BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN ĐẲC HÙNG NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM ĐA LOÀI s aureus, E colỉ NẰC albicans TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2023 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘ[.]
BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN ĐẲC HÙNG NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM ĐA LOÀI s aureus, E colỉ NẰC albicans TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2023 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN ĐẮC HÙNG 1801277 NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM ĐA LOÀI s aureus, E colỉ NẰC albicans TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Khắc Tiệp Nơi thực hiện: Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2023 Lòi cảm ơn Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, người đà hướng dẫn em suốt trình làm nghiên cứu Thầy dẫn, định hướng cho em, động viên em để em hoàn thành tốt nhiệm vụ Một lần em xin chân thành cảm ơn thầy chúc thầy dồi sức khoẻ Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, HVCH Trần Thị Minh Thu, Đỗ Thị Huyền Thương đà quan tâm, giúp đỡ bảo em suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Khoa Công nghệ sinh học, môn Bào chế công nghiệp dược, Thực vật dược đà giúp đờ, tạo điều kiện giúp em hồn thành khố luận Em xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Lan Anh, Khổng Thị Ngọc Anh, Vũ Thành Lập, Bùi Thị Mai Nhung, Bounthavy Phengsavatdy, Bùi Thị Phương Thanh, Mai Phương Thu, Nguyễn Thị Thu Trang bạn sinh viên nghiên cứu K74 môn Công nghệ sinh học dược đồng hành, hỗ trợ động viên em lúc khó khăn Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, nhà trường, thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội trang bị cho em kiến thức vô quý báu để giúp em tự tin vững bước tương lai Và cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người ln chỗ dựa tinh thần, động lực to lớn để em hồn thành tốt cơng việc Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Thân Đắc Hùng DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIẾU ĐỊ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Tình trạng nhiễm khuẩn 1.2 Khái niệm biofilm .Error! Bookmark not defined 1.3 Bioíĩlm thất bại điều trị nhiễm khuẩn 1.4 Một số mơ hình biofilm ứng dụng nghiên cứu 1.4.1 Mô hình biofilm ìn vitro 1.4.2 Mơ hình biofilm in vivo 1.4.3 Cách đánh giá tiêu thành phần biofilm 1.5 Tổng quan Staphylococcus aureus, Escherichia coli Candida albicans 1.5.1 Staphylococcus aureus 1.5.2 Escherichia coli 1.5.3 Candida albicans 10 1.6 Biofilm đa loài Staphylococcus aureus, Escherichia coli Candida albicans 11 1.6.1 Co chế hình thành biofilm đa loài 11 1.6.2 Biofilm đa loài Staphylococcuc aureus Candida albicans 13 1.6.3 Biofilm đa loài Staphylococcus aureus Escherichia coli 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù họp để nuôi cấy tạo biofilm đa loài s aureus, c albicans 19 2.2.2 Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù hợp để ni cấy tạo biofilm đa lồi s aureus, E coli .19 2.3 Phuong pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Chuẩn bị mơi trường hoạt hóa chủng 19 2.3.2 Phương pháp cấy vsv thạch 20 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm đĩa 96 giếng 20 2.3.4 Phương pháp đánh giá tiêu biofilm 21 2.3.5 Phương pháp thống kê 22 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu tạo biofilm đa loài s aureus, c albicans 23 3.1.1 Lựa chọn môi trường phù họp đê tạo biofilm, đánh giá lượng vsv biofilm 23 3.1.1.1 Môi trường đánh giá lượng vsv biofilm đa loài s aureus, c albicans23 3.1.1.2 Mơi trường phù hợp để tạo biofilm đa lồi s aureus, c albicans 23 3.1.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy, điều kiện nuôi cay biofilm đa loài s aureus, c albicans 26 3.2 Biofilm đa loài s aureus, E coli 28 3.2.1 Lựa chọn môi trường phù hợp đê tạo biofilm, đánh giá lượng vsv biofilm 28 3.2.1.1 Môi trường đánh giá lượng vsv biofilm đa loài s aureus, E coli 28 3.2.1.2 Lựa chọn số môi trường phù họp cho ni cấy tạo biofilm đa lồi s aureus E coli 28 3.2.2 Lựa chọn thời gian điều kiện nuôi cấy tạo biofilm đa loài s aureus E coli 30 3.3 Bàn luận 33 KÉT LUẬN 36 KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT AM3 Antibiotic medium #3 Môi trường antibiotic medium #3 ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ Collection c albicans Candida albicans CFU Colony Forming Unit Đon vị hình thành khuẩn lạc cv Crystal violet Tím tinh thể DMSO Dimethyl sulfoxide eDNA extracellular DNA E coli Escherichia coli KS ADN ngoại bào Kháng sinh LBB Luria Bertani Broth Môi trường Luria Bertani Broth MDK Minimum duration for killing Thời gian tối thiểu để kháng sinh tiêu diệt lượng xác định vsv MIC MRSA PBS PIA PNAG Minimum Inhibitory Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh Concentration vật Methicillin-resistant Staphylococcus Staphylococcus aureus methicillin aureus Phosphate-Buffered Saline pH Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 7.4 Polysaccharide intercellular Chất adhesin polysaccharide kết dính liên Poly-P-1,6-N-acetylDglucosamine RF Resorufin Resorufin s aureus Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng Sab Sabouraud Môi trường sabouraud SDA Sabouraud dextrose agar Thạch Sabouraud dextrose TSB-glucose-NaCl TSA Tryptic Soy Agar Thạch Tryptic Soy TSB Tryptic Soy broth Tryptic Soy lỏng VRBA Violet Red Bile Thạch Violet Red Bile TGN vsv kháng Vi sinh vật bào DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.3 Thành phân môi trường 18 Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Lựa chọn mỏi trường chọn lọc vsv 23 Bảng 3.2 Lựa chọn môi trường chọn lọc vsv 29 DANH MỤC HÌNH VÊ VÀ ĐỊ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh biofilm [66], [5] Hình 1.2 Biofilm s aureus đĩa 96 giếng bề mặt miếng titan [50] Hình 1.3 Nhiễm khuan biofilm catheter đuợc cấy bụng chuột [55] Hình 1.4 Quá trình khử resazurin [17] Hình 1.5 Hình ảnh vi khuân Staphylococcus aureus (CDC/Matthew J Arduino, DRPH) Hình 1.6 Hình ảnh vi khuẩn Escherichia coli [30] 10 Hình 1.7 Hình ảnh Candida albicans 11 Hình 1.8 Các trình giả thuyết hình thành biofilm đa lồi [3] 12 Hình 1.9 Các co chế so đế hình thành biofilm đa lồi 13 Hình Hình 2.1 Các vsv khác đuợc cấy khu vực tuơng ứng Hình 2.2 Sụ chuyên màu từ resazurin màu xanh sang resorufin màu hồng 22 Hình Hình 3.1 Giá trị đo quang chuyên hoá resaruzin biofilm 24h thực với môi truờng Hình 3.2 Tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thục với môi trường Hình 3.3 Lượng vsv s aureus biofilm 24h (log 10 CFƯ/ml) thực với môi trường Hình 3.4 Lượng vsv c albicans biofilm 24h (log 10 CFƯ/ml) thực với môi trường Hình 3.5 Giá trị đo quang chuyển hoá resaruzin biofilm thời điềm điều kiện khảo sát Hình 3.6 Tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thực thời điểm điều kiện khảo sát Hình 3.7 Lượng vsv s aureus biofilm (logio CFU/ml) thời điểm điều kiện khải sát Hình 3.8 Lượng vsv c albicans biofilm (logio CFU/ml) thời điểm điều kiện khảo sát Hình 3.9 Giá trị đo quang chuyển hố resaruzin biofilm thực với môi trường Hình 3.10 Tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường Hình 3.11 Lượng vsv s aureus biofilm (logio CFU/ml) môi trường khảo sát Hình 3.12 Lượng vsv E coli biofilm (logio CFU/ml) môi trường khảo sát 30 Hình 3.13 tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thừoi điểm điều kiện khảo sát 31 Hình 3.14 Lượng vsv s aureus biofilm (logio CFU/ml) thời điêm điều kiện khảo sát 31 Hình 3.15 Lượng vsv E coli biofilm (logio CFU/ml) thời điểm điều kiện khảo sát 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Biofilm cộng đồng vi sinh vật gồm vi khuẩn nằm chất bào chất cao phân tử ngoại bào chúng tạo ra, co cấu tạo từ polycaccharid, DNA ngoại bào (eDNA) protein [191, [431 Cả vi khuấn nấm có khả hình thành biofilm Tuy nhiên, biofilm đa lồi vi khuấn/nấm đặc biệt khó kiêm sốt điều trị [25] Trong năm gần biofilm đa loài ngày ghi nhận nhiều trường họp bệnh lý, vi khuân nấm phát đồng thời nhiều trường họp nhiễm trùng [52] Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp Staphylococcus aureus Escherichia coli bám vào sợi nấm Candida albicans sử dụng chúng làm chất hồ trợ phát triến [46], [65], [68] Sự tương tác giúp chúng tăng khả kháng kháng sinh đồng thời có khả gây độc tế bào làm tăng tỉ lệ tử vong [12], [71] Do mơ hình biofilm đa lồi thường tập trung chủ yếu việc tạo biofilm đơn loài, chưa thực phù hợp với thực tế nay, việc nghiên cứu tạo đánh giá biofilm đa loài cần thiết để áp dụng việc sàng lọc hoạt chất có hoạt tính kháng khuẩn để áp dụng vào thực tiễn Biofilm đa loài s aureus, E coli c albicans đĩa 96 giếng công cụ hiệu đại diện phần cho đa dạng mầm bệnh bệnh nhiễm trùng để sàng lọc nghiên cứu hoạt chất có khả kháng biofilm, với lợi vượt trội giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, nhiều điều kiện thí nghiệm thực thời điểm Với mong muốn tạo biofilm đa loài vi sinh vật đĩa 96 giếng ứng dụng việc sàng lọc hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm đa lồi vi khuẩn nấm điều kiện Việt Nam, thực đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm đa loài s aureus, E colỉ c albicans đĩa 96 giếng” với 02 mục tiêu sau: Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù hợp để ni cấy tạo biofilm đa lồi s aureus, c albicans Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù họp để ni cấy tạo biofilm đa lồi s aureus, E coli đạt mức tốt ốn định đến ngày thứ tư, có giảm nhẹ ngày thứ tư, nhiên suy giảm ý nghĩa thống kê - Từ kết trên, chọn thời điểm nuôi cấy ngày để tạo biofilm (biofilm 48 giờ) Môi trường nuôi biofilm thay hàng ngày 3.2 Biofilm đa loài s aureus, E coli 3.2.1 Lựa chọn môi trường phù họp đế tạo biofilm, đánh giá lượng vsv biofilm 3.2.1.1 Mơi trường đánh giá lượng vsv biofilm đa lồi s aureus, E coli Khảo sát số môi trường có khả chọn lọc hỗn họp vsv cấy lên Với hỗn họp vi sinh vật s aureus E.coỉỉ, nghiên cứu khảo sát 02 môi trường Mannitol VRBA Bảng 3.2 Khảo sát môi trường chọn lọc vsv Loại thạch Mannitol VRBA Môi trường chọn lọc Thời gian đọc kết s aureus 24h, 48h, 72h E coỉi 24h, 48h ,72h Môi trường thạch Mannitol môi trường chọn lọc cho s aureus thời điêm 24h, 48h, 72h.( Bảng 3.2) Môi trường thạch VRBA chọn lọc cho E coli thời điểm 24h, 48h, 72h.( Bảng 3.2) Với mục tiêu phục vụ nghiên cứu tạo biofilm đa loài, cần đánh giá lượng vsv biofilm đa loài s aureus E.coli thời điểm nên ưu tiên lựa chọn môi trường đơn giản, đánh giá thời gian ngắn đảm bảo tính chọn lọc Cụ thể, mơi trường thạch Mannitol chọn lọc cho s aureus, môi trường thạch VRBA chọn lọc cho E.coỉi, thời điềm đọc kết CFU 24h 3.2.1.2 Một số môi trường phù họp cho ni cấy tạo biofilm đa lồi s aureus E coli Tạo biofilm với s aureus MRS A ATCC 33591 E coli ATCC 25922 môi trường TGN, LBB, LBB bố sung đồng thời NaCl glucose Biofilm 24 đánh giá chuyển hoá Resaruzin, tổng sinh khối (nhuộm với CV) lượng vsv sống biofilm (cấy đếm CFU) 28 Resaruzin Hình 3.9 Giá trị đo quang chuyên hoả resaruzin biofilm thực với mơi trường Hình 3.Ỉ0 Tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với mơi trường Hình 3.11 Lượng vsvs aureus biofilm (logio CFU/ml) môi trường khảo sát 29 cấy đếm CFU s aureus tốt không thay môi trường hàng ngày thời điểm 48h, 72h, 96h, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p