BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI vũ THÀNH LẬP NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN MỘT SÔ BỀ MẶT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2023 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI[.]
BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI vũ THÀNH LẬP NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN MỘT SƠ BỀ MẶT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2023 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI vũ THÀNH LẬP 1801365 NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ _ BIOFILM CUA Staphylococcus aureus TRÊN MỘT SƠ BỀ MẶT KHĨA LUẬN TỔT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Khắc Tiệp TS Lê Thị Tú Anh Nơi thực hiện: Bộ• mơn Cơngơ nghệ • sinh học • dược • Khoa Cơng nghệ sinh học HÃ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, nguời thầy tận tình huớng dẫn, giúp đỡ, quan tâm động viên em trình nghiên cứu khoa học thực đề tài khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, TS Lê Thị Tú Anh quan tâm, giúp đỡ, tận tình bảo để em có hướng đắn suổt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công nghệ sinh học Dược, khoa Công nghệ sinh học- Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, suốt năm học đại học truyền đạt cho em kiến thức vô quý báu để em tự tin tháng ngày tới Em xin cảm ơn chị Trần Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương người bạn em thực nghiên cứu môn, động viên giúp đỡ em, đạt mục tiêu Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người hậu phương vững chắc, động lực tinh thần to lớn để em vững bước Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Lập Vũ Thành Lập MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VÈ DANH MỤC CÁC BẢNG, KÍ HIỆU ĐẶT VẨN ĐỀ CHƯƠNG I TỐNG QUAN 1.1 Tổng quan s aureus 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Hình thái tính chất 1.1.3 Khả gây bệnh 1.2 Tống quan biofilm s aureus 1.2.1 Giới thiệu biofilm 1.2.2 Thành phần giai đoạn hình thành biofilm s.aureus vật liệu 1.2.3 Thành phần biofilm 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng hình thành biofilm 1.2.5 Yeu tố bề mặt hình thành biofilm 1.2.6 Biofilm nhiễm trùng thiết bi 1.2.7 Một số bệnh liên quan đến biofilm 1.3 Một số mơ hình biofilm nghiên cứu 1.3.1 Mơ hình in vitro 1.3.2 Cách đánh giá tiêu thành phần biofilm 1.4 Sự cần thiết nghiên cứu hình thành biofilm bề mặt 10 1.4.1 Be mặt nhựa 11 1.4.2 Bề mặt dây truyền 12 1.4.3 Bề mặt sắt nhôm 12 1.4.4 Be mặt kính 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 13 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 13 2.1.2 Hóa chất .13 2.1.3 Thiết bị 14 2.2 Nội dung 15 2.2.1 Tạo đánh giá biofilm bề mặt dây truyền 15 2.2.2 Tạo đánh giá biofilm mộtsố bề mặt khác .15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Chuẩn bị môi trường 16 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm bề mặt dâytruyền 16 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm bề mặt khác 16 2.3.4 Phương pháp đánh giá biofilm 17 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Đánh giá hình thành biofilm bề mặt dây truyền 18 3.2 Đánh giá hình thành biofilm bề mặt khác 19 3.2.1 Bề mặt sắt 19 3.2.2 Bề mặt kính 20 3.2.3 Bề mặt nhôm 21 3.2.4 Bề mặt nhựa 22 3.3 So sánh giừa bề mặt 23 BÀN LUẬN 26 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ Collection BHI Brain Heart Infusion CFU Colony Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc cv Crystal violet Tím tinh thể DMSO Dimethyl sulfoxide eDNA extracellular DNA ADN ngoại bào Kháng sinh KS MDK Minimum duration for killing Thời gian tối thiểu đề kháng sinh tiêu diệt lượng xác định vsv MHB Mueller Hinton broth Mueller Hinton long MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus kháng Staphylococcus aureus methicillin Methicillin-susceptible Staphylococcus Staphylococcus aureus cảm với methicillin Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 Polysaccharide intercellular Chất Adhesin polysaccharide MSSA PBS PIA PNAG kết aureus dính Poly-P-1,6-N-acetyl-Dglucosamine s aureus Staphylococcus aureus TGN TSB vsv Tụ cầu vàng TSB-glucose-NaCl Tryptic Soy broth Tryptic Soy long Vi sinh vật liên nhạy bào DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thiết bị y tế liên quan hình thành biofilm Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.3 Thành phần môi trường 16 Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.1Giá trị cv log CFƯ bề mặt dây truyền 20 Bảng 3.2Giá trị cv log CFƯ bề mặt sắt 21 Bảng 3.3Giá trị cv log CFU bề mặt kính 22 Bảng 3.4Giá trị cv log CFU bề mặt nhôm 24 Bảng 3.5Giá trị cv log CFU bề mặt nhựa 25 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỊ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 1.2 giai đoạn hình thành biofilm Hình 1.3 Màng biofilm hình thành bề mặt ống thẩm phân phúc mạc Hình 1.4 Biofilm s aureus đìa 96 giếng bề mặt miếng titan 11 Hình 1.5 Quá trình khử resazurin 11 Hình 3.1 Giá trị cv log CFU bề mặt dây truyền 20 Hình 3.2 Giá trị cv log CFU bề mặt sắt 21 Hình 3.3 Giá trị cv log CFU bề mặt kính 23 Hình 3.4 Giá trị cv log CFU bề mặt nhôm 24 Hình 3.5 Giá trị cv log CFU bề mặt nhựa 25 Hình 3.6 Giá trị cv log CFU bề mặt thời điểm 24h 48h 26 Hình 3.6 Giá trị cv log CFU thời điểm 24h bề mặt 26 ĐẶT VẤN ĐÈ Staphylococcus aureus coi tác nhân gây bệnh hàng đầu nguyên nhân chủ yếu bệnh nhiễm trùng cộng đồng nhiễm trùng bệnh viện Việc điều trị nhiễm trùng s aureus gặp nhiều khó khăn, khơng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đa dạng yếu tố độc lực mà tạo ra, mà cịn khả hình thành biofilm bề mặt khác vi khuẩn [20] Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn người, đặc biệt bệnh có biểu dai dẳng tái phát [25] Khả hình thành màng biofilm s aureus khiến chúng có khả kháng hóa chất trị liệu cao dẫn đến bệnh mãn tính Những nhiễm trùng biofilm bao gồm viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng thiết bị y tế [30] Hàng triệu thiết bị y tế xâm nhập cấy vào thể bệnh nhân năm aureus thủ phạm gây lây nhiễm hỏng hóc chúng, s aureus biết lây nhiễm hình thành biofilm mãn tính phận cấy ghép chỉnh hình bao gồm khớp giả, dây, ghim, thiết bị cố định bên ngồi, tấm, vít, đinh mảnh cấy ghép mảnh nhỏ Các thiết bị y tế xâm nhập khác dễ bị hình thành biofilm bao gồm stent động mạch, máy thở, ống thông tĩnh mạch, thiết bị đo huyết áp xâm lấn, bơm truyền dịch, máy khử rung tim, van tim học, vật liệu khâu, cấy ghép phẫu thuật thẩm mỹ, cấy ghép dương vật thiết bị chỉnh hình [24] Vì với mong muốn tạo tiền đề cho nghiên cứu việc hình thành biofilm bề mặt vật liệu, thực đề tài “Nghiên cứu tạo đánh giá biofilm Staphylococcus aureus số bề mặt” mục tiêu sau: Tạo đánh giá biofilm Staphylococcus aureus số bề mặt CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Tổng quan S.aureus 1.1.1 Giới thiệu s aureus đà Alexander Ogston phát vào cuối kỉ XIX, lấy từ tiếng Hy Lạp có nghĩa “chùm nho”, ơng đặt tên cho sinh vật Staphylococcus [28] ọ Hình 1.1 Hình ảnh khuân Staphylococcus aureus [42] Trái: hình ảnh kính hiển vi; Phải: hình ảnh kính hiến vi điện tử s aureus mầm bệnh quan trọng gây nhiều loại bệnh nhiễm trùng người, từ nhiễm trùng da nhẹ đến nhiễm trùng mô nghiêm trọng nhiễm trùng huyết, s aureus có mức độ kháng kháng sinh cao nguyên nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn bệnh viện cộng đồng [2] Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), s aureus xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Lồi: Staphylococcus aureus [5] 1.1.2 Hình thái tính chất s aureus cầu khuẩn Gram dương, dương tính với catalase, đường kính 0,5- 1,5 pm, tạo hình thái cụm trông giống 'chùm nho' đặc trưng quan sát kính hiển vi Trong mơi trường phịng thí nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho phát triển 37 °C với phạm vi 7^18 °C [18], [30] Tụ cầu vàng aureus chịu nhiệt độ cao tới 60°C vòng 30 phút nồng độ muối cao tới 10% [10] Môi trường sống tự nhiên s aureus mũi, cố họng, tóc, da niêm mạc người khỏe mạnh s aureus đường mũi 20%-50% người khỏe mạnh Vi khuấn có khơng khí, bụi, nước thải bề mặt thiết bị chế biến thực phẩm [12] Hình 3.1 Giá trị cv log CFU bê mặt dây truyên Sau 24 giờ, bề mặt bên dây truyền xuất lớp biofilm mỏng màu trắng đục bao phủ Kết đo cv log CFU cho thấy giá trị mẫu thử có khác biệt so với mẫu chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p Tiếp tục đánh giá hình thành biofilm bề mặt đa dạng hon khảo sát chi tiết thời điểm nuôi cấy sau 12 giờ, 24 giờ, 36 48 > Nghiên cứu số chất phủ bề mặt vật liệu có tác dụng hạn chế hình thành biofilm s aureus 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Dương Chí Ái, Lý Hồng Giáp, Hồng Anh Hồng, Thanh Trương Vũ (2022), "Hoạt tính khảng hình thành biofilm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ phân đoạn ethyl acetate trâm tròn (Syzygium glomeratum)", Trường Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Ahmad-Mansour N., Loubet p., Pouget c., Dunyach-Remy c., Sotto A., Lavigne J., Molle V (2021), Staphylococcus aureus Toxins: An Update on Their Pathogenic Properties and Potential Treatments”, Toxins, 73(10), pp 677 Archer N K., Mazaitis M J., Costerton J w., Leid J G., Powers M E (2011), "Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease", Virulence, 2(5), pp 445-59 Bergey David Hendricks (2001), Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology, Springer Science & Business Media, Volume Betoin c., Rendueles o., Chauhan A., Lebeaux D (2013), “From in vitro to in vivo Models of Bacterial Biofilm-Related Infections”, Pathogens, pp 288-356 Bhattacharya M., Wozniak D J., Stoodley p., Hall-Stoodley L (2015), "Prevention and treatment of Staphylococcus aureus biofilms", Expert Rev Anti Infect Ther, 13(12), pp 1499-516 Cappelli G., Ricardi M., Ravera F., Ligabue G (2007), “Biofilm on Artificial Surfaces”, Nephrology, pp 154:61-71 Coenye T., Nelis H J (2010), "In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation", J Microbiol Methods, 83(2), pp 89-105 10 Crossley Kent B, Jefferson Kimberly K, Archer Gordon L, Fowler Jr Vance G (2009), Staphylococci in human disease, Blackwell Publishing Ltd, pp 1-18 11 Donlan R M., Costerton J w (2002), “Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms”, Clinical Microbiology Reviews, Vol 15 No.2 12 Elgharably H., Hussain s T., Shrestha N K., Blackstone E H., Pettersson G B (2016), "Current Hypotheses in Cardiac Surgery: Biofilm in Infective Endocarditis", Semin Thorac Cardiovasc Surg, 28(1), pp 56-9 13 Gaire u., Shrestha Ư T., Adhikari s., Adhikari N., Bastola A., Rijal K R., Ghimire p., Banjara M R (2021), “Antibiotic Susceptibility, Biofilm Production, and Detection of mecA Gene among Staphylococcus aureus Isolates from Different Clinical Specimens”, Diseases, 9(4): 80 14 Gordon Y c Cheung, Justin s Bae, Otto M (2021), “Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus”, Virulence, pp 547-69 15 Guerin T F., Mondido M., McClenn B., Peasley B (2001), "Application of resazurin for estimating abundance of contaminant-degrading micro-organisms", Lett Appl Microbiol, 32(5), pp 340-5 16 Hall-Stoodley L., Costerton J w., Stoodley p (2004), “Bacterial biofilms: from the Natural environment to infectious diseases”, Nature Reviews Microbiology, Vol 2, Issue 17 Hernandez-Escobar D., Champagne s., Yilmazer H., Dikici B., Boehlert c J., Hermawan H (2019), “Current status and perspectives of zinc-based absorbable alloys for biomedical applications”, Acta Biomaterialia, Volume 97, pp 1-22 18 Hudson J A (2004), “Microbiological safety of meat I Staphylococcus aureus”, Encyclopedia of Meat Sciences, pp 820-25 19 lelapi N., Nicoletti E., Lore c., Guasticchi G., Avenoso T., Barbetta A., Franciscis s., Andreucci M (2020), “The Role of Biofilm in Central Venous Catheter Related Bloodstream Infections: Evidence-based Nursing and Review of the Literature”, Bentham Science, Volume 15, Issue 1, pp 22-7 20 Jaskiewicz M., Janczura A., Nowicka J., Kamysz w (2019), "Methods Used for the Eradication of Staphylococcal Biofilms", Antibiotics (Basel), 8(4) 21 Lister J L., Horswill A R (2014), "Staphylococcus aureus biofilms: recent developments in biofilm dispersal", Front Cell Infect Microbiol, 4, pp 178 22 Liu Y., Zhang J., Ji Y (2020), "Environmental factors modulate biofilm formation by Staphylococcus aureus", Sci Prog, 103(1), pp 36850419898659 23 Lopez D., Vlamakis H., Kolter R (2010), "Biofilms", Cold Spring Harb Pespect Biol, 2(7), pp a000398 24 M E (2011), "Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease", Virulence, 2(5), pp 445-59 25 Macia M D., Rojo-Molinero E., Oliver A (2014), "Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria", Clin Microbiol Infect, 20(10), pp 981-90 26 Mariscal A., Lopez-Gigosos R M., Carnero-Varo M., Fernandez-Crehuet J (2009), "Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm", Appl Microbiol Biotechnol, 82(4), pp 773-83 27 Moormeier D E., Bayles K w (2017), "Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism", Mol Microbiol, 104(3), pp 365-376 28 Myles I A., Datta s K (2012), "Staphylococcus aureus: an introduction", Semin Immunopathol, 34(2), pp 181-4 29 Otto M (2018), "Staphylococcal Biofilms", Microbiol Spectr, 6(4) 30 Paharik A E., Horswill A R (2016), “The Staphylococcal Biofilm: Adhesins, Regulation, and Host Response”, Microbiology Spectrum 31 Peeters E., Nelis H J., Coenye T (2008), "Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates", J Microbiol Methods, 72(2), pp 157-65 32 Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Cornu o., Van Bambeke F (2021), "In Vitro Study of the Synergistic Effect of an Enzyme Cocktail and Antibiotics against Biofilms in a Prosthetic Joint Infection Model", Antimicrob Agents Chemother 33 Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Sakoulas G., Rodriguez-Villalobos H., Cornu o., Van Bambeke F (2020), "Synergistic Effects of Pulsed Lavage and Antimicrobial Therapy Against Staphylococcus aureus Biofilms in an in-vitro Model", Front Med (Lausanne), 7, pp 527 34 Roy R., Tiwari M., Donelli G., Tiwari V (2016), “Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biolĩlm agents and their mechanisms of action”, Virulence, pp 522-54 35 Rusconi R., Stocker R (2015), “Microbes in flow”, Microbiology, pp 25: 1-8 36 Schilcher K., Horswill A R (2020), "Staphylococcal Biofilm Development: Structure, Regulation, and Treatment Strategies", Microbiol Mol Biol Rev, 84(3) 37 Siala w., Kucharíková s., Braem A., Vleugels J., Tulkens p M., MingeotLeclercq M p., Van Dijck p., Van Bambeke F (2016), "The antifungal caspofungin increases fluoroquinolone activity against Staphylococcus aureus biofilms by inhibiting N-acetylglucosamine transferase", Nat Commun, 7, pp 13286 38 Zeller B., Stockli s., Zaugg L K (2020), “Biofilm formation on metal alloys, zirconia and polyetherketoneketone as implant materials in vivo”, Clinical Oral Implants Research, 31(11)