minimum Inhibitory Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh Concentration vật Methicillin-resistant Staphylococcus aureus kháng Staphylococcus aureus methicillin Methicillin-susceptible Staphylococcus Staphylococcus aureus cảm với methicillin Phosphate-Buffered Saline pH Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 7.4 Polysaccharide intercellular Chất adhesin polysaccharide MRSA MSSA PBS PIA PNAG kết aureus dính Poly-P-1,6-N-acetyl-Dglucosamine RF Resorufin Resorufin s aureus Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng TGN TSB-glucose-NaCl TSA Tryptic Soy Agar Thạch Tryptic Soy TSB Tryptic Soy broth Tryptic Soy lỏng Van Vancomycin Vancomycin vsv Vi sinh vật • liên nhạy bào DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Thành phần môi trường 15 Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 3.1 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF mẫu dược liệu có khả diệt s aureus biofilm so với mẫu chứng 26 Bảng 3.2 Tỉ lệ % giá trị tống sinh khối biofilm mẫu cao tống phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2CI2) 26 Bảng 3.3 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2CI2) 27 Bảng 3.4 Lượng vsv biofilm (logio CFƯ/ml) mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2CI2) 27 Bảng 3.5 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 29 Bảng 3.6 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 30 Bảng 3.7 Lượng vsv biofilm (logio CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỊ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm s aureus Hình 1.3 Mơ hình hình thành biofilm s aureus giai đoạn Hình 2.1 Sự chuyển màu từ resazurin màu xanh sang resorufin màu hồng 19 Hình 2.2 Mơ tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng biofilm 20 Hình 3.1 Lượng vsv biofilm 24h (logio CFƯ/ml) tổng sinhkhối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường TSB có bố sung thành phần 21 Hình 3.2 Lượng vsv biofilm 24h (log 10 CFƯ/ml) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với mơi trường BHI có bố sung thành phần 21 Hình 3.3 Lượng vsv biofilm 24h (log 10 CFƯ/ml) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường MHB có bổ sung thành phần 22 Hình 3.4 Lượng vsv biofilm 24h (log 10 CFƯ/ml) (1A) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV)(1B), thực với môi trường nuôi cấy khác 23 Hình 3.5 Lượng vsv biofilm (logio CFƯ/ml) tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thời điểm 6h, 24h, 48h 72h 24 Hình 3.6 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm mẫu cao tổng phân đoạn H2O, nhexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2CI2) 27 Hình 3.7 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng vsv biofilm (logio CFU/ml) cùa mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2CI2) 28 Hình 3.8 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 29 Hình 3.9 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng vsv biofilm (logio CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus (S aureus) hay gọi tụ cầu vàng, coi tác nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm khuẩn từ đơn giản đến phức tạp Điều trị nhiễm khuẩn s aureus gặp nhiều khó khăn, khơng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh đa dạng yếu tố độc lực, mà tồn kiểu hình dai dẳng khả bám dính hình thành biofilm bề mặt khác vi khuẩn [15] Trong số nhiều loại nhiễm khuẩn gây s aureus, nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm thường gây nên nhiều thách thức điều trị [35] Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuấn người, đặc biệt bệnh có biểu dai dắng tái phát [24] Cuộc chiến chống lại biofilm chiến khó khăn tình trạng tình trạng đáp ứng với kháng sinh vi khuấn biofilm Vì vậy, việc tìm hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm điều quan trọng Trong bối cảnh này, thực vật nguồn cung cấp phong phú tiềm [13] Biofilm s aureus đĩa 96 giếng công cụ hiệu để sàng lọc nghiên cứu hoạt chất có khả kháng biofilm, với lợi vượt trội giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, nhiều điều kiện thí nghiệm thực thời điểm Với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm s aureus có nguồn gốc từ thực vật Việt Nam, thực đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm Staphylococcus aureus đĩa 96 giếng đánh giá khả kháng biìlm số cao dưọc liệu” với 03 mục tiêu sau: Khảo sát số môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm s aureus Khảo sát thời gian điều kiện nuôi cay biofilm aureus Đánh giá khả kháng biofilm s aureus số cao chiết dược liệu CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Tổng quan Staphylococcus aureus 1.1.1 Giói thiệu ve Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus lần xác định vào năm 1884 Anton Rosenbach, bác sĩ phẫu thuật người Đức [27], [28] s aureus thành viên cúa chi Staphylococcus Các thuật ngữ Staphylococcus đề xuất Sir Alexander Ogston từ tiếng Hy Lạp (staphyle nghĩa chùm nho) xếp đặc trưng thành cụm [6], [27] Hình ỉ ỉ Hình ảnh vỉ khuân Staphylococcus aureus [42] Trái: hình ảnh kính hiển vi; Phải: hình ảnh kính hiển vỉ điện tử Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), s aureus xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [6] s aureus phân biệt với loài tụ cầu khác sở sắc tố vàng khuẩn lạc, kết dương tính cùa phép thử coagulase, lên men đường mannitol deoxyribonuclease [23] 1.1.2 Đặc điểm hình thái, tính chất ni cấy s aureus vi khuẩn Gram dương không di động, đặc trưng cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 Ịim, vi khuẩn kỵ khí đa dạng [6] Tụ cầu vàng s aureus chịu nhiệt độ cao tới 60°C vòng 30 phút nồng độ muối cao tới 10% [9] Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuấn lạc đường kính 1- 2mm, nhẵn Sau 24 37°c, khuấn lạc thường có màu vàng chanh Trên mơi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn tồn [1] Trên mơi trường thạch manitol, tụ cầu vàng lên men manitol tạo vùng màu vàng xung quanh khuẩn lạc [9] Trên môi trường canh thang, tụ cầu vàng làm đục mơi trường, để lâu lắng cặn [1] Từ kết sau nhuộm với tím tinh thể, nhận thấy phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 không làm giảm tổng sinh khối biofilm so với mẫu chứng (không bổ sung dược liệu, kháng sinh), điều kiện thực nghiệm có bổ sung kháng sinh, không bổ sung kháng sinh Bảng 3.6 Tỉ lệ % giả trị huỳnh quang RF phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 RF % Chứng 1.1 1.2 1.3 100,0 33,6 40,8 27,7 ±10,2 ±4,1 ±2,6 ±3,0 TGN + 93,1 18,4 19,7 19,9 MXF ±13,6 ±0.7 ±0,8 ±5,0 116,5 26,1 27,2 22,9 ±20,4 ±0,1 ±4,3 ±2,9 TGN TGN + Van 1.4 113,3 86,5 128,5 Kết biếu tỷ lệ % mẫu thử so với mẫu chứng khơng KS, dạng trung bình ± sai số : : - : : - :—7 -: - : - ' Kêt chuyên hóa resazurin cho thây phân đoạn 1.1, 1.2 1.3 đêu có tác dụng tốt đối tượng vi khuẩn biofilm Khi sử dụng đon có khả ức chế 59,2-72,3% chuyền hóa, kết hợp với kháng sinh có khả ức chế 72,7-81,6% chuyến hóa vsv Phân đoạn 1.4 khơng có tác dụng với vi khuẩn bioTilm Bảng 3.7 Lượng vsv biofilm (logio CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 log CFU/ml TGN TGN + Mxf TGN + Van Ị ' Chứng 1.1 1.2 1.3 8,17 7,77 7,66 7,76 ±0,01 ±0,07 ±0,35 ±0,21 7,79 5,03 7,10 4,40 ±0,04 ±0,48 ±0,56 ±0,94 8,22 7,66 7,26 6,51 ±0,03 ±0,08 ±0,18 ±2,23 Phương pháp đêm CFƯ đà mâu 1.1, 1.2, 1.3 sử dụng dạng đơn hay kết hợp với moxifloxacin có có khả diệt vi sinh vật biofilm Sự khác biệt có ý nghĩ thống kê, sử dụng One-way ANO VA, với test so sánh Dunnett, tất mẫu thử so sánh mẫu với mẫu chứng (TGN không bổ sung dược liệu, kháng sinh) Mầu 1.1 1.3 diệt vi khuẩn biofilm tốt Phân đoạn 1.1 có khả diệt 0,4 log 10 CFU/ml dạng đơn, 3,14 log 10 CFU/ml kết hợp với moxifloxacin, 0,51 logio CFƯ/ml kết hợp với vancomycin Phân đoạn 1.3 có khả diệt 0,41 log 10 CFƯ/ml dạng đơn, 3,77 logio CFƯ/ml kết hợp với moxifloxacin, 1,66 logio CFƯ/ml kết hợp với vancomycin (diệt log 10 CFU/ml tương đương với 99,9% VSV) 30 TGN TGN 9-J p < 0.05 125-1 RF % 1004 75 50 25 TGN + Mxf RF % 125-1 TGN + Van RF % 150n Hình 3.9 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng vsv biofilm (logio CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 31 BÃN LUẬN việc xây dựng mơ hình biofilm đĩa 96 giếng Nghiên cứu chọn môi trường phù hợp để ni cấy biofilm đìa 96 giếng TSB có bổ sung NaCl 2% glucose 1% Khi sử dụng môi trường này, biofilm tạo có tổng sinh khối số lượng vsv biofilm cao môi trường thử nghiệm Khi bổ sung NaCl, glucose đồng thời NaCl glucose vào TSB, nhận thấy gia tăng số lượng vsv tổng sinh khối biofilm Điều tương đồng với nhiều thử nghiệm trước Nghiên cứu Lade cộng sử dụng 40 chủng s aureus chọn ngẫu nhiên (21 MRSA 19 MSSA) Môi trường sử dụng TSB, TSB bổ sung 0,5% 1,0% glucose, 1,0% 2,0% NaCl, 1,0% glucose 1,0% NaCl Kết cho thấy bổ sung glucose NaCl thúc đẩy hình thành biofilm chủng thử nghiệm Nghiên cứu nhận thấy việc bổ sung glucose % tạo biofilm phát triển mạnh thích họp cho việc định lượng, biến đối lần thí nghiệm [18] Nghiên cứu chọn thời điểm nuôi cấy ngày để tạo biofilm (biofilm 24 giờ) Môi trường nuôi biofilm thay mới, biofilm sử dụng đế đánh giá hoạt lực kháng biofilm Với thời gian điều kiện nuôi cấy này, biofilm tạo đáp ứng hai yêu cầu (1) biofilm hoàn chỉnh (2) biofilm ổn định theo thời gian Một số nghiên cứu khảo sát hình thành biofilm đĩa 96 giếng thời điểm khác cho thấy biofilm hình thành ổn định tốt khoảng từ 18 đến 24 [3], [34] sàng lọc hoạt tính kháng biofilm dược liệu Nghiên cứu cho thấy 300 mẫu thực sàng lọc, có 11 mẫu, chiếm tỷ lệ 3,6%, có khả diệt s aureus biofilm, dạng đơn lẻ kết hợp với kháng sinh Đây tỉ lệ cho thấy tiềm cung cấp hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm từ thực vật Một số nghiên cứu sàng lọc tác dụng kháng biofilm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên thực Nghiên cứu sàng lọc 106 hợp chất từ nấm biển cho thấy 12 hợp chất có tác dụng ức chế hình thành biìlm aureus nồng độ 100 pg/ml [39] Tuy nhiên khả diệt vi sinh vật biofilm trưởng thành khó nhiều so với ức chế hình thành biofilm Chúng tồi đánh giá hợp chất đà sàng lọc khả ức chế hình thành biofilm Theo quan điếm nhóm nghiên cứu khả cao hợp chất có khả ức chế hình thành biofilm hoạt tính kháng biofilm cao ổi phân đoạn: Nghiên cứu cho thấy cao chiết ổi phân đoạn có hoạt tính kháng biofilm cùa s aureus ATCC 33591 Phân đoạn dicloromethan phân đoạn có tác dụng tốt 32 Từ chọn phân đoạn cho chạy cột silicagel với dung mơi cloroform 100% với mục đích làm giàu tách phân đoạn nhỏ, tách phân đoạn nhỏ 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 tiến hành thử hoạt tính Đà có số nghiên cứu khả kháng biofilm hoạt chất chiết xuất từ thực vật thực Dựa nghiên cứu chiết xuất thực vật, Quave cộng tìm phân đoạn cao chiết kháng hình thành biofilms s aureus Nghiên cứu chứng minh phân đoạn 220D-F2 (phân đoạn thu từ cao chiết ethanol rễ Rubus ulmiíồlius) có diện ellagic acid chất dẫn xuất có khả giới hạn hình thành biofilm có tiềm làm tăng khả nhạy với kháng sinh Tất dòng s aureus kiểm tra có biểu giảm hình thành biofilm tác dụng phân đoạn 220D-F2 nồng độ từ 50-200 mg/1 phát triến vi khuẩn bị giới hạn nồng độ 530-1040 mg/1 [29] Quelemes đồng tác giả nghiên cứu ảnh hưởng cao chiết Neem hình thành biofilm Kết cao chiết ethanol từ Neem có tác dụng ức chế hình thành biofilm chủng vi khuẩn MRS A tế bào phù du [30] Dữ liệu từ nghiên cứu Wen cộng cho thấy tiềm flavonoid naringenin từ chi Citrus tác nhân tự nhiên để ngăn ngừa hình thành biofilm s aureus làm giảm nguy sức khỏe liên quan đến hình thành biofilm ngành công nghiệp thực phâm [40] Một nghiên cứu Việt Nam cho thấy phân đoạn ethylacetate trâm trịn cho hoạt tính ức chế hình thành biofilm hai chủng MSSA ATCC 6538 MRSA ATCC 33591, so với đối chứng Nồng độ cao phân đoạn ethylacetate trâm tròn 0,25 mg/mL [2] Khi tiến hành đánh giá hoạt tính phân đoạn nhỏ tách từ phân đoạn dicloromethan, phân đoạn 1.1 1.3 kết hợp với Mxf 1.5mg/l có khả diệt log 10 CFU Một nghiên cứu tác dụng số kháng sinh lên biofilm s aureus mơ hình đĩa 96 giếng cho thấy đạt tác dụng diệt khuẩn giảm log 10 CFU [10] Do đó, thấy phân đoạn 1.1 1.3 đối tượng tiềm đề nghiên cứu phân lập hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm hiệu 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đà chọn mơi trường TSB có bổ sung NaCl 2% glucose % môi trường phù hợp đề tạo biofilm đìa 96 giếng Đà chọn thời điểm nuôi cấy ngày để tạo biofilm (biofilm 24 giờ) Môi trường nuôi biofilm thay 24 giờ, biofilm sử dụng để đánh giá hoạt lực kháng biofilm Với thời gian điều kiện nuôi cấy này, biofilm tạo đáp ứng hai yêu cầu (1) biofilm hoàn chỉnh (2) biofilm ổn định theo thời gian Đà đánh giá hoạt tính kháng biofilm sổ mẫu cao dược liệu Việt Nam, xác định 11 mẫu cao có khả diệt biofilm, sử dụng đơn kết hợp với moxifloxacin vancomycin Mầu cao ối đánh giá chi tiết hon phân đoạn, cho phân đoạn dicloromethan tiểu phân đoạn dicloromethan có hoạt lực tốt với đối tượng vi khuẩn biofilm Từ kết thu chúng tơi có số kiến nghị: > Tiếp tục tiến hành đánh giá hoạt tính kháng biofilm mẫu cao chiết có tác dụng diệt s aureus biofilm > Tiến hành tách chất tinh khiết từ phân đoạn 1.1 1.3 dicloromethan cao chiết ối để tiến hành đánh giá hoạt tính kháng biofilm s aureus 34 TÃI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật ỵ học Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Dương Chí Ái, Lý Hồng Giáp, Hồng Anh Hồng, Thanh Trương Vũ "Hoạt tính kháng hình thành biofilm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ phân đoạn ethyl acetate trâm tròn (Syzygium glomeratum)" Tiếng Anh Arce Miranda J E., Sotomayor c E., Albesa L, Paraje M G (2011), "Oxidative and nitrosative stress in Staphylococcus aureus biofilm", FEMS Microbiol Lett, 315(1), pp 23-9 Archer N K., Mazaitis M J., Costerton J w., Leid J G., Powers M E., Shirtliff M E (2011), "Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease", Virulence, 2(5), pp 445-59 Balaban N Q., Helaine s., Lewis K., Ackermann M., Aldridge B., Andersson D L, Brynildsen M p., Bumann D., Camilli A., Collins J J., Dehio c., Fortune s., Ghigo J M., Hardt w D., Harms A., Heinemann M., Hung D T., Jenal Ư., Levin B R., Michiels J., Storz G., Tan M w., Tenson T., Van Melderen L., Zinkernagel A (2019), "Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence", Nat Rev Microbiol, 17(7), pp 441-448 Bergey David Hendricks (2001), Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology, Springer Science & Business Media Bhattacharya M., Wozniak D J., Stoodley p., Hall-Stoodley L (2015), "Prevention and treatment of Staphylococcus aureus biofilms", Expert Rev Anti Infect Ther, 13(12), pp 1499-516 Coenye T., Nelis H J (2010), "In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation", J Microbiol Methods, 83(2), pp 89-105 Crossley Kent B, Jefferson Kimberly K, Archer Gordon L, Fowler Jr Vance G (2009), Staphylococci in human disease 10 Diaz Iglesias Y., Wilms T., Vanbever R., Van Bambeke F (2019), "Activity of Antibiotics against Staphylococcus aureus in an In Vitro Model of Biofilms in the Context of Cystic Fibrosis: Influence of the Culture Medium", Antimicrob Agents Chemother, 63(7) 11 Elgharably H., Hussain s T., Shrestha N K., Blackstone E H., Pettersson G B (2016), "Current Hypotheses in Cardiac Surgery: Biofilm in Infective Endocarditis", Semin Thorac Cardiovasc Surg, 28(1), pp 56-9 12 Guerin T F., Mondido M., McClenn B., Peasley B (2001), "Application of resazurin for estimating abundance of contaminant-degrading micro-organisms", Lett Appl Microbiol, 32(5), pp 340-5 13 Guzzo F., Scognamiglio M., Fiorentino A., Buommino E., D'Abrosca B (2020), "Plant Derived Natural Products against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus: Antibiofilm Activity and Molecular Mechanisms", Molecules, 25(21) 14 Helaine s., Kugelberg E (2014), "Bacterial persisters: formation, eradication, and experimental systems", Trends Microbiol, 22(7), pp 417-24 15 Jaskiewicz M., Janczura A., Nowicka J., Kamysz w (2019), "Methods Used for the Eradication of Staphylococcal Biofilms", Antibiotics (Basel), 8(4) 16 Kim Bo-Ram, Bae Young-Min, Lee Sun-Young %J Journal of Food Safety (2016), "Effect of environmental conditions on biofilm formation and related characteristics of Staphylococcus aureus", 36(3), pp 412-422 17 Kranjec c., Morales Angeles D., Torrissen Mârli M., Fernandez L., García p., Kjos M., Diep D B (2021), "Staphylococcal Biofilms: Challenges and Novel Therapeutic Perspectives", Antibiotics (Basel), 10(2) 18 Lade H., Park J FL, Chung s H., Kim I FL, Kim J M., Joo H s., Kim J s (2019), "Biofilm Formation by Staphylococcus aureus Clinical Isolates is Differentially Affected by Glucose and Sodium Chloride Supplemented Culture Media", J Clin Med, 8(11) 19 Lakhundi s., Zhang K (2018), "Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Molecular Characterization, Evolution, and Epidemiology", Clin Microbiol Rev, 20 31(4) Lister J L., Horswill A R (2014), "Staphylococcus aureus biofilms: recent developments in biofilm dispersal", Front Cell Infect Microbiol, 4, pp 178 21 Liu Y., Zhang J., Ji Y (2020), "Environmental factors modulate biofilm formation by Staphylococcus aureus", Sci Prog, 103(1), pp 36850419898659 22 Lopez D., Vlamakis FL, Kolter R (2010), "Biofilms", Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(7), pp a000398 23 Lowy F D (1998), "Staphylococcus aureus infections", N Engl J Med, 339(8), pp 520-32 24 Macia M D., Rojo-Molinero E., Oliver A (2014), "Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria", Clin Microbiol Infect, 20(10), pp 981-90 25 Mariscal A., Lopez-Gigosos R M., Carnero-Varo M., Fernandez-Crehuet J (2009), "Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm", Appl Microbiol Biotechnol, 82(4), pp 773-83 26 Moormeier D E., Bayles K w (2017), "Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism", Mol Microbiol, 104(3), pp 365-376 27 Myles I A., Datta s K (2012), "Staphylococcus aureus: an introduction", Semin Immunopathol, 34(2), pp 181-4 28 Oliveira D., Borges A., Simões M (2018), "Staphylococcus aureus Toxins and Their Molecular Activity in Infectious Diseases", Toxins (Basel), 10(6) 29 Oliveira w F., Silva p M s., Silva R c s., Silva G M M., Machado G., Coelho Lcbb, Correia M T s (2018), "Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis infections on implants", J Hosp Infect, 98(2), pp 111-117 30 Otto M (2018), "Staphylococcal Biofilms", Microbiol Spectr, 6(4) 31 Peeters E., Nelis H J., Coenye T (2008), "Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates", J Microbiol Methods, 72(2), pp 157-65 32 Poilvache FL, Ruiz-Sorribas A., Cornu o., Van Bambeke F (2021), "In Vitro Study of the Synergistic Effect of an Enzyme Cocktail and Antibiotics against Biofilms in a Prosthetic Joint Infection Model", Antimicrob Agents Chemother 33 Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Sakoulas G., Rodriguez-Villalobos H., Cornu o., Van Bambeke F (2020), "Synergistic Effects of Pulsed Lavage and Antimicrobial Therapy Against Staphylococcus aureus Biofilms in an in-vitro Model", Front Med (Lausanne), 7, pp 527 34 Sandberg M., Mããttănen A., Peltonen J., Vuorela p M., Fallarero A (2008), "Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds", Int J Antimicrob Agents, 32(3), pp 233-40 35 Schilcher K., Horswill A R (2020), "Staphylococcal Biofilm Development: Structure, Regulation, and Treatment Strategies", Microbiol Mol Biol Rev, 84(3) 36 Siala w., Kucharíková s., Braem A., Vleugels J., Tulkens p M., MingeotLeclercq M p., Van Dijck p., Van Bambeke F (2016), "The antifungal caspofungin increases fluoroquinolone activity against Staphylococcus aureus biofilms by inhibiting N-acetylglucosamine transferase", Nat Commun, 7, pp 13286 37 Song F., Koo FL, Ren D (2015), "Effects of Material Properties on Bacterial Adhesion and Biofilm Formation", J Dent Res, 94(8), pp 1027-34 38 Thibeaux R., Kainiu M., Goarant c (2020), "Biofilm Formation and Quantification Using the 96-Microtiter Plate", Methods Mol Biol, 2134, pp 207214 39 Wang J., Nong X H., Zhang X Y., Xu X Y., Amin M., Qi s H (2017), "Screening of Anti-Biofilm Compounds from Marine-Derived Fungi and the Effects of Secalonic Acid D on Staphylococcus aureus Biofilm", J Microbiol Biotechnol, 27(6), pp 1078-1089 40 Wen Q H., Wang R., Zhao s Q., Chen B R., Zeng X A (2021), "Inhibition of Biofilm Formation of Foodborne Staphylococcus aureus by the Citrus Flavonoid Naringenin", Foods, 10(11) 41 Yin w., Wang Y., Liu L., He J (2019), "Biofilms: The Microbial "Protective Clothing" in Extreme Environments", Int J Mol Sci, 20(14) 42 https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus aureus PHỤ LỤC Quyết định phê duyệt đề tài Khoa học Công nghệ cấp Trường BỘ Y TÉ TRƯỜNG DẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Số: CỌNG HÒA XÀ HỘI CHỦ NGHĨA việt nam Dộc lập - Tự - Hạnh phúc /QĐ-DIIN Hà Nội ngày IXtháng }Qnỗm 2021 QUYÉT ĐỊNH Phê duyệt đề tài Khoa học Công nghệ cắp Tnrừng HIỆU TRƯỜNG TRƯỜNG DẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Cân Quyết định sổ 828/BYT-ỌD ngày 29/9/196ỉ cùa Bộ Y tế việc thành lộp Trường Đợi học Dược Hà Nội; Cân Quy (lịnh quàn lý đề tài KHCN cấp Trường Dụi học Dược Hà Nội han hành theo Quyết định sổ 769/QD-DHN ngày 15 tháng ỉ năm 202ỉ; Can cử Biên bàn xét duyệt dề tài KHCN cấp Trường ngày 29/9/202! cùa Hội dồng khoa học dược thành lập theo Quyết định số 686/QD-DHN ngày 09/9/2021 cùa Hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà Nội; Theo dề nghị cùa Trưởng phòng Quản lý khoa học QUYÊT ĐỊNH: Diều ỉ Phê duyệt dề tài Khoa học Công nghệ cấp Trường: + Tên đề tài: Nghicn cứu tạo biofilm Staphylococcus aureus đìa 96 giếng, ứng dụng sàng lọc nâng diệt biìlm số dược liệu Việt Nam; • Chù trì de tài: TS Nguyen Khắc Tiệp; + Đơn vj chù tri: Bộ mơn Cơng nghiệp dược; + Kinh phí dược duyệt: 9.980.000 dồng (Bằng chừ: Chín triệu chín tràm tâm mươi nghìn dồng./.); + Thời gian thực hiện: 12 tháng Diều Chủ tri đề tài có trách nhiệm triển khai nội dung nghiên cứu bàn giao sàn phẩm theo dề cương dã dược Hội dồng Khoa học thơng qua Diều Quyết định có hiệu lực kế từ ngày ký Diều Các Ông/Bà trưởng phòng Quản lý Khoa học, l ài chinh Ke tốn, Bộ mơn Cơng nghiệp dược tri dề tài chịu trách nhiệm thi hành Quyết định /Va/ nhận: • Nhưđicu 4; -Lưu: Vĩ QLKH HIỆU TRUỚNG^ẹ 'TRƯỜNG ĐẠI HOCkVV Nguyễn Hãi Nam PHỤ LỤC Bài báo tạp chí Hóa học & ứng dụng NGHIÊN CỨU TẠO BI0FILM CỦA s aureus TRÊN ĐỈA 96 GIẾNG VÀ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG DIỆT s aureus TRONG BI0FILM CỦA MỘT số MẨU Dưộc LIỆU TẠI VIỆT NAM • • ■ • • NGUYỄN KHÁC TIỆP, ĐÀM THANH XUÂN, LÉ NGỌC KHÁNH BÙI THỊ THÚY LUYỆN, TẠ THU LAN, TRẦN THỊ MINH THU, Đỗ THỊ HUYỀN THƯƠNG - Trường Đại học Dược Hả Nội; TỐNG XUẢN QUANG - Trường Cao đảng Y té Thái Binh; LÉ THỊ TÚ ANH - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam SUMMARY: DEVELOPMENT OF s ạureus BIOFILM MODEL ON 96-WELL PLATES AND SCREENING OF ABILITY TO KILL s aureus OF SOME VIETNAMESE MEDICINAL PLANT EXTRACTS Our research focuses on developing an in vitro biofilm model of s aureus ATCC 33591 in 96well plates in the host lab in Viet Nam The result showed that TSB media supplemented with sodium chloride and glucose is a suitable media for biofilm formation After 24h of incubation, biofilm was fully formed with the highest biomass and bacteria number The biofilm was stabilized until 72h if media was refreshed every 24h The biofilm formed after 24h was used to evaluate the ability to kill s aureus in the biofilm of approximately 300 Vietnamese medicinal plant extract samples when used alone or in combination with l.5mg/l moxifloxacin and 20mg/l vancomycin The screening test showed that ỉ I samples could kill s aureus in biofilm in our experiments Therefore, further research can be performed to search for promising anti-biofilm agents from those samples Key words: Biofilm, s aureus, dược liệu, vancomycin, moxifloxacin GIƠI I Biofilm loại màng sinh học liên quan đến 6580% trường hợp nhiém khuẩn người, đặc biệt lầ bệnh có biểu dai dẳng tái phát Tụ cáu vàng Staphylococcus aureus (S aureus) bám dinh tạo biofilm bé mặt sinh học bé mặt nhân tạo Vi khuấn tác nhãn gây bệnh cd hội thường gặp nhiêm trùng chi già, ống thông, cd xương khớp nguyên nhàn chinh gây nhiém trùng dai dẳng tãi phát Biofilm cùa s aureus cộng đống vi khuán s aureus, nằm ma trận hợp chất cao phân tử ngoại bầo, thường bao gôm polysaccharid (Poly-p-1,6N-acetyl-D-glucosamine-PNAG) vi khuẩn nầy tổng hợp nên ADN ngoại bào, protein có ngn gốc từ ly giài té bào vi khuấn Chết[1-4Ị Các vi khuẩn biofilm đáp ứng với kháng sinh Sự đáp ứng liên quan đến số nguyên nhân, có thé phân loại yếu tố liên quan đến dược động học (PK) vầ vầ dược lực học (PD) Hóa học & ứng dụng e§ỐíB IWBl/5-2022 THIỆU cùa thuốc Dược động học (PK) liên quan yếu đến giảm sinh khả dụng hiệu ứng càn trở cùa ma trận biofilm, điéu hạn chế khà tiếp xúc cùa thuốc với cắc vi sinh vật biofilm Với cấu tạo từ polysaccharid, ADN ngoại bầo protein, ma trận biofilm có thé tương tác với thuốc hạn chế khuếch tán cúa thuốc biofilm Cả hai tác động dán tới nông độ thuốc biofilm thấp không phát huy tác dụng Ngay nông độ thuốc biofilm đú cao, đáp ứng cùa cầc vi khuẩn biofilm với kháng sinh không đú nhiêu nguyên nhàn liên quan đến dược lực học (PD) Mịi trường khấc nghiệt biofilm (nơng độ oxy, độ pH giảm, nhiệt độ cao, thiếu chất dinh dưỡng, mật độ vi sinh vật cao), thúc đẩy vi khuẩn chuyên sang kiéu hình giám đáp ứng với kháng sinh Các vi sinh vật biofilm có xu hướng chuyến sang kiéu hình “dai dâng" “dung nạp”, đặc trưng cho phân hoâc tất cà quân thé vi khuấn không đáp ứng với điéu trị kháng sinh Đây lầ hai kiểu hình tién đé cho hình thành kiểu hình chiến lược đé diệt vi khuẩn dai dắng biofilm “kháng kháng sinh" [5-7] quan trọng[5-7] Do đó, có hai chiến lược để diệt vi khuẩn biofilm tác động lên ma trận biofilm tác động lên vi khuẩn dai dẳng biofilm Ma trận biofilm (polysaccharid, protein, ADN ngoại bào) bào vệ vi khuẩn khỏi tác nhân khấng khuẩn, chiến lược để phá vỡ ma trận cân thiết Bên cạnh đó, vi khuẩn có kiểu hình dai dẳng, dung nạp kháng sinh tơn biofilm, dù vói số lượng nhỏ, có khả tơn tác Hiện có thiếu hụt nghiêm trọng kháng sinh hiệu quà điêu trị nhiễm khuẩn Sự thiếu hụt nghiêm trọng với đối tượng vi khuẩn biofilm đối tượng đáp ửng với kháng sinh, làm giàm đáng kể số kháng sinh hiệu quà điéu trị Do việc tìm kiếm hợp chất có diệt aureus biofilm có khà hố trợ kháng sinh diệt aureus biofilm vô cấp thiết Trong báo này, chúng tói động kháng sinh, nóng độ cao hệ mién dịch Khi trình bày vé nghiên cứu tạo biofilm aureus đĩa 96 giếng kết sàng lọc tác dụng diệt s aureus trinh điéu trị kết thúc, nhửng vi khuẩn hoạt động biofilm cùa 300 mâu cao từ dược liệu khác trở lại, khởi tạo nên nhửng nhiém khuẩn mới, Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu Nguyên vật liệu nghiên cứu TGN để đạt nông độ 1000mg/l Dung dịch Máu dược liệu: Trên 300 mấu cao dược liệu cung pha loãng 10 lần TGN (hoặc moxifloxacin nông cấp từ SƯU tập cùa Viện Dược liệu (DL), Viện Hóa học (H), Đại học Cân Thơ (CT) Đại học Dược Hà Nội (DHN) Các mâu cao đánh số chọn ngáu nhiên cho thứ tự thực thí nghiệm Vi sinh vật: Tụ câu vàng kháng methicillin s aureus ATCC 33591 (methicillin resistant Staphylococcus aureus - MRSA) Chùng MRSA chọn sở nghiên cứu trước vé khà tạo biofilm tương đối ổn định chủng Mói trường ni cấy, hóa chất: Mịi trường lóng Muller Hinton (MHB), Brain Heart Infusion (BHI) Tryptic soy (TSB) từ Merck Moxifloxacin, vancomycin, natri resazurin, tim tinh the, dimethyl sulfoxit (DMSO) từ SigmaAldrich Mói trường thạch TSA chuấn bị TSB bổ sung thêm 20g/l thạch bột Đĩa 96 giếng vó trùng, có nấp từ SPL Dung dịch đệm photphat pH 7,4 (Phosphate-buffered saline - PBS) NaCI, Glucose, đáu tip, Petries thủy tinh cùa Trung Quốc độ 1,5mg/l TGN vancomycin nông độ 20mg/l TGN) để đạt dung dịch làm việc 10Omg/L Máu chứng dương khơng kháng sinh máu chì có mỏi trường TGN Máu chửng dương có kháng sinh moxifloxacin có nơng độ 1,5mg/l vancomycin có nơng độ 20mg/l TGN Máu chứng âm lằ máu chi có mói trường TGN khơng có vi sinh vật 2.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm s aureus đĩa 96 giếng Phương pháp tạo biofilm aureus thực tương tự số công bố trước [8,9] Biofilm tạo đĩa 96 giếng đáy SPL, sử dụng nóng độ vi khuẩn 0.005 OD620nm (tương đương 107 CFU/ml), môi trường nuôi cấy phù hợp, thé tích 200pl/giếng ú 37°c thời gian nghiên cứu tương ứng Môi máu thực tối thiểu 10 giếng, mỗt đĩa 96 giếng Máy móc: nơi hấp tiệt khuẩn, tủ lạnh bào quản mấu, Trong thực nghiệm khào sát môi trường nghiên cứu bào quàn môi trường, tủ sấy dụng cụ, tú cáy vị khuẩn, bé chúng tơi thực với TSB, BHI, MHB nguyên bàn, pha siêu âm, máy votex Pipet đơn kênh 1-10, 10-200, 100- lỗng, bổ sung NaCI, bó sung Glucose bố sung đóng 10OOpl Máy đọc vi đĩa huỳnh quang vầ tử ngoại Varioskan Lux Thermofisher thời NaCI Glucose Trong thực nghiệm khảo điéu kiện nghiên cứu, Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp chuẩn bị máu thử Các mấu cao dược liệu chuẩn bị DMSO với nông độ 10000mg/l Trường hợp máu không tan DMSO tan mõi trương ni cấy, thực hịa tan mơi trường ni cấy TSB-Glucose-NaCI (TGN) Loại bị mấu khơng tan DMSO lân TGN Sau hịa tan máu dược liệu pha loãng tiếp chúng tói thực với mốc thời gian 6h, 24h, 48h 72h; với hai điêu kiện thực nghiệm lầ có thay mơi trường dinh dưỡng ngày không thay môi trường dinh dưỡng 2.3 Phương pháp đánh giá chĩ tiêu biofilm Chúng đánh giá chi tiêu cúa biofilm lượng vi sinh vật sống biofilm tống sinh khối mà vi sinh vật tạo đĩa Hóa học & ưng dụng &'ỉB (6OB)/5-2022 Trong thi nghiệm kháo sát môi trường vầ điêu kiện nuôi dương không kháng sinh, mâu chứng dương có khắng sinh cấy tạo biofilm, lượng vi sinh vật sống đánh giắ trực tiếp phương phắp đếm CFU trẽn đĩa thạch Máu cân theo giá trị phân trâm Cường độ huỳnh quang cùa tất cấc mẫu trước so sánh chuẩn hóa bàng cách đếm số lượng CPU sẻ rửa nhẹ nhàng với PBS Vi sinh trừ giắ trị mâu chướng âm (chi có mơi trường TGN, vật biofilm sé phá khỏi biofilm bàng nước cất võ khuẩn, cách hút nhả với pipet tối thiếu 20 lán, sau khơng vi khuẩn) vortex thật ký siêu âm vòng phút cấn, để tách rời hoần tồn khuẩn lạc Máu sau qua việc nhuộm đo hấp thụ với tím tinh (Crystal Violet- CV) Mầu biofilm rửa nhẹ với PBS, loại lượng pha loáng PBS theo số log 10 đến nông độ phù hợp Khuẩn lạc đếm đĩa thạch TSA sau PBS cịn sót với giấy thắm Biofilm sau sấy khô đé cố định 60°C tối thiếu Máu sau cấy trài ù 24h 37°c Nông độ chọn nông sê nhuộm với tím tinh (nơng độ 50mg/l) độ có từ 30-300 khuẩn lạc đĩa vịng 15 phút, nhiệt độ phòng, tránh ấnh sấng Cấc máu Trong thí nghiệm sầng lọc máu cao dược liệu với số lương lớn máu, lượng vi sinh vật sông đánh giá gián tiếp thơng qua khà chuyển hóa resazurine (không huỳnh quang) thành resorufin (phát huỳnh quang) cùa vi sinh vật sống Máu rửa với PBS rói sau ù với Tống lượng sinh khối biofilm đánh giá thơng biofilm sau loại cv dư vầ rửa nhẹ nhàng với nước RO cv gấn vào biofilm sau hịa tan acid acetic 66% vòng tiếng, tránh ánh sáng Các đĩa mâu đo hấp thu uv bước sóng 570nm máy đọc vi đĩa Varioskan Lux 200pl resazurine nông độ 10mg/I nước cất vô khuẩn, 30 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sấng Sau 30 phút ủ, máu đo cường độ huỳnh quang máy Phirong pháp thống kê Số liệu thí nghiệm thô xử lý bàng phán mém Excel đọc vi đĩa Varioskan Lux với bước sóng kích thích vầ phát 2010 Xử lý thống kê biểu diên kết quà phân xạ tương ứng 560 590nm Cường huỳnh quang mấu có dược liệu so sánh với mấu chứng mêm GraphPad 4.0 Số liệu trình bày dang trung bình ± sai số III KET QUA VA THAO LUẬN Khảo sát môi trường phù hợp cho nuôi cấy tạo bioíilm s aureus Thực khào sát với môi trường thương mại phổ biến nuôi cấy vi khuẩn MHB, TSB BHI Ba mòi trường sử dụng dạng nguyên bản, dạng pha loãng, dạng có bổ sung NaCI, Glucose đơng thời NaCI Glucose Kết quà trinh bày Hình Chúng tơi quan thấy cắc mịi trương pha lỗng tạo it biofilm hdn so với mỏi trương nguyên gốc hay môi trương bổ sung NaCI Glucose Việc dùng môi trương nghèo dinh dương không làm tăng khả tạo biofilm vi khuẩn Việc bổ sung NaCI vầ Glucose khơng đem lại tác địng giống nhau, tác động tùy thuộc vào loại môi trường Mơi trương TSB có bổ sung glucose, aureus tạo biofilm bên vửng với số lượng vi sinh vật vầ tổng sinh khối biofilm cao[8, 9] Khảo sát điều kiện nuôi cấy phù hựp tạo biofilm aureus Với mục tiêu chọn điéu kiện nuôi cấy để tạo biofilm hồn chinh ổn định, chủng tơi khảo sát thời gian điều kiện nuôi cấy để tạo biofilm đấp ứng hai yếu tố (i) hồn chình (ii) ổn định theo thời gian (ít lầ ngày sau tạo biofilm hồn chinh) để sử dụng cho việc đánh giá hợp chất có khả diệt aureus biofilm Sử dụng môi trường nuôi cấy TGN, khảo sát thời gian ni cấy để tạo biofilm hồn chinh độ ổn NaCI tăng cường khả tạo biofilm cùa vi khuẩn Mỏi trương TSB bổ sung đóng thời NaCI glucose (TGN) định biofilm theo thời gian Chúng tơi thực hai điêu kiện ni cấy có thay môi trường nuôi cấy môi trương phù hợp cho aureus tạo biofilm đĩa 96 giếng Biofilm 24h cùa s aureus, mỏi trường có lượng vi khuẩn biofilm lớn (đánh giá theo log10 24h không thay mỏi trương nuôi cấy Kết quâ thể Hình CFU/ml) tổng lượng sinh khối biofilm cao (đánh giá trị cv CFU đạt mức tối đa Với mấu có thay giá theo độ hấp thụ cùa tím tinh thể - cv absorbance), mõi trương hàng ngày, hai chi tiêu CFU (vi sinh vật sống) cv (tổng sinh khối), khơng có khác biệt có ý so với môi trường khảo Kết quà chúng tói tương tự với số nghiên cứu khác, mỏi trương TSB bổ sung glucose NaCI ni cấy phù hợp để Hóa học & ứng dụng 0.05 2.5-1 E p LL 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 Time (h) 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 Time (h) Hình Lượng vi sinh vật biofilm (log10 CFU/ml) (trái) tổng sinh khối biofilm (CV absorbance) (phài) thời điểm 6h, 24h, 48h 72h (—), ni cấy có thay trường ni cấy mói 24h (—), ni cấy khơng thay mói trường Giá trị p: so sánh với thời điểm 24h Máu Dạng đơn + Van + MXF Chứng 100,014,0 91,317,2 90,617,2 DL21 91,410,8 61,8159,5 50.8=0,6 DL27 93,1110,5 58,910,7 57,111,6 DL29 69,619,8 41,112,1 42,518,6 DL58 103,011,2 66116,8 54.512,3 DL87 17,716.6 12,113,9 10,913,4 DL396 124,5^14,9 76,3117,2 52,8110,4 DL491 121,0115,9 58,316,4 44,416,8 H1 134.4112,0 63,5110,7 60,613,6 CT2 68216,5 59,513,8 53,113,6 DHN10 58.317,3 49 710,1 51,0=0,3 DHN15 14,312.5 14,912,1 12,312,0 Hóa học & ưng dụng 5-2022 Hình Giá trị huỳnh quang RF máu dược liệu có khà diệt aureus biotilm điéu kiện sử dụng đơn (A), kết hợp với vancomycin nóng độ 20mg/l (B) moxifloxacin nóng độ 1,5mg/l (0 bâng số liệu cùa chúng (—), giá trị giám 25% RF so với máu chứng dương Sàng lọc khả diệt s aureus biìlm cùa số mẫu dược liệu Việt Nam Nghiên cứu thực với máu cao dược liệu khác Việt Nam, sàng lọc tác dụng diệt aureus biofilm với điéu kiện khác (i) dạng đơn, (ii) kết hợp với moxiíloxacin nơng độ 1,5mg/l, vầ (ii) kết hợp với vancomycin nông độ 20mg/l Hai nong độ tương ứng với nông độ tối đa cùa kháng sinh mâu Moxiíloxacin kháng sinh hiệu quà diệt vi khuẩn biofilm Vancomycin tiêu chuẩn vàng điéu tộ tụ cáu vàng MRSA [1,3-5] Các máu so sánh với chứng dương thực đỉa 96 giếng Các máu làm giàm > 25% giá trị RF (đánh giá mức độ chuyển hóa cùa vi sinh vật sống) so với mẫu chứng dương điéu kiện coi máu có khà diệt s aureus biofilm Thí nghiệm thực lán độc lập Trong 300 máu thực sáng lọc, có 11 máu (3,6%) có khả diệt s aureus biofilm, dạng đơn lẻ kết hợp với kháng sinh Khà diệt khuân 11 mâu điéu kiện thực nghiệm chúng tơi trình bày Hình Trong sõ đó, chi có mấu có khả diệt aureus biofilm dạng đơn lẻ Khi kết hợp với kháng sinh, gán tất mâu đéu cho tháy khà tăng cường tác dụng diệt khuẩn cúa kháng sinh diệt 25% số s aureus biofilm so với máu chứng dương điéu kiện thực nghiệm IV KÉT LUẬN Nghiên cứu đà thiết lặp điéu kiện mói trương ni cấy để tạo biofilm hồn chinh ổn định s aureus trẽn đĩa 96 giếng Mó hình ứng dụng sàng lọc mâu dược liệu có khà diệt s aureus biofilm Cán có nghiên cứu sàu vé hóa thực vật chế tác dụng cúa hợp chất đối tương vỉ khuẩn biofilm nhầm ứng dụng vào thực tiên điéu trị Hóa học & ứng dụng é)(' /B 5-2022 TÀI LIỆU THAM KHÁO [1] Otto M Staphylococcal Biofilms Microbiol Spectr (2018) [2] Hall-Stoodley L el al Bacterial biofilms: From the natual environment to infectious diseases Nat Rev Microbiol 2, 95-108 (2004) [3] Archer N K et al Staphylococcus aureus biofilms: Properties, regulation and roles in human disease Virulence vol 445-459 (2011) [4] Oliveira w E et al Staphylococcus aureus and Stapylococcus epidermidis infections on implants J Hosp Infect 98 111-117 (2018) [5] Hoiby N et al ESCMID* guideline for the diagnosis and treatment of biofilm infections 2014 Clin Microbiol Infect 21, S1 S25 (2015) [6] Martin c et al Strategies for Antimicrobial Drug Delivery to Biofilm Curr Pharm Des 21,43-66 (2014) [7] Helaine s & Kugelberg E Bacterial persistcrs: Formation, eradication, and experimental systems Trends in Microbiology vol 22 417—424 (2014) [8] Siala w Ct al The antifungal caspofungin increases fluoroquinolone activity against Staphylococcus aureus biofilms by inhibiting N-acetylglucosaminc transferase Nat Commun 7, (2016) [9] Iglesias Y D et al Activity of antibiotics against staphylococcus aureus in an in vitro model of biofilms in die context of cystic fibrosis: influence of the culture medium Antimicrob Agents Chcmodicr 63, (2019) ••• Lời cám ơn: Nghiên cửu tài trợ đề tài câp Trường Đợi học Dược Hà Nội, theo định số 798/QĐ-DHN nỏm 2021 Chúng tơi cảm ơn cóc cớ nhân, đơn vị gửi mẫu cao dược liệu cho nghiên cứu, KTV Phọm Thị Thanh Huyền, môn Công nghiệp Dược, Trường Đợi học Dược Hà Nội hô trợ kỹ thuột trình nghiên cứu Phàn biện: PGS, TS PHÙNG THANH HƯƠNG