NGHIÊN cứu TỔNG hợp NANO CHITOSAN BẰNG sử DỤNG AXIT METHACRYLIC và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG nấm COLLETOTRICHUM MUSAE PHÂN lập từ QUẢ CHUỐI

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ số 53 (4B) (2015) 8-14 NGHIÊN C U T NG H P NANO CHITOSAN B NG S D NG AXIT METHACRYLIC VÀ ĐÁNH GIÁ KH NĂNG KHÁNG N M COLLETOTRICHUM MUSAE PHÂN L P T QU CHU I Nguy n Thị Minh Nguy t1, *, Nguy n Thị T Quyên2, Trần Thị Mai1, Nguy n Duy Lâm1 Viện Cơ điện nông nghiệp Cơng nghệ sau thu hoạch, 60 Trung Kính, Trung Hịa, Cầu Giấy, Hà Nội Khoa Cơng nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội * Email: minhnguyet.viaep@gmail.com Đến Tòa soạn: 15/09/2015, Chấp nhận đăng: 5/11/2015 TĨM T T Mục đích c a nghiên c u nhằm hồn thiện quy trình tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá hoạt tính kháng nấm Các hạt nano chitosan xác định kích thước, điện zeta, quang phổ hồng ngoại (FT-IR) phổ TEM Kết nghiên c u cho thấy kích thước hạt khối lượng sản phẩm tạo phụ thuộc nhiều vào nồng độ chất xúc tác tạo phản ng K2S2O8 Khi tăng lượng K2S2O8 bổ sung quy trình tổng hợp đến lượng định tạo nano chitosan có kích thước đồng làm tăng tỉ lệ thu hồi, tiếp tục tăng lượng chất xúc tác làm tăng kích thước c a hạt, đồng th i làm giảm độ phân tán c a nano chitosan Nano chitosan tổng hợp có kích thước 63 nm, có dạng hình cầu đồng nhất, phân bố đồng Thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng nấm c a nano chitosan tiến hành để xác định nồng độ c chế tối thiểu (MIC) Kết cho thấy bào tử nấm Colletotrichum musae phân lập từ chuối tiêu bị c chế hoàn toàn nồng độ nano chitosan % Từ khóa: Colletotrichum musae, chuối, MIC, nano chitosan, tổng hợp Đ T V N Đ Trong số loại vật liệu nano có nguồn gốc sinh học, loại polysachrit nano chitosan quan tâm nghiên c u nhiều nh chúng có tính chất bật so với chitosan thư ng Một số tính chất đặc trưng c a nano chitosan khẳng định khả tan nước, tính kháng vi sinh vật cao hơn, khả tạo màng, tính kết dính sinh học, tính thâm nhập, khả gia cư ng phối chế vật liệu khác [1, 2] Chitosan nguyên dạng tính chất c a cation polymer nên tương tác với phân tử tích điện âm polyme Tuy nhiên, tính chất định ch yếu b i kích thước c a hạt nano [2] Trong sản xuất bao bì thực phẩm, bổ sung nano chitosan có kích thước hạt phù hợp cho phép thay đổi tính thấm nước c a màng Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Tố Quyên, Trần Thị Mai, Nguyễn Duy Lâm bao gói đáng kể [1] Cho đến nay, quy trình tổng hợp nano chitosan phổ biến sử dụng tripolyphosphate (TTP) [2, 3] Tuy nhiên, với quy trình khó thu hạt nano có kích thước 100 nm, thư ng dao động khoảng 175 - 600 nm hiệu suất thu hồi thấp [3] Để kiểm soát hạt nano chitosan có kích thước  100 nm, việc tổng hợp thông qua phản ng trùng hợp với axit metacrylic (MAA) đánh giá có nhiều ưu điểm [3,4] Cho đến nay, việc sử dụng chất khơi mào phản ng nhằm tạo khả đạt kích thước hạt nano nhỏ có tỉ lệ thu hồi cao trì khả kháng vi sinh vật hiệu chưa nghiên c u đầy đ Mục đích c a nghiên c u nhằm tổng hợp nano chitosan sử dụng axit metacrylic tác động c a số điều kiện chất xúc tác tạo phản ng K2S2O8 đến kích thước hạt nano, hiệu thu hồi sản phẩm đánh giá khả kháng nấm gây bệnh thán thư chuối c a hạt nano CS-PMAA tổng hợp V T LI U VÀ PH ƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u t ng h p nano chitosan Chitosan (CS) có trọng lượng phân tử 70 kDa, độ đề axetyl hóa 90 % mua từ công ty TNHH MTV Chitosan Việt Nam Kali persulfate (K2S2O8) (Trung Quốc) axit methacrylic (MAA) (Merk, Đ c) Môi trư ng PDA (Potato Dextrose Agar, Thái Lan) Nano CS-PMAA thu cách trùng hợp MAA dung dịch CS, theo CS phân tán dung dịch axit MAA nồng độ 0,5 % 12 gi với khuấy từ Nồng độ CS sử dụng tổng hợp 0,8 % Sử dụng K2S2O8 nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 0,8 mmol bổ sung vào dung dịch CS-MAA 70 ◦C gi Khi hình thành nano CS-PMAA, hỗn hợp làm lạnh nước đá Để thu hồi nano chitosan tiến hành ly tâm 30 phút 4000 rpm Hòa tan lại nano chitosan nước cất hai lần [3] 2.2 Xác định đ c tính Xác định phổ FT-IR c a CS nano CS-PMAA máy quang phổ Perkin-Elmer (model Paragon 1000) khoảng bước sóng 4000 đến 400 cm-1 Các hạt nano CS-PMAA đông khô nitơ lỏng đơng khơ Đo kích thước hạt điện zeta thiết bị Malvern Xác định TEM kính hiển vi điện tử truyền qua Philips CM200 2.3 Ho t tính kháng n m C musae đ c phân l p t qu chu i Nấm C musae phân lập từ mẫu chuối bị nhiễm bệnh thán thư Việc phân lập, quan sát xác định nấm thực b i Viện 69 (Bộ Tư lệnh Lăng) Hoạt tính kháng nấm c a NCS-PMAA đánh giá dựa theo phương pháp c a Guo cs., (2007) [5] Nồng độ NCSPMAA bổ sung vào môi trư ng PDA trùng tương ng 0,5; 0,75; 0,1; 1,25 1,5 % Dịch nấm C.musae đặt vào đĩa nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 30 oC Th i gian cách hai lần đo kích thước vòng phát triển c a nấm 24 gi Các thí nghiệm đánh giá nấm phát triển đến mép c a đĩa Chỉ số kháng nấm (AI) tính dựa phương trình AI (%) = (1- D1/D2) x 100, D1 kích thước c a khuẩn lạc đĩa thí nghiệm, D2 kích thước c a khuẩn lạc đĩa đối ch ng [5] Kết thu trung bình cộng c a mẫu lặp lại Nghiên cứu tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá khả K T QU VÀ TH O LU N 3.1 T ng h p h t nano CS-PMAA Các phân tử CS dung dịch dạng cation poly điện ly có xu hướng giảm bớt hình thành cấu trúc nh tương tác tĩnh điện với MAA dẫn đến hình thành c a CS-PMAA hạt nano thông qua phản ng trùng hợp c a MAA có mặt c a CS Khi phản ng trùng hợp MAA diễn ra, xuất liên kết nội phân tử ngoại phân tử nhóm ch c carboxyl PMAA nhóm amin tích điện dương CS, hình thành nên hạt nano CS-PMAA Kết thu phù hợp với kết nghiên c u tạo hạt nano CS-PMAA c a Moura [3] Bên cạnh xảy liên kết khác góp phần tạo ổn định cấu trúc CS PMAA, ví dụ liên kết kỵ nước nhóm methyl c a PMAA [6] Hình trình bày hình ảnh cấu trúc c a hạt nano CS-PMAA thu Ph c tỉ lệ phân tử (trong đơn vị monomer) c a nCOOH / nNH2 1,2:1 (0,8 % khối lượng) [3] Bảng Tỉ lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA thay đổi nồng độ chất khơi mào phản ng Hình Sơ đồ hình thành hạt nano CS-PMAA STT K2S2O8 (mmol) Tỉ lệ thu hồi (%) 0,2 12,45 0,4 34,00 0,6 42,53 0,8 57,20 Bảng thể tỉ lệ thu hồi nano CS-PMAA thay đổi nồng độ chất khơi mào phản ng phản ng trùng hợp K2S2O8 có vai trò ảnh hư ng lớn đến hiệu suất thu hồi sản phẩm kích thước hạt CS-PMAA, nồng độ 0,2 mmol K2S2O8, tỉ lệ sản phẩm thu hồi thấp (12,45 %), tăng nồng độ K2S2O8 lên giá trị 0,4 0,6 mmol K2S2O8 làm tăng đáng kể tỉ lệ thu hồi sản phẩm lên tương ng 34 % 42,53 %, kích thước khơng thay đổi giá trị 60 nm Khi tăng nồng độ K2S2O8 lên nồng độ 0,8 mmol tỉ lệ thu hồi tăng lên 44,45 % kích thước hạt đo có giá trị 140,8 nm Điều việc điều chỉnh nồng độ K2S2O8 làm tăng tỉ lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA mà không làm tăng kích thước Tuy nhiên tiếp tục tăng tỉ lệ bổ sung chất khơi mào lên giới hạn 0,8 mmol làm tăng kích thước c a hạt nano CS-PMAA Kết nghiên c u giúp việc sản xuất CS-PMAA thu hồi tỉ lệ sản phẩm 42,53 % cao so với kết nghiên c u công bố c a Moura (2008) 30,08 % [3] 3.2 Phân tích c u trúc hóa học c a h t nano b ng ph h ng ngo i FT-IR Hình trình bày phổ hồng ngoại c a CS CS-PMAA chuẩn bị nồng độ chất khơi mào phản ng khác Trên phổ hồng ngoại, mối liên kết CS PMAA làm sáng tỏ Theo nghiên c u công bố, phổ CS đưa đặc điểm pick 3456 cm−1 có nghĩa liên kết c a nhóm NH2 nhóm OH, pick 1654 liên kết c a nhóm C=O c a amid I, pick 1081-1020 dao động c a liên kết C-O, pick 619 liên kết mạch vịng [2] Trên Hình biểu diễn phổ hồng ngoại c a CS-PMAA dễ dàng quan sát thấy vắng Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Tố Quyên, Trần Thị Mai, Nguyễn Duy Lâm mặt c a pick c a nhóm 1657, thay vào hai pick 1635 1518 tương ng với nhóm COOvà nhóm NH3+, điều thể tương tác ion PMAA CS hình thành hạt nano CS-PMAA Pick 1748 1237 cm2 (C=O) ch ng minh có mặt c a PMAA thành phần c a hạt nano CS-PMAA Khi nồng độ sinh tổng hợp c a CS-PMAA tăng lên dẫn đến cấu trúc hóa học c a CS-PMAA thay đổi với việc giảm băng băng tần 1748 1237 cm2 đồng th i tăng băng tần 1635 1518, có nghĩa nồng độ PMAA giảm xuống tương tác ion CS PMAA tăng lên Hình Phổ hồng ngoại c a CS-PMAA tạo nồng độ K2S2O8 0,6 mmol Hình Phổ hồng ngoại c a CS-PMAA tạo nồng độ K2S2O8 0,8 mmol Tại Hình 3, bổ sung 0,8 mmol K2S2O8 vào phản ng trùng hợp, phổ hồng ngoại c a CSPMAA vắng mặt băng tần 1748 1237, điều ch ng tỏ tăng nồng độ chất khơi mào phản ng vượt ngưỡng khiến toàn CS đưa vào tổng hợp thành CS-PMAA thiếu PMAA, lý cho kích thước hạt CS-PMAA nồng độ cao nồng độ từ 0,2 mmol ÷0,6 mmol (140 nm) [3] 3.3 Kích th ớc c a h t nano th zeta thu đ c Kết Bảng ch ng minh rõ nét Bảng Tính chất hạt NS-PMAA nồng độ việc tăng nồng độ chất khơi mào vượt K2S2O8 khác ngưỡng giới hạn làm tăng kích thước hạt đồng th i làm tăng zeta Kích Nồng độ K2S2O8 Kích thước hạt Thế zeta thước hạt khơng khác nồng độ (mmol) (nm) (mV) K2S2O8 dao động từ 0,2 ÷0,4 mmol (60nm) 0,2 60 ± 42,4 ± Tuy nhiên, tăng nồng độ K2S2O8 lên đến 0,4 60 ± 42,4 ± 0,8mmol kích thước hạt tăng đáng kể m c 140nm Thế zeta nồng độ 0,2; 0,6 60 ± 42,4± 0,4; 0,6 0,8 mmol thu tương ng 0,8 140 ± 47,5± 42,4 mV; 42,4 mV; 40,4 mV; 47,5 mV Thế zeta lớn hệ keo tụ bền, khó kết t a đây, hạt CS-PMAA thu điện tích dương lớn ( 42 mV), hạt CS-PMAA bền vững dung dịch không tạo t a th i gian bảo quản Qua kết thấy, nồng độ K2S2O8 0,6 mmol không làm tăng tỉ lệ thu hồi lên 30,08 % mà cịn trì kích thước zeta c a hạt CS-PMAA Nghiên cứu tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá khả 3.4 Phân b h t kính n t truy n quang (TEM) Hình thể phân bố kích thước đo c a hạt CS-PMAA Việc đo TEM thực mẫu hạt nano làm khô từ hạt dung dịch đồng ban đầu, hạt nano chitosan tạo thành với nồng độ chất khơi mào phản ng 0,6 mmol Tất phân tích cho thấy kích thước phân bố hạt nano CS-PMAA thu đồng thể Hình K2S2O8 0,6 mmol K2S2O80,2 mmol K2S2O80,8 mmol Hình Hình ảnh CS-PMAA kính hiển vi điện tử nồng độ khác 3.5 Ho t tính kháng n m C musae đ tr ờng ni c y PDA c phân l p t qu chu i c a NCS-PMAA môi Bảng Chỉ số kháng nấm C musae gây bệnh thán thư chuối c a nano CS-PMAA môi trư ng thạch STT Nồng độ CS-PMAA (%) Vòng phát triển (mm) Chỉ số AI (%) 0,00 87,0 - 0,50 55,2 36,5 0,75 29,7 65,9 1,00 0,00 100,0 1,25 0,00 100,0 Ghi chú: : nấm phát triển mạnh mẽ Đối ch ng % CS-PMAA Công th c 0,5 % CS-PMAA Công th c 0,75 % CS-PMAA Công th c 1,0 % CS-PMAA Công th c 1,25 % CS-PMAA Hình Hoạt tính kháng nấm C musae phân lập từ chuối c a NCS-PMAA môi trư ng nuôi cấy PDA Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Tố Quyên, Trần Thị Mai, Nguyễn Duy Lâm Kết Bảng 3, Hình trình bày số AI (%) cho công th c th i điểm cuối c a thí nghiệm (7 ngày) cho thấy tăng nồng nano CS-PMAA môi trư ng đĩa thạch 0,0 %; 0,5 %; 0,75 %; % 1,25 % có vịng phát triển c a nấm giảm dần tương ng 87 mm (AI = %); 55,2 mm (AI = 36,5 %); 29,7 mm (65,9 %); mm (100 %) mm (100 %) Như nồng độ nano CS-PMAA 1% c chế hoàn toàn phát triển c a nấm C musae gây bệnh thán thư chuối K T LU N Đã hồn thiện quy trình tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá hoạt tính kháng nấm Việc bổ sung nồng độ K2S2O8 từ 0,2 mmol lên 0,6 mmol làm tăng tỉ lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA từ 12,45 % lên 42,53 % Các kết cấu trúc hóa học, kích thước hạt zeta xác định Kết hạt nano thu ổn định Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thán thư c a chuối C musae c a NS-PMAA đạt 100 % bổ sung % nồng độ NS-PMAA điều kiện môi trư ng thạch PDA TÀI LI U THAM KH O Nguyễn Duy Lâm - ng dụng công nghệ nano chế biến, vật liệu bao bì quản lý chất lượng thực phẩm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 52 (5C) (2014) 406-413 Weiss J., Takhistov P., McClements J nanotechnology, J Food Science 71 (2006) 107-116 Moura M.R., Aouada F A., Mattoso L.H.C - Preparation of chitosan nanoparticles using methacrylic acid, J Colloid Interface Sci 321 (2) (2008) 477-483 Janes K A., Alonso M J - Depolymerized chitosan nanoparticles for protein delivery: Preparation and characterization, J Appl Polym Sci 88 (2003) 2769-2776 Guo Z., Xing R., Liu S., Zhong Z., Ji X., Wang L., Li P - The influence of the cationic of quaternized chitosan on antifungal activity, Int J Food Microbiol 118 (2007) 214–217 de Vasconcelos C L., Bezerril P M., dos Santos D E S., Dantas T N C., Pereira M R., Fonseca J L C - Effect of molecular weight and ionic strength on the formation of polyelectrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan, Biomacromolecules (2006) 1245-1252 Functional materials in food ABSTRACT SYNTHESIS OF NANO CHITOSAN BY USING METHACRYLIC AXIT AND EVALUATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST COLLETOTRICHUM MUSAE ASSOCIATED WITH BANANA ANTHRACNOSE Nguyen Thi Minh Nguyet1,*, Nguyen Thi To Quyen2, Tran Thi Mai1, Nguyen Duy Lam1 Vietnam Institute of Agricultural Engineering and Postharvet Technology, 60 Trung Kinh, Trung Hoa, Cau Giay, Hanoi Hanoi Open University, 301 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi Nghiên cứu tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá khả * Email: minhnguyet.viaep@gmail.com Purpose of this work is to improve the preparation of chitosan nanoparticles by using methacrylic acid and to evaluate their antifungal activity Chitosan nanoparticles were characterized by particle size analyzis, zeta-potential, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and transmission electron microscopy (TEM) Results showed the particle size and recovery rate were dependent on the K2S2O8 concentration used as catalyst Recovery rate increased when K2S2O8 concentration from 0.2 mmol to 0.6 mmol with nanoparticles sizes as small as 63 nm were achieved, that can be extremely important for several applications The nanoparticles obtained presented a very homogeneous morphology showing a quite uniform particles size distribution and a rather spherical shape Antifungal activity was evaluated against C musae by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) in vitro Results showed that the antifungal activity reached almost 100 % at concentration of nano CS-PMAA that is % (w/w) Keywords: banana, Colletotrichum musae, CS-PMAA, nanochitosan, synthesis  ... trung bình cộng c a mẫu lặp lại Nghiên cứu tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá khả K T QU VÀ TH O LU N 3.1 T ng h p h t nano CS-PMAA Các phân tử CS dung dịch dạng cation... độ nano CS-PMAA 1% c chế hoàn toàn phát triển c a nấm C musae gây bệnh thán thư chuối K T LU N Đã hồn thiện quy trình tổng hợp nano chitosan sử dụng axit methacrylic đánh giá hoạt tính kháng nấm. .. thước hạt nano, hiệu thu hồi sản phẩm đánh giá khả kháng nấm gây bệnh thán thư chuối c a hạt nano CS-PMAA tổng hợp V T LI U VÀ PH ƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u t ng h p nano chitosan Chitosan