TRẦN THỊ MINH THU NGHIÊN cứu tạo BIOFILM của staphylococcus aureus TRÊN đĩa 96 GIẾNG và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM của một số CAO dược LIỆU KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

: BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH THU NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH THU 1701554 NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU LỜI CẢM ƠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Khắc Tiệp HVCH Tống Xuân Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm động viên em trình nghiên cứu khoa học thực đề tài khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, HVCH Tống Xuân Quang quan tâm, giúp đỡ, tận tình bảo để em có hướng đắn suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, suốt năm học đại học truyền đạt cho em kiến thức vô quý báu để em tự tin tháng ngày tới Em xin cảm ơn bạn Đỗ Thị Huyền Thương, bạn Hoàng Thị Ánh Nhật người bạn em thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, cảm ơn đồng hành, hỗ trợ động viên tinh thần em nhiều suốt khoảng thời gian khó khăn vừa qua Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người ln hậu phương vững chắc, động lực tinh thần to lớn để em vững bước Nghiên cứu tài trợ đề tài cấp Trường Đại học Dược Hà Nội theo định 798/QĐ-DHN năm 2021 Tên đề tài: "Nghiên cứu tạo biofilm S aureus đĩa 96 giếng, ứng dụng sàng lọc khả diệt biofilm số dược liệu Việt Nam", định số 798/QĐ-DHN (xem phụ lục 1) Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên Trần Thị Minh Thu MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Staphylococcus aureus 1.1.1 Giới thiệu Staphylococcus aureus 1.1.2 Đặc điểm hình thái, tính chất ni cấy 1.1.3 Khả gây bệnh S aureus 1.2 Biofilm S aureus 1.2.1 Khái niệm biofilm 1.2.2 Các giai đoạn hình thành biofilm S aureus 1.2.3 Thành phần biofilm S aureus 1.2.4 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hình thành biofilm S aureus 1.2.5 Các bệnh liên quan đến biofilm S aureus 1.3 Biofilm thất bại điều trị nhiễm khuẩn 1.4 Một số mơ hình biofilm ứng dụng nghiên cứu 10 1.4.1 Mô hình biofilm in vitro 10 1.4.2 Mơ hình biofilm in vivo .11 1.4.3 Cách đánh giá tiêu thành phần biofilm .12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 14 2.1.2 Hóa chất .14 2.1.3 Thiết bị .16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Khảo sát số môi trường phù hợp cho nuôi cấy biofilm S aureus 16 2.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm S aureus 17 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng biofilm số hoạt chất 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Chuẩn bị mơi trường hoạt hóa chủng .17 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm S aureus đĩa 96 giếng 17 2.3.3 Phương pháp đánh giá tiêu biofilm 18 2.3.4 Phương pháp chuẩn bị mẫu thử 19 2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm số dược liệu 19 2.3.6 Phương pháp thống kê 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ 21 3.1 Khảo sát số môi trường phù hợp cho nuôi cấy biofilm S aureus 21 3.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tạo biofilm S aureus 24 3.3 Đánh giá tác dụng kháng biofilm số hoạt chất 25 3.3.1 Sàng lọc hoạt tính kháng biofilm số dược liệu Việt Nam 25 3.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng biofilm cao ổi (DHN10) 26 BÀN LUẬN 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT ATCC American Type Culture BHI C albicans Collection Brain Heart Infusion Candida albicans CFU CV Colony Forming Unit Crystal violet DMSO eDNA KS Dimethyl sulfoxide extracellular DNA MDK Minimum duration for killing Mxf MHB MIC MRSA MSSA PBS PIA PNAG RF S aureus TGN TSA TSB Van VSV Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ Đơn vị hình thành khuẩn lạc Tím tinh thể ADN ngoại bào Kháng sinh Thời gian tối thiểu để kháng sinh tiêu diệt lượng xác Moxifloxacin Mueller Hinton broth Minimum Inhibitory Concentration Methicillin-resistant định VSV Moxifloxacin Mueller Hinton lỏng Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật Staphylococcus aureus kháng Staphylococcus aureus methicillin Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Polysaccharide intercellular adhesin Poly-β-1,6-N-acetyl-Dglucosamine Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 Chất kết dính liên bào polysaccharide Resorufin Staphylococcus aureus Resorufin Tụ cầu vàng TSB-glucose-NaCl Thạch Tryptic Soy Tryptic Soy lỏng Vancomycin Vi sinh vật Tryptic Soy Agar Tryptic Soy broth Vancomycin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Thành phần môi trường 15 Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 3.1 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF mẫu dược liệu có khả diệt S aureus biofilm so với mẫu chứng 26 Bảng 3.2 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2Cl2) .26 Bảng 3.3 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2Cl2) 27 Bảng 3.4 Lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2Cl2) 27 Bảng 3.5 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 29 Bảng 3.6 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 30 Bảng 3.7 Lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus .2 Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm S aureus .5 Hình 1.3 Mơ hình hình thành biofilm S aureus giai đoạn Hình 2.1 Sự chuyển màu từ resazurin màu xanh sang resorufin màu hồng 19 Hình 2.2 Mơ tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng biofilm 20 Hình 3.1 Lượng VSV biofilm 24h (log10 CFU/ml) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với mơi trường TSB có bổ sung thành phần .21 Hình 3.2 Lượng VSV biofilm 24h (log10 CFU/ml) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường BHI có bổ sung thành phần 21 Hình 3.3 Lượng VSV biofilm 24h (log10 CFU/ml) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với mơi trường MHB có bổ sung thành phần 22 Hình 3.4 Lượng VSV biofilm 24h (log10 CFU/ml) (1A) tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV)(1B), thực với môi trường ni cấy khác 23 Hình 3.5 Lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thời điểm 6h, 24h, 48h 72h 24 Hình 3.6 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm mẫu cao tổng phân đoạn H2O, nhexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2Cl2) 27 Hình 3.7 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) mẫu cao tổng phân đoạn H2O, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (CH2Cl2) 28 Hình 3.8 Tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 29 Hình 3.9 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus (S aureus) hay gọi tụ cầu vàng, coi tác nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm khuẩn từ đơn giản đến phức tạp Điều trị nhiễm khuẩn S aureus gặp nhiều khó khăn, khơng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh đa dạng yếu tố độc lực, mà tồn kiểu hình dai dẳng khả bám dính hình thành biofilm bề mặt khác vi khuẩn [15] Trong số nhiều loại nhiễm khuẩn gây S aureus, nhiễm khuẩn liên quan đến biofilm thường gây nên nhiều thách thức điều trị [35] Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn người, đặc biệt bệnh có biểu dai dẳng tái phát [24] Cuộc chiến chống lại biofilm chiến khó khăn tình trạng tình trạng đáp ứng với kháng sinh vi khuẩn biofilm Vì vậy, việc tìm hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm điều quan trọng Trong bối cảnh này, thực vật nguồn cung cấp phong phú tiềm [13] Biofilm S aureus đĩa 96 giếng công cụ hiệu để sàng lọc nghiên cứu hoạt chất có khả kháng biofilm, với lợi vượt trội giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, nhiều điều kiện thí nghiệm thực thời điểm Với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm S aureus có nguồn gốc từ thực vật Việt Nam, thực đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm Staphylococcus aureus đĩa 96 giếng đánh giá khả kháng biofilm số cao dược liệu” với 03 mục tiêu sau: Khảo sát số môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm S aureus Khảo sát thời gian điều kiện nuôi cấy biofilm S aureus Đánh giá khả kháng biofilm S aureus số cao chiết dược liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Staphylococcus aureus 1.1.1 Giới thiệu Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus lần xác định vào năm 1884 Anton Rosenbach, bác sĩ phẫu thuật người Đức [27], [28] S aureus thành viên chi Staphylococcus Các thuật ngữ Staphylococcus đề xuất Sir Alexander Ogston từ tiếng Hy Lạp (staphyle nghĩa chùm nho) xếp đặc trưng thành cụm [6], [27] Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus [42] Trái: hình ảnh kính hiển vi; Phải: hình ảnh kính hiển vi điện tử Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S aureus xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [6] S aureus phân biệt với loài tụ cầu khác sở sắc tố vàng khuẩn lạc, kết dương tính phép thử coagulase, lên men đường mannitol deoxyribonuclease [23] 1.1.2 Đặc điểm hình thái, tính chất ni cấy S aureus vi khuẩn Gram dương không di động, đặc trưng cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 µm, vi khuẩn kỵ khí đa dạng [6] Tụ cầu vàng S aureus chịu nhiệt độ cao tới 60ºC vòng 30 phút nồng độ muối cao tới 10% [9] Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc đường kính 12mm, nhẵn Sau 24 37ºC, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn [1] Trên môi trường thạch manitol, tụ cầu vàng lên men manitol tạo vùng màu vàng xung quanh khuẩn lạc [9] Trên môi trường canh thang, tụ cầu vàng làm đục mơi trường, để lâu lắng cặn [1] Từ kết sau nhuộm với tím tinh thể, nhận thấy phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 không làm giảm tổng sinh khối biofilm so với mẫu chứng (không bổ sung dược liệu, kháng sinh), điều kiện thực nghiệm có bổ sung kháng sinh, không bổ sung kháng sinh Bảng 3.6 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 RF % Chứng 1.1 1.2 1.3 1.4 TGN 100,0 ±10,2 33,6 ±4,1 40,8 ±2,6 27,7 ±3,0 113,3 93,1 ±13,6 18,4 ±0,7 19,7 ±0,8 19,9 ±5,0 86,5 116,5 ±20,4 26,1 ±0,1 27,2 ±4,3 22,9 ±2,9 128,5 TGN + MXF TGN + Van Kết biểu tỷ lệ % mẫu thử so với mẫu chứng khơng KS, dạng trung bình ± sai số Kết chuyển hóa resazurin cho thấy phân đoạn 1.1, 1.2 1.3 có tác dụng tốt đối tượng vi khuẩn biofilm Khi sử dụng đơn có khả ức chế 59,2-72,3% chuyển hóa, kết hợp với kháng sinh có khả ức chế 72,7-81,6% chuyển hóa VSV Phân đoạn 1.4 khơng có tác dụng với vi khuẩn biofilm Bảng 3.7 Lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 log CFU/ml Chứng 1.1 1.2 1.3 TGN 8,17 ±0,01 7,77 ±0,07 7,66 ±0,35 7,76 ±0,21 TGN + Mxf 7,79 ±0,04 5,03 ±0,48 7,10 ±0,56 4,40 ±0,94 TGN + Van 8,22 ±0,03 7,66 ±0,08 7,26 ±0,18 6,51 ±2,23 Phương pháp đếm CFU mẫu 1.1, 1.2, 1.3 sử dụng dạng đơn hay kết hợp với moxifloxacin có có khả diệt vi sinh vật biofilm Sự khác biệt có ý nghĩ thống kê, sử dụng One-way ANOVA, với test so sánh Dunnett, tất mẫu thử so sánh mẫu với mẫu chứng (TGN không bổ sung dược liệu, kháng sinh) Mẫu 1.1 1.3 diệt vi khuẩn biofilm tốt Phân đoạn 1.1 có khả diệt 0,4 log10 CFU/ml dạng đơn, 3,14 log10 CFU/ml kết hợp với moxifloxacin, 0,51 log10 CFU/ml kết hợp với vancomycin Phân đoạn 1.3 có khả diệt 0,41 log10 CFU/ml dạng đơn, 3,77 log10 CFU/ml kết hợp với moxifloxacin, 1,66 log10 CFU/ml kết hợp với vancomycin (diệt log10 CFU/ml tương đương với 99,9% VSV) 30 TGN TGN p < 0.05 125 log CFU/ml RF % 100 75 50 25 TGN+Mxf TGN + Mxf p < 0.05 125 log CFU/ml 100 RF % 1 ol co nt r co nt r 1 ol 75 50 25 TGN+Van TGN + Van p > 0.05 125 log CFU/ml 150 100 RF % 1 co nt ro l co nt ro lM FX 1 co nt ro co l nt ro lM FX 75 50 25 1 ol V co nt r an ol co nt r 1 ol V co nt r co nt r ol an Hình 3.9 Tỷ lệ % giá trị huỳnh quang RF lượng VSV biofilm (log10 CFU/ml) phân đoạn 1.1, 1.2, 1.3 31 BÀN LUẬN Về việc xây dựng mô hình biofilm đĩa 96 giếng Nghiên cứu chọn môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm đĩa 96 giếng TSB có bổ sung NaCl 2% glucose 1% Khi sử dụng môi trường này, biofilm tạo có tổng sinh khối số lượng VSV biofilm cao môi trường thử nghiệm Khi bổ sung NaCl, glucose đồng thời NaCl glucose vào TSB, nhận thấy gia tăng số lượng VSV tổng sinh khối biofilm Điều tương đồng với nhiều thử nghiệm trước Nghiên cứu Lade cộng sử dụng 40 chủng S aureus chọn ngẫu nhiên (21 MRSA 19 MSSA) Môi trường sử dụng TSB, TSB bổ sung 0,5% 1,0% glucose, 1,0% 2,0% NaCl, 1,0% glucose 1,0% NaCl Kết cho thấy bổ sung glucose NaCl thúc đẩy hình thành biofilm chủng thử nghiệm Nghiên cứu nhận thấy việc bổ sung glucose 1% tạo biofilm phát triển mạnh thích hợp cho việc định lượng, biến đổi lần thí nghiệm [18] Nghiên cứu chọn thời điểm nuôi cấy ngày để tạo biofilm (biofilm 24 giờ) Môi trường nuôi biofilm thay mới, biofilm sử dụng để đánh giá hoạt lực kháng biofilm Với thời gian điều kiện nuôi cấy này, biofilm tạo đáp ứng hai yêu cầu (1) biofilm hoàn chỉnh (2) biofilm ổn định theo thời gian Một số nghiên cứu khảo sát hình thành biofilm đĩa 96 giếng thời điểm khác cho thấy biofilm hình thành ổn định tốt khoảng từ 18 đến 24 [3], [34] Về sàng lọc hoạt tính kháng biofilm dược liệu Nghiên cứu cho thấy 300 mẫu thực sàng lọc, có 11 mẫu, chiếm tỷ lệ 3,6%, có khả diệt S aureus biofilm, dạng đơn lẻ kết hợp với kháng sinh Đây tỉ lệ cho thấy tiềm cung cấp hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm từ thực vật Một số nghiên cứu sàng lọc tác dụng kháng biofilm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên thực Nghiên cứu sàng lọc 106 hợp chất từ nấm biển cho thấy 12 hợp chất có tác dụng ức chế hình thành biofilm S aureus nồng độ 100 μg/ml [39] Tuy nhiên khả diệt vi sinh vật biofilm trưởng thành khó nhiều so với ức chế hình thành biofilm Chúng đánh giá hợp chất sàng lọc khả ức chế hình thành biofilm Theo quan điểm nhóm nghiên cứu khả cao hợp chất có khả ức chế hình thành biofilm Về hoạt tính kháng biofilm cao ổi phân đoạn: Nghiên cứu cho thấy cao chiết ổi phân đoạn có hoạt tính kháng biofilm S aureus ATCC 33591 Phân đoạn dicloromethan phân đoạn có tác dụng tốt 32 Từ chọn phân đoạn cho chạy cột silicagel với dung môi cloroform 100% với mục đích làm giàu tách phân đoạn nhỏ, tách phân đoạn nhỏ 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 tiến hành thử hoạt tính Đã có số nghiên cứu khả kháng biofilm hoạt chất chiết xuất từ thực vật thực Dựa nghiên cứu chiết xuất thực vật, Quave cộng tìm phân đoạn cao chiết kháng hình thành biofilms S aureus Nghiên cứu chứng minh phân đoạn 220D-F2 (phân đoạn thu từ cao chiết ethanol rễ Rubus ulmifolius) có diện ellagic acid chất dẫn xuất có khả giới hạn hình thành biofilm có tiềm làm tăng khả nhạy với kháng sinh Tất dòng S aureus kiểm tra có biểu giảm hình thành biofilm tác dụng phân đoạn 220D-F2 nồng độ từ 50-200 mg/l phát triển vi khuẩn bị giới hạn nồng độ 530-1040 mg/l [29] Quelemes đồng tác giả nghiên cứu ảnh hưởng cao chiết Neem hình thành biofilm Kết cao chiết ethanol từ Neem có tác dụng ức chế hình thành biofilm chủng vi khuẩn MRSA tế bào phù du [30] Dữ liệu từ nghiên cứu Wen cộng cho thấy tiềm flavonoid naringenin từ chi Citrus tác nhân tự nhiên để ngăn ngừa hình thành biofilm S aureus làm giảm nguy sức khỏe liên quan đến hình thành biofilm ngành công nghiệp thực phẩm [40] Một nghiên cứu Việt Nam cho thấy phân đoạn ethylacetate trâm trịn cho hoạt tính ức chế hình thành biofilm hai chủng MSSA ATCC 6538 MRSA ATCC 33591, so với đối chứng Nồng độ cao phân đoạn ethylacetate trâm tròn 0,25 mg/mL [2] Khi tiến hành đánh giá hoạt tính phân đoạn nhỏ tách từ phân đoạn dicloromethan, phân đoạn 1.1 1.3 kết hợp với Mxf 1.5mg/l có khả diệt log10 CFU Một nghiên cứu tác dụng số kháng sinh lên biofilm S aureus mơ hình đĩa 96 giếng cho thấy đạt tác dụng diệt khuẩn giảm log10 CFU [10] Do đó, thấy phân đoạn 1.1 1.3 đối tượng tiềm để nghiên cứu phân lập hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm hiệu 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã chọn mơi trường TSB có bổ sung NaCl 2% glucose 1% môi trường phù hợp để tạo biofilm đĩa 96 giếng Đã chọn thời điểm nuôi cấy ngày để tạo biofilm (biofilm 24 giờ) Môi trường nuôi biofilm thay 24 giờ, biofilm sử dụng để đánh giá hoạt lực kháng biofilm Với thời gian điều kiện nuôi cấy này, biofilm tạo đáp ứng hai yêu cầu (1) biofilm hoàn chỉnh (2) biofilm ổn định theo thời gian Đã đánh giá hoạt tính kháng biofilm số mẫu cao dược liệu Việt Nam, xác định 11 mẫu cao có khả diệt biofilm, sử dụng đơn kết hợp với moxifloxacin vancomycin Mẫu cao ổi đánh giá chi tiết phân đoạn, cho phân đoạn dicloromethan tiểu phân đoạn dicloromethan có hoạt lực tốt với đối tượng vi khuẩn biofilm Từ kết thu chúng tơi có số kiến nghị:  Tiếp tục tiến hành đánh giá hoạt tính kháng biofilm mẫu cao chiết có tác dụng diệt S aureus biofilm  Tiến hành tách chất tinh khiết từ phân đoạn 1.1 1.3 dicloromethan cao chiết ổi để tiến hành đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Dương Chí Ái, Lý Hoàng Giáp, Hoàng Anh Hoàng, Thanh Trương Vũ "Hoạt tính kháng hình thành biofilm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ phân đoạn ethyl acetate trâm tròn (Syzygium glomeratum)" Tiếng Anh Arce Miranda J E., Sotomayor C E., Albesa I., Paraje M G (2011), "Oxidative and nitrosative stress in Staphylococcus aureus biofilm", FEMS Microbiol Lett, 315(1), pp 23-9 Archer N K., Mazaitis M J., Costerton J W., Leid J G., Powers M E., Shirtliff M E (2011), "Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease", Virulence, 2(5), pp 445-59 10 11 Balaban N Q., Helaine S., Lewis K., Ackermann M., Aldridge B., Andersson D I., Brynildsen M P., Bumann D., Camilli A., Collins J J., Dehio C., Fortune S., Ghigo J M., Hardt W D., Harms A., Heinemann M., Hung D T., Jenal U., Levin B R., Michiels J., Storz G., Tan M W., Tenson T., Van Melderen L., Zinkernagel A (2019), "Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence", Nat Rev Microbiol, 17(7), pp 441-448 Bergey David Hendricks (2001), Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology, Springer Science & Business Media Bhattacharya M., Wozniak D J., Stoodley P., Hall-Stoodley L (2015), "Prevention and treatment of Staphylococcus aureus biofilms", Expert Rev Anti Infect Ther, 13(12), pp 1499-516 Coenye T., Nelis H J (2010), "In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation", J Microbiol Methods, 83(2), pp 89-105 Crossley Kent B, Jefferson Kimberly K, Archer Gordon L, Fowler Jr Vance G (2009), Staphylococci in human disease Diaz Iglesias Y., Wilms T., Vanbever R., Van Bambeke F (2019), "Activity of Antibiotics against Staphylococcus aureus in an In Vitro Model of Biofilms in the Context of Cystic Fibrosis: Influence of the Culture Medium", Antimicrob Agents Chemother, 63(7) Elgharably H., Hussain S T., Shrestha N K., Blackstone E H., Pettersson G B (2016), "Current Hypotheses in Cardiac Surgery: Biofilm in Infective Endocarditis", Semin Thorac Cardiovasc Surg, 28(1), pp 56-9 12 Guerin T F., Mondido M., McClenn B., Peasley B (2001), "Application of resazurin for estimating abundance of contaminant-degrading micro-organisms", Lett Appl Microbiol, 32(5), pp 340-5 13 Guzzo F., Scognamiglio M., Fiorentino A., Buommino E., D'Abrosca B (2020), "Plant Derived Natural Products against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus: Antibiofilm Activity and Molecular Mechanisms", Molecules, 25(21) 14 Helaine S., Kugelberg E (2014), "Bacterial persisters: formation, eradication, and experimental systems", Trends Microbiol, 22(7), pp 417-24 15 Jaśkiewicz M., Janczura A., Nowicka J., Kamysz W (2019), "Methods Used for the Eradication of Staphylococcal Biofilms", Antibiotics (Basel), 8(4) 16 Kim Bo‐Ram, Bae Young‐Min, Lee Sun‐Young %J Journal of Food Safety (2016), "Effect of environmental conditions on biofilm formation and related characteristics of Staphylococcus aureus", 36(3), pp 412-422 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Kranjec C., Morales Angeles D., Torrissen Mårli M., Fernández L., García P., Kjos M., Diep D B (2021), "Staphylococcal Biofilms: Challenges and Novel Therapeutic Perspectives", Antibiotics (Basel), 10(2) Lade H., Park J H., Chung S H., Kim I H., Kim J M., Joo H S., Kim J S (2019), "Biofilm Formation by Staphylococcus aureus Clinical Isolates is Differentially Affected by Glucose and Sodium Chloride Supplemented Culture Media", J Clin Med, 8(11) Lakhundi S., Zhang K (2018), "Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Molecular Characterization, Evolution, and Epidemiology", Clin Microbiol Rev, 31(4) Lister J L., Horswill A R (2014), "Staphylococcus aureus biofilms: recent developments in biofilm dispersal", Front Cell Infect Microbiol, 4, pp 178 Liu Y., Zhang J., Ji Y (2020), "Environmental factors modulate biofilm formation by Staphylococcus aureus", Sci Prog, 103(1), pp 36850419898659 López D., Vlamakis H., Kolter R (2010), "Biofilms", Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(7), pp a000398 Lowy F D (1998), "Staphylococcus aureus infections", N Engl J Med, 339(8), pp 520-32 Macia M D., Rojo-Molinero E., Oliver A (2014), "Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria", Clin Microbiol Infect, 20(10), pp 981-90 Mariscal A., Lopez-Gigosos R M., Carnero-Varo M., Fernandez-Crehuet J (2009), "Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm", Appl Microbiol Biotechnol, 82(4), pp 773-83 26 Moormeier D E., Bayles K W (2017), "Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism", Mol Microbiol, 104(3), pp 365-376 27 28 Myles I A., Datta S K (2012), "Staphylococcus aureus: an introduction", Semin Immunopathol, 34(2), pp 181-4 Oliveira D., Borges A., Simões M (2018), "Staphylococcus aureus Toxins and 29 Their Molecular Activity in Infectious Diseases", Toxins (Basel), 10(6) Oliveira W F., Silva P M S., Silva R C S., Silva G M M., Machado G., Coelho Lcbb, Correia M T S (2018), "Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis infections on implants", J Hosp Infect, 98(2), pp 111-117 30 Otto M (2018), "Staphylococcal Biofilms", Microbiol Spectr, 6(4) 31 Peeters E., Nelis H J., Coenye T (2008), "Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates", J Microbiol 32 33 34 35 36 37 Methods, 72(2), pp 157-65 Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Cornu O., Van Bambeke F (2021), "In Vitro Study of the Synergistic Effect of an Enzyme Cocktail and Antibiotics against Biofilms in a Prosthetic Joint Infection Model", Antimicrob Agents Chemother Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Sakoulas G., Rodriguez-Villalobos H., Cornu O., Van Bambeke F (2020), "Synergistic Effects of Pulsed Lavage and Antimicrobial Therapy Against Staphylococcus aureus Biofilms in an in-vitro Model", Front Med (Lausanne), 7, pp 527 Sandberg M., Määttänen A., Peltonen J., Vuorela P M., Fallarero A (2008), "Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds", Int J Antimicrob Agents, 32(3), pp 233-40 Schilcher K., Horswill A R (2020), "Staphylococcal Biofilm Development: Structure, Regulation, and Treatment Strategies", Microbiol Mol Biol Rev, 84(3) Siala W., Kucharíková S., Braem A., Vleugels J., Tulkens P M., MingeotLeclercq M P., Van Dijck P., Van Bambeke F (2016), "The antifungal caspofungin increases fluoroquinolone activity against Staphylococcus aureus biofilms by inhibiting N-acetylglucosamine transferase", Nat Commun, 7, pp 13286 Song F., Koo H., Ren D (2015), "Effects of Material Properties on Bacterial Adhesion and Biofilm Formation", J Dent Res, 94(8), pp 1027-34 38 Thibeaux R., Kainiu M., Goarant C (2020), "Biofilm Formation and Quantification Using the 96-Microtiter Plate", Methods Mol Biol, 2134, pp 207214 39 Wang J., Nong X H., Zhang X Y., Xu X Y., Amin M., Qi S H (2017), "Screening of Anti-Biofilm Compounds from Marine-Derived Fungi and the Effects of Secalonic Acid D on Staphylococcus aureus Biofilm", J Microbiol Biotechnol, 27(6), pp 1078-1089 40 Wen Q H., Wang R., Zhao S Q., Chen B R., Zeng X A (2021), "Inhibition of Biofilm Formation of Foodborne Staphylococcus aureus by the Citrus Flavonoid Naringenin", Foods, 10(11) 41 Yin W., Wang Y., Liu L., He J (2019), "Biofilms: The Microbial "Protective Clothing" in Extreme Environments", Int J Mol Sci, 20(14) 42 https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus PHỤ LỤC Quyết định phê duyệt đề tài Khoa học Công nghệ cấp Trường PHỤ LỤC Bài báo tạp chí Hóa học & ứng dụng ... DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH THU 1701554 NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM CỦA Staphylococcus aureus TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BIOFILM CỦA MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU LỜI CẢM ƠN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... đánh giá khả kháng biofilm số cao dược liệu? ?? với 03 mục tiêu sau: Khảo sát số môi trường phù hợp để nuôi cấy biofilm S aureus Khảo sát thời gian điều kiện nuôi cấy biofilm S aureus Đánh giá khả kháng. .. nuôi biofilm thay mới, biofilm sử dụng để đánh giá hoạt lực kháng biofilm 3.3 Đánh giá tác dụng kháng biofilm số hoạt chất 3.3.1 Sàng lọc hoạt tính kháng biofilm số dược liệu Việt Nam Nghiên cứu